KSHV Enfekte Hücrelerde Spesifik Gen Ürünlerinin Situ Hibridizasyonunda (FISH) ve İmmünfloresansında (IF) Kantitatif Floresan

Protokol, özellikle herpes virüsleri ile ilgili olarak, konak hücreleri bağlamında, viral gen ürünlerinin zamansal düzenleme içine nicel anlayış kazanmak için yararlıdır. Bu teknik, hem ev sahibi hem de viral RNA'lar ve proteinler ile ilgili araştırma sorularının ele alınmasına yardımcı olabilir. Ayrıca, bu teknik eşzamanlı biyokimyasal tahliller ile uyumludur.

Hücreleri sekiz oda slayta yapıştırmak için, steril, sekiz odalı slaytHer odasına doğal bir hücre süspansiyon 200 mikrolitre uygulamak ve 12-24 saat için tohum büyüme izin, 37 derece santigrat, ve% 5 karbondioksit. Kuluçka sonunda, supernatant ve bekar hücreleri aspire, ve hemen önceden soğutulmuş ile hücreleri düzeltmek 4% formaldehit pbs buz üzerinde, için 30 dakika. Fiksasyon sonunda, yıkama başına 4 derece Santigrat PBS 200 mikrolitre üç, beş dakika yıkar hücreleri yıkayın.

Son yıkamadan sonra, buz üzerinde 10 dakika boyunca, iyi başına PBS önceden soğutulmuş% 0.5 Triton-X 200 mikrolitre ile sabit hücreleri geçirin. Permeabilizasyon sonunda, dikkatlice slayt çatlama olmadan odaları çıkarın ve önceden soğutulmuş PBS ile hücreleri durulayın. PBS'de önceden soğutulmuş 4%BSA ile durulanmış hücreleri 4 santigrat derecede 30 dakika boyunca bloke edin, ardından pbs'te %0.1 BSA'da uygun poliklonal primer antikorile bir saat, dört santigrat derecede kuluçkaya yat.

Kuluçka sonunda, hücreleri taze PBS ile üç kez yıkayın ve hücreleri, FISH'in bir saat boyunca antikor tespitiyle uyumlu, dört derece santigrat derecede uygun bir ikincil antikorla kuluçkaya yatırın. Gösterildiği gibi üç PBS yıkama dan sonra, ikinci permeablizasyondan önce PBS'de %4 formaldehit ile tekrar 10-15 dakika boyunca numuneleri düzeltin. Daha sonra floresan sinyali korumak ve fotobeyazlama önlemek için alüminyum folyo ile slayt kapağı.

Ve melezleştirme çözeltisi 45 mikrolitre uygulamadan önce, 2x tuzlu sodyum sitrat ile hücreleri yıkayın. Nemlendirilmiş bir odada 37 santigrat derece bir saat sonra, 10 mikrolitre denatürasyon hacmi getirmek için ilgi antisense oligonükleotidler distile su ekleyin. Slayt başına 35 mikrolitre taze hibridizasyon çözeltisi eklemeden önce, oligonükleotidleri 5 dakika boyunca 95 santigrat derecede denatüre edin.

Daha sonra 37 santigrat derece nemlendirilmiş odada 10-24 saat, folyo ile korunan örnekleri kuluçka. Ertesi gün hücreleri 2-10 dakika yıkayın. 2X tuzlu sodyum sitrat oda sıcaklığında yıkar, 1X tuzlu sodyum sitrat bir yıkama takip 10 dakika, 25 santigrat derece.

Son yıkamadan sonra, pbs önceden soğutulmuş% 4 formaldehit ile hücreleri düzeltmek, buz üzerinde 10-15 dakika, taze PBS ile üç yıkar takip. Daha sonra, gösterildiği gibi örnekleri permeabilize, anti-dioksigenin FTC ve pbs önceden soğutulmuş% 0.1 BSA ile kuluçka takip, dört santigrat derece bir saat için. Kuluçka sonunda, taze PBX üç kez slaytlar yıkayın ve pbs önceden soğutulmuş% 4 paraformaldehit ile örnekleri düzeltmek, dört santigrat derece 10-15 dakika.

PBS'de üç yıkamadan sonra çekirdekleri mililitre başına 0,4 mikrogram ve PBS'de %0,5 önceden soğutulmuş Triton-X ile 15 dakika buzüzerinde etiketleyin ve ardından PBS'de üç son yıkama yıkın. Floresan boncuklar ile Montaj slaytlar, deneysel olarak alakalı ve uygun montaj orta. Steril mendillerle fazla montaj ortamını çıkardıktan sonra, her slayta birden fazla kat açık oje ile bir kapak fişi kapatın ve deneyin başarılı bir şekilde gerçekleştirilini onaylamak için floresan mikroskop kullanın.

Görüntüler daha sonra 630 kez büyütme, montaj bir saat ila bir hafta içinde örneklerin görüntüleri toplamak için bir konfokal mikroskop üzerinde alınabilir. Bu temsili FISH ve immünofloresan sonuçları yarı kantitatiftir ve farklı floresan lekelerinin yoğunlukları arasındaki karşılaştırmalar yerine oligonükleotid lokalizasyonu hakkında fikir verir, çünkü bu deneyler slayt hazırlığında floresan boncuk içermemelidir. Bu deneylerde sitoplazmik ve nükleer alanlar ile bunların oranları latent ve litik KSHV enfekte hücreler için farklıydı.

Bu şekilde gösterildiği gibi alan nükleositoplazmik oranda kontrol edilir. KSHV DNA replikasyonu litik fazda inhibe edildiğinde, KSHV oligonükleotid transkriptinin erken litik proteini ağırlıklı olarak sitoplazmik lokalizasyona geçer. KSHV poliainkargecikmiş RNA, ancak, viral DNA replikasyonuin inhibisyonu rağmen belirli nükleer sitelere lokalize.

Slaytlardan odaları çıkarırken, aletüzerinde çok az yapışkan kalıntı sıyrık olduğuna dikkat edin ve hücreleri permeablize etmek ve yapıştırıcıyı zayıflatmak için etanol kullanın. QPCR, Western blot ve yüksek iş elde li dizileme gibi biyokimyasal denemeler, mikrograflardan toplanan nicel verileri artırmak için birlikte yapılabilir.