Bölgeye Özgü İnflamatuar mRNA ve Proteini Tespit Etmek İçin Sıçan Epidermis ve Dermis'in Termolysin ile Ayrılması

Protokolümüz, cilt iltihabı sırasında enflamatuar mediatörlerin ve nörotrofinlerin bölgeye özgü üretimini belirlemek için kullanımı kolay ve ucuz bir epidermal-dermal ayırma tekniğidir. Bu tekniğin ana avantajı, epidermisin dermisten enzimatik olarak ayrılmasının dört santigrat derecede yapılması ve mRNA ve protein bütünlüğünün korunmasıdır. Bu yöntem, yeni terapötik müdahalelerin geliştirilmesi için akut ve kronik inflamasyon sırasında birincil afferent terminalleri hassaslaştıran mediatör türleri hakkında fikir sağlar.

Yara iyileşmesi, cilt hastalığı, kronik yaralar ve yanıklar bu araştırmadan yararlanabilir. Ve bu yöntem GI yolu ve kornea gibi diğer epitel yüzeylere uygulanabilir. En uygun ayırma süresi laboratuvarlar arasında biraz farklılık gösterebilir.

Ayırmanın kalitesini belirlemek için 2D morfoloji değerlendirmesi ile birlikte farklı zaman noktalarını karşılaştıran bir ön deney önerilir. Uyuşturulmuş sekiz ila dokuz haftalık Sprague Dawley sıçanında pedal refleksine yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, sağ glabrous arka pençesini PBS'de seyreltilmiş 100 mikrolitre 1X Lambda karragenan ile deri altından enjekte edin. Uyarana yanıt olarak ödem hacmini belirlemek için enjeksiyondan hemen önce ve 6 ve 12 saat sonra arka pençe metatarsal kalınlığını ölçmek için kaliperler kullanın.

Uygun deneysel uç noktada, enjekte edilen pençeden bir ila iki milimetrelik bir glabrous arka pençe derisi parçası toplamak için keskin bir neşter kullanın ve cildi 15 ila 60 dakika boyunca buz üzerindeki bir mikrosantrifüj tüpünde bir mililitre soğuk DMEM'e aktarmak için mikroseksiyon forseps kullanın. Doku inkübe olurken, buz üzerinde 24 kuyulu bir hücre kültür plakasının 10 kuyusuna bir mililitre taze hazırlanmış aktif termolysin ekleyin. Kuluçkanın sonunda, mikrodiseksiyon forsepsini kullanarak her bir aktif termolysin kuyusuna bir deri örneği aktarın, stratum korneum, numuneleri çözeltiye batırmadan yukarı doğru.

Cildin termolysin içine daldırılması ve stratum korneumun etkili bir ayrım elde etmek için karşı karşıya olması önemlidir. İki ila üç saat sonra, epidermisin dermisten ayrılması için daha fazla yer sağlamak için bir petri kabına yedi ila sekiz mililitre dört santigrat derece DMEM'de bir cilt örneği daldırmak için mikrodiseksiyon forsepsini kullanın. Numunenin sınırlarında yarı saydam epidermisin yakını gözleninceye kadar epidermisi cildin çevresi etrafında hafifçe fırçalamak için epans kullanın.

Epidermisin dermikten belirgin bir şekilde ayrılmasıyla, cildin her tabakasını tek bir çift önseziyle dikkatlice kavrayın ve epidermisi dermisin yavaşça çekin, ardından izole epidermisin yarı saydamlıklarını optik olarak tutarlı olduğundan emin olmak için ışık mikroskopisi ile değerlendirin. Katmanlar düzgün bir şekilde ayrılmışsa, epidermal ve dermal dokuları DMEM'deki beş milimoler EDTA'nın tek tek kaplarına 30 dakika boyunca dört santigrat derecede yerleştirin. Termolysin devre dışı kaldıktan sonra, epidermisin bir kısmını ajitasyon ile oda sıcaklığında bir saat boyunca uygun bir fiksatifte sabitlayın.

Kuluçkanın sonunda, numuneyi bölümleme için uygun bir doku gömme matrisine dondurmadan önce, sabit dokuyu Ajitasyon ile oda sıcaklığında bir saat boyunca PBS'de% 10 sakkaroz içine yerleştirin. 14 mikrometre kalınlığında kesit elde etmek için bir kriyostat kullanın ve bölümleri jelatin kaplı cam mikroskop slaytlarına monte edin. Bir slayt ısıtıcı üzerinde kuruduktan sonra, örnekleri 90 saniye boyunca toluidin mavisi bir çalışma çözeltisi ile lekeleyin.

Daha sonra, PBS ile slaytlardan toluidin mavisini hafifçe yıkayın ve sulu bir montaj ortamı ile kapaklara karşı çıkın, ardından 50 ila 250X büyütmede Brightfield mikroskopisi ile epidermisi gözlemleyin. Sıçan arka pençesine karragenan enjeksiyon, enjeksiyon sonrası hem 6 hem de 12 saat kızarıklık ve ödem gibi klasik iltihap belirtilerine neden olur. Brightfield mikroskopisi, sıçan glabrous arka pençe derisinin epidermisinin ve dermisinin termolisin ayrılmasının etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilir.

Nitekim epidermal kesitlerin toluidin mavisi lekesi epidermisin taban çizgisi zarındaki dermisten ayrıldığını, ancak epidermal Rete sırtlarının ve dermal papilladan gelen girintilerin bozulmadan kaldığını göstermektedir. Ayrıca, tüm keratinosit hücre katmanları gözlenir. Termolysin ayrılmış epidermisin batı şişkinliği, teknik sırasında dört santigrat derecede kararlı protein seviyelerini gösteren tutarlı sonuçlar üretir.

Naif sıçan epidermisinde çok az NGF proteini sapınır, ancak NGF protein seviyeleri altı saatlik karragenan kaynaklı iltihaplanmadan sonra önemli ölçüde yukarı yönlüdür. Enjeksiyondan 12 saat sonra, NGF seviyeleri altı saatte gözlenenlere kıyasla azalır, ancak kontrollere göre yüksek kalır. Batı blot analizinden beklendiği gibi, NGF immünoreaktivite naif kontrol epidermis doku örneklerinde saptanmaz, ancak karragenan kaynaklı inflamasyon sonrası altı saatte, stratum granülozum ve stratum lucidum keratinositlerinin çoğunda NGF immünoreaktivitesi görülür.

Stratum spinosumdaki birkaç hücre de NGF immünoreaktiftir. Bozulmamış epidermisi izole etmek için termolisin kullanırken, en uygun ayırma süresinin son kullanıcı tarafından ampirik olarak belirlenmesi gerektiğini hatırlamak önemlidir. Bu prosedürün bazal ifadeyi değiştirmediğini doğrulamak için belirli proteinlerin ve/veya birincil gen transkriptlerinin ekspresyonunun doğrulanabilir.

Bu epidermal-dermal ayırma tekniği, araştırmacıların farklı kesitli enflamatuar modellerde nörotrofinlerin ve enflamatuar mediatörlerin bölgeye özgü ekspresyleriyle ilgili ek soruları yanıtlamalarını sağlayacaktır. Pikrik asit ve paraformaldehit tehlikelidir. Duman kaputunda her iki kimyasalla da çalışın, kişisel koruyucu giysiler ve eldivenler kullanın ve elleçlemeden sonra yüzünüzü ve ellerinizi yıkayın.