Name: Prostat kanseri genetiği Işlenmiş fare modelleri tümör Organoids üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Keşfedin fare prostat kanser modeli nekropsi ve diseksiyon yöntemini. Tümör organoidleri üretme protokolü ile kanser biyolojisini in vivo benzeri 3D kültürlerde çalışın ve yeni tedaviler geliştirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Stanford Üniversitesi 'ndeki Calvin Kuo Laboratuvarı 'na, HA-Mouse noggin-FC ya da HA-Mouse Rspo1-FC ile HEK293 hücrelerin stabil bir şekilde transfükresini sağlamak için teşekkür etmek istiyor. Ayrıca Dr. Dean Tang 'a laboratuvarında floresan Diseksiyon mikroskobu erişmemize izin verdiği için teşekkür etmek istiyoruz. Bu iş Ulusal Kanser Enstitüsü CA179907 tarafından D.W.G. tarafından destekleniyordu. Roswell Park kapsamlı Kanser Merkezi 'nde paylaşılan kaynaklar sağlık kanser merkezi destek Grant CA016056 Ulusal Enstitüleri tarafından desteklenmektedir.

Burada açıklanan hayvan prosedürleri, laboratuvar hayvansal kaynaklar bölümü 'nde kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi 'nin (ıABUC) onayı ile, Roswell Park kapsamlı Kanser Merkezi, Buffalo, New York 'ta yapıldı.
Not: Organoidlerin nesil için Ayrıca birlikte prostat veya prostat tümörlerinin yalıtmak için disseke erkek fareler en az cinsel olgunluk yaşına ulaşmalıdır-yaklaşık 8-10 hafta yaş. Belirli yaş fareleri çalışmalar arasında farklılık gösterebilir. Yaş seçerken göz önünde bulundurulması gereken bazı faktörler arasında, prostat hücresi popülasyonlarında yaşa bağlı değişiklikler, belirli Promoter odaklı CRE transgenlerin yaşa bağımlı ifadesi ve belirli bir GEMM 'de prostat tümörü ilerlemesi bulunmaktadır.
1. fare ProstateTumor ve metastatik tümörler diseksiyon ve görüntüleme
<ol><li>Hazırlık
	<ol>
<li>Gerekli steril diseksiyon araçlarını edinin. 15 cm Cetvelli, hassas denge, analitik denge,% 70 etanol ile sprey şişesi, phospho-tamponlu tuzlu (PBS) ve kağıt havlular ile temiz steril yüzeyde sahne diseksiyon alanı.</li>
		<li>
Nevuslardır nesil için kullanılmamalıdır visseral organlar ve kemikler için fikreatif çözümlerin hazırlanması
		<ol>
<li>Viseral organlar için: PBS 'de% 4 civarında formaldehite (PFA) hazırlayın. Bir fare için,% 4 PFA 20 ml, 2 15 ml konik borular içine kısım yapmak ve kullanım kadar oda sıcaklığında tutun.</li>
			<li>Uzun kemikler için: aliquot 10 mL önceden yapılmış 10% nötr tampon formalin (NBF) 1 15 mL konik tüp ve kullanım kadar oda sıcaklığında tutun.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Tedavi edilmeyen 10 cm 'lik yemekleri elde et ve steril olmayan PBS ile doldur-Bunlar, Diseksiyon mikroskobu kullanarak ince diseksiyon sırasında organlar için geçici konteynerler olarak hizmet edecektir. Not: Steril aletler organoidler oluşturmak için diseksiyon dokularda kullanılır. Steril olmayan aletler, arka ekstremite ilk kesi ve diseksiyon için kullanılır.</li>
	</ol></li>
	<li>Ötenazi ve ilk kesi
	<ol>
<li>5 dakika boyunca 2,0 L/dk akış hızını kullanarak Co2 boğulma tarafından fareyi ötenere. kafesten fareyi çıkarın ve servikal dislocation gerçekleştirin. Fare vücut ağırlığı ve kaydını ölçmek için hassas dengesini kullanın.</li>
		<li>Bir kağıt havlu üstüne fareyi yerleştirin ve fare kafası araştırmacı uzak bakan ile diseksiyon yüzeyi ventral tarafı yukarı yönlendirmek. Onun ekstremite dışarı uzanan ve bir tek kullanımlık iğne ile forepaws ve arka pençeleri her piercing tarafından tahta için fareyi Affix.</li>
		<li>Bir sprey şişesi kullanarak, 70% etanol ile fare kürk ikiye katlar. Non-Steril Diseksiyon makas ve düz forseps kullanarak, fare penisinin hemen üstünde çimdik ve sadece kürk yoluyla küçük bir kesi yapmak.</li>
		<li>Sadece kürk yoluyla fare boynuna kesi orta çizgi devam edin. Sadece kürk yoluyla fare ventral düzlemden ilk kesi noktasından bilateral kesikler olun.</li>
		<li>Kürkü kavrayın ve dikkatle farenin derisinden çekin. Hem karın hem de torasik boşlukların erişimine izin vermek için kürkü tahta kadar sabitleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Erkek ürogenital sistemin en bloktan çıkarılması
	<ol>
<li>Steril Diseksiyon makas ve düz forseps kullanarak, dikkatle rektum üzerinde 0,75 cm hakkında cilt üzerinden kesilmiş. Karın boşluğunda herhangi bir organ rahatsız etmeden göğüs kafesi kadar kesi orta çizgi devam edin. Dikkatle cilt uzağa çekin ve tüm karın boşluğu açığa çıkarmak için tahta pin. Not: Bu dokuların organoidler oluşturmak için kullanılacaktır gibi, bu enstrümanlar hazırlama alanında fare veya herhangi bir yüzey dışında dokunmak izin vermez.</li>
		<li>Şekil 1A'daki diyagrama göre ürogenital sistem ve diğer organları incelemek, sayılar ile organları fare kaldırılacak sırasını gösteren.</li>
		<li>Mesane bulmak, sonra ya sol veya sağ yağ Pad kavramak ve testis ortaya çıkarmak için yukarı çekin. Dikkatle ürogenital bölgenin geri kalanından testis uzaklaştırın ve bir kenara koyun. Diğer tarafta aynı prosedürü yapın. Not: En iyi doku kalitesini elde etmek ve prostat tümörlerinin ayrıntılı tümör karakterizasyonu, tüm ürogenital bölgenin fare en bloku19' dan kaldırılmasını gerektirir. Ürogenital bölgenin ilk olarak kaldırılması önerilir (Şekil 1A).</li>
		<li>Mesane kavramak ve dikkatle böylece ürogenital bölgenin birlikte kaldırma, altında üretra açığa çekin. Mesane tutarak, böylece dorsal prostat alt karşı ve üretra kesme makas yönlendirmek. Tüm ürogenital bölge daha sonra Karın boşluğundan serbest bırakılacak.</li>
		<li>Ürogenital bölgeyi PBS ile dolu 10 cm 'lik bir çanak içine koyun. Hala idrar ile dolu ise, küçük bir kesi yaparak mesane drenaj. Analitik denge kullanarak, ürogenital sistem ve kayıt tartmak.</li>
	</ol></li>
	<li>Pelvik lenf nodları, dalak, karaciğer, böbrek, akciğer, Tibia ve femur ekstraksiyonu
	<ol><li>Ürogenital Sistemin çıkarılması, Ürogenital Sistemin hemen arkasında konumlandırılmış Pelvik lenf nodları ortaya çıkarır (Şekil 1A) ve omurganın her iki tarafında. Lenf nodları sadece metastatik lezyonlar içeriyorsa veya lokal inflamasyon varsa görünür olacaktır. Lenf düğümünün altında düz forseps yönlendirmek ve lenf düğümü kaldırmak için yukarı çekin. Diğer tarafta aynı prosedürü yapın.</li>
		<li>Rektum ile düz forseps ve kesme tutun. Mezenterik lenf nodlarında metastatik lezyonlar arayan, tüm kolon ve ince bağırsak çözmek için rektum çekin. Tüm ileum kaldırıldığında, mide ortaya çıkarmak için duodenum üzerinde çekmeye devam edin. Tamamen mide kaldırmak ve atmak için özofagus kes. Lenf nodlarında metastatik lezyonlar gözlemlenirse, bağırsak ve depolardan 10 cm 'lik bir tabak içinde dikkatlice uzaklaştırın.</li>
		<li>Karnının açığa çıkması ve çıkarılması karının dorsal tarafındaki dalağı çekecektir (Şekil 1A). Dalağı çıkarın ve 4% PFA yerleştirin. Dalak, son derece hücresel olduğu için hemotoxylin için bir boyama kontrolü olarak hizmet vermektedir. Not: Nevuslardır nesil için kullanılmamalıdır visseral dokularda gece% 4 PFA, PBS ile yıkanmış ve daha sonra% 70 etanol yerleştirilir sabitlenir.</li>
		<li>Karın üst kesiminde karaciğeri çıkarın (Şekil 1A). Karaciğer metastatik yük dayanarak, bireysel loblar dissected olabilir, ya da tüm karaciğer dikkatle diyafram boyunca kesme tarafından kaldırılabilir. (Şu anda diyaframı kesmeyin). PBS 10 cm çanak karaciğer yerleştirin.</li>
		<li>Karaciğerin çıkarılması, omurganın her iki tarafındaki böbrekleri tamamen açığa çıkarır (Şekil 1A). Böbrekler-böbrek lenf nodları ile birlikte, düğümler metastatik lezyonlar varsa-böbrek altında düz forseps yerleştirerek ve yukarı çekerek. Diğer taraf için aynı prosedürü yapın.</li>
		<li>Torasik boşluğu açığa çıkarmak için, ribcage boyunca dikkatle diyaframı keser. Diyaframın delici torasik boşlukta negatif basıncı serbest bırakacaktır ve kalp ve akciğerleri açığa (Şekil 1A).</li>
		<li>Sternum tutun ve daha fazla torasik boşluğu açmak için yukarı çekin. Torasik lenf nodlarında metastatik lezyonlar için kaburga kafesi boyunca torasik boşluğun ventral yüzüne dikkat edin ve varsa, parçala.</li>
		<li>Hala sternum tutarak, kalp ve akciğerleri erişmek için ventral kaburga kafesi kesip. Kalbi tutun, yukarı çekin ve akciğerlerin altına kesin. Tam olarak kalp ve akciğerleri kaldırmak için, tüm anterior kan damarlarını ve trakea kesip. Doku PBS yerleştirin ve dikkatle akciğer dokusu veya akciğer metastatik lezyonlara zarar vermeden kalp çıkarın.</li>
		<li>Steril olmayan düz forseps ve Diseksiyon makas alın ve femur başında arka bacak kesti. Dikkatle femur kavramak ve kürk arka bacak çıkarın.</li>
		<li>Arka bacak bir kağıt havlu üzerine yerleştirin ve arka pençe kavramak. Tek kenarlı jilet kullanın hurda/Tibia ve femur tüm kas ve bağ dokusu uzağa kesti. Patella posterior kesme ve arka pençe kaldırarak Tibia kaldırmak tarafından Tibia femur çıkarın. Tibia ve femur 10% NBF yerleştirin. Diğer tarafta aynı prosedürü yapın. Not: Metastatik lezyonlar için fare uzun kemikleri incelemek amacıyla, fibula bozulmamış olması gerekmez. Uzun kemikler, bir hafta boyunca% 10 NBF 'de düzeltilecektir, ardından nötr EDTA çözümü20' yi kullanarak decalcified olacaktır. Üç hafta sonra, kemikler% 70 etanol için transfer edilecektir.</li>
		<li>Arka ekstremite çıkardıktan sonra, gelecek Genotipleme için bir kulak veya kuyruk kesme alın. Fare karkas ve tüm doku sabit veya nevuslardır nesil için kullanılan değil atın.</li>
	</ol></li>
	<li>Prostat tümörünün diseksiyonu Not: Fare prostat lob diseksiyon sadece bir diseksiyon mikroskop kullanılarak elde edilebilir19. Ancak, prostat tümörü yükü o kadar yüksek olabilir ki, bireysel lob 'lar ayırt edilemez ve diseksiyon mikroskop olmadan yapılabilir. Yine de, bireysel prostat lob diseksiyonu için tam protokol aşağıda açıklanmıştır.<ol>
<li>Ürogenital bölgeyi, bir Diseksiyon mikroskobu altında 10 cm 'lik bir PBS çanak içine yerleştirin ve sidik tarafını, araştırmacıya karşı karşıya gelen mesane ve seminal veziküller ile yönlendirmek. Ürogenital bölgenin tüm manipülasyon steril aletler kullanılarak yapılmalıdır.</li>
		<li>Prostat tümörünün genel fenotipini değerlendir-büyük ihtimalle, PCa GEMMs 'de sıvı dolu veya katı bir tümör gözlenir (Şekil 2a, B). Not: Akışkan dolu tümörlerde sıklıkla anterior prostat bölgesinde yer almaktadır (Şekil 2A). Sıvı dolu tümörler, öncelikle bağ dokusu ile yetersiz epitelyal bileşenlerden oluşur-böylece bu tümörler tümör epitelyal hücrelerinin düşük sayıda nedeniyle nevuslardır nesil için optimum değildir, temsili sonuçlarında tartışılacaktır Bölüm.</li>
		<li>Sıvı dolu tümörler varsa, tümör küçük bir delik poke. Ürogenital bölgeyi PBS 'nin yeni 10 cm 'lik bir tabağına yerleştirin.</li>
		<li>Dominant el olmayan baskın el ve kavisli forseps düz forseps bir çift alın. Ürogenital bölgeyi dorsal yüzüne çevirin. Proksimal prostat bölgesini arayın (Şekil 1B), hangi üretra pembe/kırmızı renk ile tespit edilebilir. Üretra kavramak ve eğri forseps ile ürogenital doku işlemek için sıkıca tutun. Not: Prostat diseksiyonu sırasında, her zaman mesane konumunu not alın, bu bireysel prostat lob bulmak için en basit yoldur (Şekil 1B).</li>
	</ol></li>
	<li>Ürogenital bölgeden prostat olmayan dokuların çıkarılması
	<ol>
<li>Ürogenital bölgenin dorsal yüzünde hala iken, seminal vezikül tabanı bulun. Dikkatle seminal vezikül çıkarın ve atın. Aynı prosedürü karşı tarafta gerçekleştirin. Not: Bu prostat diseksiyonu ile müdahale yapışkan ve opak salgıları sıvı serbest bırakacaktır gibi, seminal vezikül delinme kaçının. Seminal vezikül delinmiş ise, kalan ürogenital bölgeyi taze PBS ile yeni 10 cm ye aktarın.</li>
		<li>Vas deferens ve forseps kavisli tarafı kullanarak mümkün olduğunca çok yağlı ve bağ dokusu çıkarın ve atın.</li>
		<li>Hala sıkıca üretra/proksimal prostat bölgesi tutarak, ince, sivri makas bir çift kullanın üretradan mesane kaldırmak için.</li>
	</ol></li>
	<li>Bireysel prostat lobları izolasyonu
	<ol>
<li>Anterior prostat bulun (Şekil 1B). Düz forseps ile proksimal prostat bölgesi/üretra sıkıca tutmak için emin olun. Ön prostat bölgesini doğrudan forseplerin kavisli tarafı ile dokuyu hemen tutarak ve mesane ve prostatın geri kalanından sıkıca çekerek çıkarın. Dokuyu PBS 'ye yerleştirin. Not: Tüm prostat bölgeleri için, tümörün boyutuna bağlı olarak dokuyu çıkarmak için diseksiyon makası gerekebilir.</li>
		<li>Ventral prostat bölgesini bulun (Şekil 1B). Ventral prostat bölgesini adım 1.5.7 aynı şekilde çıkarın.</li>
		<li>Diseksiyon bu noktada, sadece lateral ve dorsal prostat bölgeleri mevcut olmalıdır, proksimal prostat bölgesi hala düz forseps tarafından kavrayarak ediliyor iken. Lateral ve dorsal prostat bölgelerini değerlendir (Şekil 1B). Lateral bölge dorsal bölgeden ayırt edilebilir ise, adım 1.5.7 açıklandığı gibi lateral prostat bölgesini çıkarın. Aynı prosedürü karşı tarafta yapın.</li>
		<li>1.5.7 adımda açıklandığı gibi dorsal prostat bölgesini çıkarın. Proksimal prostat bölgesini% 4 PFA olarak yerleştirin, üretranın kas dokusu içindeki yapısı nevuslardır nesil için uygun değildir.</li>
	</ol></li>
</ol>2. prostat tümör dokusundan 3D Organoidlerin üretimi
Not: Şekil 3 , tümör organoidlerin oluşturulması için prosedürün resimsel bir açıklamasını gösterir.
<ol><li>Hazırlık
	<ol>
<li>Aşağıdaki değişikliklerle drost ve al.18 ' e göre fare prostat nevuslardır medya hazırlayın. Noggin ve r-Spondin için rekombinant proteinler yerine şartlanma ortamını kullanın ve hem Noggi hem de ar-Spondin-Klima ortamı için% 10 yerine% 1 (v/v) oranında son konsantrasyon kullanın. Not: Ha-Mouse noggin-FC veya ha-Mouse Rspo1-FC ile stabil transfekte HEK293 hücreler sırasıyla noggin-veya R-spondin-Klima orta üretmek için kullanılır. Bu hücre hatları Stanford Üniversitesi 'nde Calvin Kuo Laboratuvarı 'ndan bir hediye.</li>
		<li>5 mg/ml 'lik son konsantrasyona gelişmiş dmem/F12 (+ + +) medya ile 20 mg/ml kolajenaz II seyreltilerek 15 ml 'lik bir tüpte sindirim solüsyonu hazırlayın. 10 μM son konsantrasyonda kolajenaz II çözüme Y-27632 kaya inhibitörü ekleyin. Not: Sindirim tamponunun dokuya oranı 1 mL ila 50 mg 'dır ve Drost ve al.18' e göre kullanılır.</li>
	</ol></li>
	<li>Tümör dokusunun mincing ve sindirimi
	<ol>
<li>Hücre kültürü kaputunda, prostat tümör dokusunu steril bir 10 cm kültür yeminde yerleştirin, nekrotik dokuyu kesip atın.</li>
		<li>Kalan prostat tümör dokusunu 1 mm3 küpler halinde steril kavisli forseps ile doku parçaları tutarak ve Diseksiyon makas ile kesme Mince.</li>
		<li>The 15 mL tüp içinde kıyılmış tümör parçaları koyun sindirim tampon ile forseps kavisli tarafı ile onları scooping tarafından. 37 °C ' de, 1,5 ila 2 saat sallayarak tümör dokusunu sindirin. her 20 dakikada bir sindirim ilerlemesini kontrol edin. Not: Şu anda,-20 °C depolama ve buz üzerinde çözülme en az 2 mL matris çıkarın. Matris 1 ml plakaya yaklaşık 3 h çözülmeye alacaktır.</li>
		<li>Doku sindirimi sonrası, 175 x g 'de 4 °c ' de 5 dakika santrifüj tüpü hücre Pelet formu.</li>
		<li>Supernatant çıkarın, hücre peletini gevşetmek için tüp Flick, ve 10 μM Y-27632 kaya inhibitörü ile tamamlayıcı ön ısıtılmış tripsin 1 ml hücre Pelet pelletini. Tüpü 5 dakika boyunca 37 °C su banyosuna koyun.</li>
		<li>İnkübasyon sonrası, standart P1000 ucu ile 5 kez yukarı ve aşağı pipet. Başka bir 5 dakika için 37 °C su banyosu için tüp geri dönün ve adım 2.2.6 tekrarlayın. Not: Prosedürün Şu anda, 55 °C ' lik kuluçvörü içine koyarak steril 6-iyi hücre kültürü çanak sıcak.</li>
	</ol></li>
	<li>Matris içinde hücreler ve Resuspension sayma
	<ol>
<li>9 mL soğuk AdDMEM/F12 (+ + +) ekleyerek hücreleri yıkayın ve 175 x g 'de tüpü 4 °c ' de 5 dakika santrifüjler.</li>
		<li>Santrifüjden sonra, supernatant çıkarın, peletin gevşetmek için tüp Flick, ve soğuk AdDMEM/F12 10 mL ekleyerek hücreleri tekrar yıkayın (+ + +). 4 °C ' de 5 dakika için 175 x g 'de tüpü Santrifüjü.</li>
		<li>Santrifüjden sonra, supernatant çıkarın, peletin gevşetmek için tüp Flick, hücreleri pelletini 1 ml addmem/F12 (+ + +), ve Standart prosedüre göre bir hemasitometre kullanarak hücrelerin sayısını saymak.</li>
		<li>Yedi-sekiz kubbeler bir iyi bir 6 iyi yemek zaman organoids matris içinde bir drop-Wise moda kaplama uygun . Yaklaşık 200 μL matris 7-8 kubbeleri üretecektir. Gelecekteki Deneysel amaçlar için kaç organoidin kuyuya ihtiyaç olduğunu karar verin ve gerekli matris hacmini hesaplayın. Daha sonra, 1,0 x 106 hücre/ml matrisin son konsantrasyonuna sahip olmak için gereken hücre içeren çözümün hacmini hesaplayın.</li>
		<li>Hücreleri saydıktan sonra, 175 x g 'de 4 °c ' de 5 dk santrifüjler. Supernatant kaldırmak, peletin gevşetmek için tüp Flick ve adım 2.3.4 hesaplanan matris hacminde hücreleri pelletini. Not: Matrix sadece 4 °C ' de sıvı şeklinde kalır; Matris stok tüpleri ve matris hücre çözümlerini her zaman buzda saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Kaplama matris kubbeleri ve medya uygulaması
	<ol>
<li>Kabarcık tanıtmadan hücreleri eşit şekilde dağıtmak için matris hücresi çözümünü P200 pipet ile karıştırın. 55 °C ' lik kuluçoradan 6-kuyu kültürü tabağı çıkarın.</li>
		<li>Dikkatle pipet 200 μL matris hücre çözeltisi ve hızlı bir şekilde kubbeler oluşturmak için çözüm bırakın.</li>
		<li>2.4.2 adımı tekrarlayın. Matris hücresi çözeltisi hacmi harcanıncaya kadar. Kubbeler, oda sıcaklığında 2 dakika boyunca katılaşma sağlar.</li>
		<li>6-well çanak ters çevirin ve 20 dakika boyunca Katılaşma devam etmek için bir 37 °C kuluçl içine çanak koymak.</li>
		<li>İnkübasyon sonra, her kuyu için 2 ml fare prostat nevuslardır medya ekleyin. 10 μM son konsantrasyonu 1 nM ve Y-27632 kaya Inhibitörü son konsantrasyon için her iyi sentetik androjen R1881 ekleyin. Dikkatlice karıştırın ve plakayı 37 °C ' lik bir kuluçinatörün içine yerleştirin. Not: Nevuslardır kültür medyanın 10 μM Y-27632 kaya inhibitörü ile sadece 1 hafta sonra nevuslardır nesil ile takviye edilmesi gerekir.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altering+the+genome+by+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Altering the genome by homologous recombination.</a> Science. 244 (4910), 1288-1292 (1989).</li>
<li>Furth, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+control+of+gene+expression+in+transgenic+mice+by+a+tetracycline-responsive+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Temporal control of gene expression in transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (20), 9302-9306 (1994).</li>
<li>Aranda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+directionality+in+the+Cre-LoxP+site-specific+recombination+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Altered directionality in the Cre-LoxP site-specific recombination pathway.</a> Journal of Molecular Biology. 311 (3), 453-459 (2001).</li>
<li>Schwenk, F., Kuhn, R., Angrand, P. O., Rajewsky, K., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+and+spatially+regulated+somatic+mutagenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice.</a> Nucleic Acids Research. 26 (6), 1427-1432 (1998).</li>
<li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+targeting+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).</li>
<li>Goodrich, M. M., Talhouk, R., Zhang, X., Goodrich, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+for+controlling+the+timing+and+order+of+engineered+mutations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">An approach for controlling the timing and order of engineered mutations in mice.</a> Genesis. 56 (8), 23242(2018).</li>
<li>Brocard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporally+controlled+site-specific+somatic+mutagenesis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporally controlled site-specific somatic mutagenesis in the mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14559-14563 (1997).</li>
<li>Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+mouse+cancer+models%3A+a+maze+of+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges.</a> Cell. 163 (1), 39-53 (2015).</li>
<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2019%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2019.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. , (2019).</li>
<li>Bluemn, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgen+Receptor+Pathway-Independent+Prostate+Cancer+Is+Sustained+through+FGF+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Androgen Receptor Pathway-Independent Prostate Cancer Is Sustained through FGF Signaling.</a> Cancer Cell. 32 (4), 474-489 (2017).</li>
<li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy+of+p53+and+Rb+deficiency+in+a+conditional+mouse+model+for+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Synergy of p53 and Rb deficiency in a conditional mouse model for metastatic prostate cancer.</a> Cancer Research. 66 (16), 7889-7898 (2006).</li>
<li>Ku, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rb1+and+Trp53+cooperate+to+suppress+prostate+cancer+lineage+plasticity%2C+metastasis%2C+and+antiandrogen+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance.</a> Science. 355 (6320), 78-83 (2017).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%3A+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spherical+cancer+models+in+tumor+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Spherical cancer models in tumor biology.</a> Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).</li>
<li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li>
<li>Oliveira, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+prostate%3A+a+basic+anatomical+and+histological+guideline%5BTitle%5D)+AND+%22Bosnian+Journal+of+Basic+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline.</a> Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).</li>
<li>Callis, G., Sterchi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decalcification+of+Bone%3A+Literature+Review+and+Practical+Study+of+Various+Decalcifying+Agents%2C+Methods%2C+and+Their+Effects+on+Bone+Histology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histotechnology%22%5BJournal%5D)">Decalcification of Bone: Literature Review and Practical Study of Various Decalcifying Agents, Methods, and Their Effects on Bone Histology.</a> The Journal of Histotechnology. (21), 49-58 (1998).</li>
<li>Dardenne, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Myc+Induces+an+EZH2-Mediated+Transcriptional+Program+Driving+Neuroendocrine+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">N-Myc Induces an EZH2-Mediated Transcriptional Program Driving Neuroendocrine Prostate Cancer.</a> Cancer Cell. 30 (4), 563-577 (2016).</li>
<li>Blattner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPOP+Mutation+Drives+Prostate+Tumorigenesis+In+Vivo+through+Coordinate+Regulation+of+PI3K%2FmTOR+and+AR+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">SPOP Mutation Drives Prostate Tumorigenesis In Vivo through Coordinate Regulation of PI3K/mTOR and AR Signaling.</a> Cancer Cell. 31 (3), 436-451 (2017).</li>
<li>Agarwal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Different+Classes+of+Luminal+Progenitor+Cells+within+Prostate+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors.</a> Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).</li>
</ol>

Yazarları ifşa etmek için mali ilişkiler yok.

Prostat tümörü diseksiyonu ve nevuslardır üretimi için protokol içinde kritik adımlar Prostat dışı doku ve fare prostat tümörünün ince diseksiyonu kaldırılması hem prostat olmayan epitelyal hücreler ve normal prostat epitelyal hücreler organoidler oluşturacaktır beri kanser organoidlerin optimum nesil için çok önemlidir. Katı prostat tümörlerinde özellikle, uygun hücrelerin sayısını azaltacak nekrotik doku ile kontaminasyon kaldırmak için uygun tümör alanlarını izole etmek çok önemlidir. Nevuslardır n...

1980 ' lerin sonlarında, Homolog rekombinasyon tarafından genler değiştirmek için yeteneği büyük ölçüde biyolojik sistemlerin çalışma Gelişmiş1. İndüklenebilir, doku veya hücreye özgü promotor sistemleri ve CRE-loxp gibi siteye özgü rekombinazlar, hem geçici olarak hem de uzamsal olarak2,3, genetik modifikasyonlar üzerinde kontrol kolaylaştırarak genetik çalışmalar gelişmiş 4' ü yapın. Bu genetik stratejilerin kombinasyonu deneysel model sistemleri5,6,7geniş bir dizi yarattı.
Genetik olarak tasarlanan fare modelleri (GEMMs), bireysel genler veya genler gruplarının memelin gelişimini ve hastalığı nasıl etkilediğini değerlendirmek için ayrılmaz bir araçtır. Klinik öncesi kanser araştırmalarında, GEMMs kanser gelişimi, progresyon ve tedavi8' i incelemek için en fizyolojik olarak alakalı ve titiz bir yöntemdir. Bizim laboratuar üreten ve kanser GEMMs karakterize uzmanlaşmıştır.
Amerika Birleşik Devletleri 'nde erkekler arasında en yüksek tanısı olmayan kutanöz kanser prostat kanseri (PCa). PCa olan hastaların çoğunluğu düşük riskli hastalık ve yüksek hayatta kalma olasılığı vardır, ancak hastalık ileri aşamalarında teşhis edildiğinde ya da hedeflenen hormonal tedavi agresif, non-tedavi edilemez PCa ilerlemesi indükler ise hayatta kalma oranları büyük ölçüde düşüş alt türler9,10. Laboratuvarımız bir veya daha fazla tümör bastırıcı genlerin floxed alleni kullanan GEMMs geliştirdi. Yeniden kombinasyon ve tümör bastırıcı gen ifade kaybı özellikle prostat oluşur çünkü biz CRE Rekombinaz aşağı aşağı probasin organizatör ile bir transgeni tanıtıldı sadece prostat epitelyal hücrelerde aktive11, 12. biz de bir CRE muhabiri transgene MT/mg denilen içeren bizim gemms yetiştirilen var, CRE ve yeşil floresan protein (Gfp) hücre içinde c-13Ile hücrelerde eksik hücrelerde domates floresan protein ifadesi indükler. Bu yöntemin sunumu ve temsilcimiz, laboratuvarımızda çalışmamızda GEMMs 'i gösterirken, bu protokol herhangi bir fare modelinden prostat kanseri organoidleri oluşturmak için kullanılabilir. Ancak, temsili sonuçlar bölümünde ayrıntılı olarak tartışıldığı gibi, bazı tümör özelliklerinin prostat kanseri nevuslardır üretimi için optimum olduğunu gözlemledik.
Son on yıl içinde, epitelyal orijinli dokulardan oluşan yeni kültür hücreleri yöntemleri, org sistemleri içinde vitro14,15modellik yeteneğimizde önemli gelişmelere yol açmıştır. "3D hücre kültürü" terimi, organoidlerin kurulması ve sürdürülmesinde yer alan tekniklere atfedilmiştir, bu da genellikle Organ-spesifik hücre sırlarıyla tahrik edilen ikincil mimarisi birleştiren hücrelerden oluşan yapılar olarak tanımlanabilir. özellikleri16. Bu yeni yöntemler, hücrelerin uzun vadeli büyüme için dönüşüm veya ölümsüzleştirme gerektirmeyen klasik 2D hücre kültüründen farklıdır; Böylece, normal hücrelerin 3D kültürler hastalıklı hücrelere kıyasla olabilir. Bu özellikle normal hücre kontrol kültürlerinin genellikle mevcut olmadığı kanser araştırmalarında değerlidir. Buna ek olarak, organoids kendiliğinden uygun farklılaşan hücre türleri ile ikincil doku mimarileri oluşturmak, onları daha iyi bir model sistemi 2D hücre hatları17daha kanser anlamak için yapmak. Laboratuvarımız bizim PCA gemms izole tümör sorunu 3D nevuslardır hatları yarattı bizim in vivo veri tamamlamak ve gemms mümkün olmayacaktır deneyler gerçekleştirmek için.
Bu yazıda, farklı fare prostat lobları ve metastatik lezyonların diseksiyonu da dahil olmak üzere PCA gemms tam otopsi için yazılı ve görsel protokoller sunuyoruz. Daha önce Drost ve Al tarafından yayınlanan bir protokol temelinde fare prostat tümörlerinden organoidler oluşturmak için adım adım bir yöntem tarif ve gösteriyoruz. normal fare prostat epitelyal dokusundan organoidler türetmek için18.

<table><tbody><tr><td>% 0.25 Tripsin + 2.21 mM EDTA</td><td>Sigma</td><td>25-053</td><td></td></tr><tr><td>1 1/4 inç, 23 G, tek kullanımlık şırınga iğneleri</td><td>Becton Dickinson</td><td>Z192430</td><td></td></tr><tr><td>%10 nötr tamponlu formalin</td><td>Sigma</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>%32 paraformaldehit</td><td>Elektron Mikroskobu Hizmetleri</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-10432</td><td></td></tr><tr><td>Gelişmiş DMEM/F12+++</td><td>Gibco</td><td>12634</td><td></td></tr><tr><td>Analitik terazi</td><td>Mettler Toledo</td><td>30216623</td><td></td></tr><tr><td>B27 (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz II</td><td>Gibco</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon Tahtası</td><td>Thermo-Fisher</td><td>36-1</td><td></td></tr><tr><td>EHS Sarkom matrisi, Pathclear Lot # 19814A10</td><td>Trevigen tarafından üretilmiştir</td><td>Frederick Ulusal Laboratuvarı'ndaki Ulusal Kanser Enstitüsü'nden talep</td><td>edildi Ulusal Kanser Enstitüsü'nden hibe sahibi matris</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td> <td>Sigma</td><td>25-060</td><td></td></tr><tr><td>insan rekombinant Epidermal büyüme faktörü (EGF)</td> <td>talep edebilir PeproTech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin (200 mM)</td> <td>Sigma</td><td>25-005</td><td></td></tr><tr><td>N-Asetil-L-Sistein</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Hassas terazi</td><td>Mettler Toledo</td><td>30216561</td><td></td></tr><tr><td>Neşter #23</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>504176</td><td></td></tr><tr><td>Neşter Sapı #7, 16 cm</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>500238</td><td></td></tr><tr><td>Tek kenarlı karbon tıraş bıçağı</td><td>Fisherbrand</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Paslanmaz çelik diseksiyon makası, 10 cm, düz</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393</td><td></td></tr><tr><td>Paslanmaz çelik Iris forseps, 10 cm, kavisli uç, tırtıklı</td><td>World Precision Instruments</td><td>15915</td><td></td></tr><tr><td>Paslanmaz çelik Nugent yardımcı forseps, düz uçlu, tırtıklı</td><td>World Precision Instruments</td><td>504489</td><td></td></tr><tr><td>Y-276632 (Kaya Önleyici)</td><td>APExBIO</td><td>A3008</td><td></td></tr></tbody></table> Serisi

prostat kanseri genetiği işlenmiş fare modelleri tümör organoids üretimi

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Genleri değiştirmek için Homolog rekombinasyon dayalı Yöntemler önemli ölçüde biyolojik araştırma ilerletti. Genetiği değiştirilmiş fare modelleri (GEMMs) memeli gelişimi ve hastalığı okumak için titiz bir yöntemdir. Laboratuvarımız, siteye özel CRE-loxP Rekombinaz sistemi ve prostat spesifik promotör kullanılarak bir veya birden fazla tümör bastırıcı genlerin ifadesinin bulunmadığı prostat kanseri (PCa) çeşitli GEMMs geliştirdi. Bu yazıda, öncelikle fare prostat tümörlerinin diseksiyonu üzerinde duruluyor, bu PCA gemms otopsi için yöntemi açıklanmaktadır. Son on yıl içinde geliştirilen yeni yöntemler, üç boyutta organ sistemlerine model olarak epitelyal türev hücrelerin kültürünü kolaylaştırmış durumdadır. Biz de detay bir 3D hücre kültürü yöntemi fare PCa GEMMs tümör organoids oluşturmak için. Klinik öncesi kanser araştırması 2B hücre kültürü ve hücre çizgisinin türetildiği veya hasta tarafından türetilen xenograft modellerinin hakimiyetindedir. Bu yöntemler tümör mikroçevre eksikliği, klinik öncesi çalışmalarda bu teknikleri kullanarak bir sınırlama. GEMMs daha fizyolojik-tümör ve kanser ilerlemesini anlamak için ilgilidir. Tümör nevuslardır kültürü, tümör mimarisini ve hücre soy özelliklerini tekrar eden bir in vitro model sistemidir. Ayrıca, 3D hücre kültürü yöntemleri tümör hücresi kültürlerine kıyasla normal hücrelerin büyümesini sağlar, 2D hücre kültürü tekniklerini kullanarak nadiren mümkündür. Kombinasyon halinde, ön klinik çalışmalarda GEMMs ve 3D hücre kültürünün kullanımı kanser biyolojisi anlayışımızı iyileştirmek için potansiyele sahiptir.

Ön prostat bölgesinde büyük bir sıvı dolu primer prostat tümörü olan bir fare temsili otopsi görüntüler Şekil 2agösterilir. Buna karşılık, Şekil 2B, bireysel prostat bölgeleri ayırt edilemez büyük bir katı primer prostat tümörü olan bir fare temsili nekropsy görüntüleri gösterir. Floresan diseksiyon görüntüleri aynı katı prostat tümörü gösterir Şekil 2B ifade Gfp, bu tümörler hücre ...

Biz prostat tümörü diseksiyon odaklanmak, fare prostat kanseri modellerinin otopsi ve diseksiyon için bir yöntem göstermektedir. Fare prostat tümörü organoidlerin oluşturulması için adım adım bir protokol de sunulmaktadır.

Prostat kanseri genetiği Işlenmiş fare modelleri tümör Organoids üretimi

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

Fare organoid kültürleri geleneksel hücre kültürlerine göre in vivo hücre organizasyonuna daha çok benzer. Kanser araştırmalarında, organoidler orijinal tümörü 2D hücre çizgilerinden daha iyi modeller ler ve yeni ilaç tedavileri geliştirmek için potansiyel kanser tedavilerini in vitro test etmek için kullanılabilirler. Erkek fare ürogenital sistemin en blok çıkarma için mesane her iki tarafında yağ yastığı kavramak ve testis ortaya çıkarmak için yukarı çekin.Her testisi ürogenital bölgenin geri kalanından dikkatlice inceleyin. Mesaneyi yavaşça kaldırın, böylece ürogenital bölge birlikte yükselmiş ve altındaki üretrayı açığa çıkar. Mesane tutarken, üretra incise dorsal prostatın alt karşı makas yönlendirmek.Tüm ürogenital bölge karın boşluğundan salınacak. Ürogenital sistem çıkarıldıktan sonra, ürogenital sistemin hemen arkasında ve omurganın her iki tarafında konumlandırılmış pelvik lenf düğümleri maruz kalacaktır. Lenf düğümleri kaldırmak için lenf dokusunun altında düz forseps yönlendirmek ve yukarı çekin.Sonra, düz forseps ve kesme ile rektum kavramak, mezenterik lenf düğümlerinde metastatik lezyonlar aramak için tüm kolon ve ince bağırsak çözmek için rektum yukarı çekerek. Tüm ilium çıkarıldığında mide maruz kalmak için duodenum çekmeye devam edin. Tamamen mide kaldırmak için yemek borusu kesin.Lenf düğümlerinde herhangi bir metastatik lezyon gözlenirse, PBS'de depolanması için bu düğümleri bağırsaktan dikkatlice inceleyin. Mide çıkarıldığında, dalak% 4 paraformaldehit depolama için karın sırt tarafında hasat edilebilir. PBS depolama için karaciğer çıkarın.Metastatik lezyonlar içeren herhangi bir böbrek lenf düğümleri ile birlikte omurganın her iki tarafında böbrekler çıkarın. Göğüs boşluğu ortaya çıkarmak için dikkatle göğüs kafesi boyunca diyafram kesti. Göğüs boşluğunda salınan negatif basınç kalp ve akciğerleri ortaya çıkaracaktır.Göğüs kafesini daha da açmak için göğüs kafesini yukarı çekin. Varsa diseksiyon için göğüs kafesi boyunca torasik kavitenin ventral yüzünü torasik lenf düğümlerinde metastatik lezyonlar için tarayın. Hala göğüs kafesi tutarken, kalp ve akciğerlere erişmek için ventral göğüs kafesi kesip ve akciğerlerin altında kesmek için kalp çekin.Kalp ve akciğerleri tamamen çıkarmak için tüm ön kan damarlarını kesip trakea. Akciğer dokusuna veya akciğer metastatik lezyonlarına zarar vermeden kalbi pbs kabına dikkatlice aktarın. Prostat tümörü diseksiyon için bir diseksiyon mikroskobu altında ürogenital bölge yerleştirin.Ürogenital bölgeyi sırt yüzeyine çevirmek için bir çift düz forceps ve bir çift kavisli forceps kullanın. Üretranın pembe-kırmızı rengi ile tanımlanabilecek proksimal prostat bölgesini bulun. Eğri forceps ile ürogenital dokunun manipülasyon izin vermek için üretra sıkıca tutun.Onların dikkatli kaldırılmasına izin vermek için seminal veziküllerin tabanını bulun. Sonra vas deferens ve mümkün olduğunca çok yağlı ve bağ dokusu kaldırmak için çalgılar kavisli tarafı kullanın. Hala sıkıca üretra ve proksimal prostat bölgesi tutarken, üretra dan mesane kaldırmak için ince sivri makas bir çift kullanın.Proksimal prostat bölgesini ve üretrayı düz çalgılarla sıkıca tutarak ön prostat bölgesini, keterlerin kavisli tarafıyla sıkıca tutarak dokuyu mesaneden ve prostatın geri kalanından sıkıca çeker. Ön prostat dokusunu PBS'ye yerleştirin ve ventral prostat bölgesini bulun. Ventral prostat bölgesini de aynı şekilde çıkarın.Lateral bölge dorsal bölgeden ayırt edilebilir ise her iki tarafta lateral prostat bölgesi ni çıkarın. Daha sonra dorsal prostat bölgesini çıkarın ve proksimal prostat bölgesini %4 paraformaldehite yerleştirin. Kıyma sonra, 37 santigrat derece bir buçuk-iki saat sindirim için sindirim tampon 15 mililitrelik tüp içine tümör parçaları yerleştirin.Sindirim sonunda, santrifüj ile sindirilmiş doku tortu ve supernatant atın. Hücre peletini gevşetmek için tüpü hafifçe kaydırın. Önceden ısıtılmış tripsin bir mililitre hücreleri resuspend 10 mikromolar Y-27632 ROCK inhibitörü ile takviye 37 santigrat derece beş dakika.Kuluçka sonunda standart bir P1000 pipet ucu ile doku bulamaç beş kez triturate. Ek bir beş dakika kuluçka ve trituration için su banyosu için tüp dönün. Matris kubbe kaplama için soğuk ortamda dokuz mililitre sindirilmiş hücreleri yıkayın, sonra santrifüj ile hücreleri toplamak.Saymak için taze orta bir mililitre hücreleri resuspend. Ve sayma sonra, bir kez daha santrifüj ile hücreleri toplamak. Tümör hücrelerini uygun matris hacminde seyreltin.Dikkatle 55 derece santigrat her kuyuiçine matris hücre çözeltisi 200 mikrolitre damla altı kuyu plaka ısıtılır. Kubbelerin oda sıcaklığında iki dakika katılaşmasına izin verin ve tabağı 37 derecelik bir kuluçka makinesine 20 dakika baş aşağı yerleştirin. Kubbeler tamamen katılaşmış zaman her kuyuya androjen R1881 ve ROCK inhibitörü ile takviye prostat organoid orta iki mililitre ekleyin.Plakayı hücre kültürü kuluçka makinesine geri ver. Floresan diseksiyon görüntüleri, katı prostat tümörleri tarafından yeşil floresan protein veya GFP ekspresyonu ortaya, tümör hücrelerinin Cre ifade gösteren. Aynı hayvanın karaciğer ve akciğerleri, bu tümörlerin primer prostat tümöründen kaynaklandığını gösteren GFP'yi ifade eden metastatik tümörler sergilemektadır.Bu fareden pelvik lenf düğümü GFP değil, Domates ifade eder, Bu metastatik tümör lenf düğümü geçti ve normal doku kalır belirten. Katı prostat tümöründen üretilen küçük organoidler kültürün ilk gününde tümör organoid kültüründe bulunan domates ve GFP ifade eden hücrelerle oluşmaya başlar. Yedinci gün ve ötesinde prostat tümör organoidleri tam olarak oluşmuş ancak, organoidler GFP ifade, ama Domates değil, organoidler Cre-ifade tümör hücrelerinden değil, normal epitel hücrelerinden kaynaklandığını düşündürmektedir.Sıvı dolu prostat tümöründen üretilen küçük organoidlerin kültürünün birinci gününde hem Domates hem de GFP ifade eden hücreler organoid kültürü içinde mevcuttur. Sıvı dolu prostat tümörlerinden organoidler yedinci gün ve ötesinde GFP veya Domates ifade, organoidler Cre ifade etmez hücrelerden oluşan belirten. Prostat dokusuhasalırken odaklı kalmak için, mesane ve üretra pozisyonları her zaman farkında olun.Organoidler kendi nesilden sonra görüntüleme uygulamalarında, moleküler biyoloji analizinde ve ilaç ekranlarında kullanılabilir.

generation-tumor-organoids-from-genetically-engineered-mouse-models

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Tümörlerden türetilen organoidler, tümörlerin patolojik özelliklerini ve organa özgü hücre soyunu koruyabilen bir tür 3B hücre kültürü modelidir. Örnek protokolde, bilim adamlarının genetik olarak tasarlanmış bir fare modelinden bir prostat tümöründen organoidler ürettiğini göreceğiz.

Tümörlerden Organoidlerin Hazırlanması: 3 Boyutlu İn Vitro Tümör Modeli

Bu videoda, organ ortamının gelişmekte olan tümörler üzerindeki rolünü incelemek için kültürlenmiş mesane tümörü organoidlerinin murin mesanesine ortotopik transplantasyonunu açıklıyoruz.

Mesane Tümörü Organoid Modeli: Mesane Organoidlerinin Alıcı Murin Mesanesine Ortotopik Transplantasyonu İçin Bir Yöntem

Primer fare kolon tümörü organoid kurmak için basit bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem kolon tümör hücreleri hayatta kalmak ve epitel normal bir kolon yok ise, sınırlı büyüme faktörleri içeren ortamlarda organoids içine büyümeye bu özelliği kullanır.

Birincil Fare Colon Tümörler in vitro organoid Kültür

Fare prostat organoidleri farklılaşmayı düzenleyen mekanizmaları değerlendirmek için umut verici bir bağlam temsil eder. Bu makalede prostat organoidleri kurmak için geliştirilmiş bir yaklaşım açıklanır ve (1) organoidlerden protein lysate toplamak için yöntemler tanıttı, ve (2) tam monte konfokal mikroskopi için düzeltve leke organoidler.

Organoid Kültürü Kullanarak Fare Prostat Epitel Hücrelerinin Ayırt Etme Kapasitesinin Değerlendirilmesi

Burada sunulan prostat epitel organoidleri farmakolojik yanıtları çalışma için bir protokoldür. Organoidler vivo biyolojiye çok benzer ler ve hasta genetiğini yeniden özetlerler, bu da onları çekici model sistemleri haline getirir. Prostat organoidleri wildtype prostatlar, genetiği değiştirilmiş fare modelleri, iyi huylu insan dokusu ve ileri prostat kanserinden kurulabilir.

Genotipleri ve Mutasyonel Profilleri Farmakolojik Tepkilere Çeviren Araçlar Olarak Prostat Organoid Kültürleri

Hasta BMPC örneklerinin üç boyutlu kültürleri ve kemik metastatik prostat kanserinin ksenogreftleri orijinal tümörlerinin fonksiyonel heterojenliğini korur ve bu da kistler, sferoidler ve kompleks, tümör benzeri organoidlerle sonuçlanır. Bu makale, heterojen hasta türemiş örneklerin 3D kültürü ve IFC kullanılarak analizleri için bir optimizasyon stratejisi ve protokolü sağlar.

Hasta Prostat Kanseri Kemik Metastazı Örneklerinden ve Ksenogreftlerinden Elde Edilen Üç Boyutlu (3D) Organoidlerin Oluşturulması ve Analizi

Bu protokol, kanserojen kaynaklı murin mesane kanserinden elde edilen mesane tümörü organoidlerinin üç boyutlu in vitro kültürünü oluşturmak için ayrıntılı deneysel adımlar sağlar. Paslanma, genetik mühendislik ve tümör organoidlerinin ortotopik transplantasyonlarını içeren kültür yöntemleri tanımlanmıştır.

Fare Mesane Tümörü Organoidlerinin Kültürü, Manipülasyonu ve Ortotopik Transplantasyonu

Bu protokol, diferansiyel santrifüjleme yoluyla primer normal ve tümör meme dokusundan epitel organoidleri üretmek için bir yaklaşımı tartışmaktadır. Ayrıca, gömülü organoidlerin immünofloresan görüntülenmesinin yanı sıra üç boyutlu kültürleme için talimatlar da dahil edilmiştir.

Normal ve tümörlü meme dokusundan fare ve insan epitel organoidlerinin passiz olmadan üretilmesi ve görüntülenmesi

Hasta tümörlerinden üretilen organoidler ortotopik olarak fare karaciğerine enjekte edilir. Tümör olmayan karaciğer dokusunun rezeksiyonu, tümörün bulunduğu karaciğer dokusunda rejeneratif bir ortama yol açar.

Karaciğer Rejenerasyonunun Tümör Büyümesi Üzerindeki Etkisini Araştırmak İçin Hepatosellüler Kanser Hastasından Elde Edilen Bir Organoid Ksenogreft Modeli

Prostat kanseri heterojenliği ve tedavi direnci zorluklar olmaya devam etmektedir. Temel ebeveyn tümör özelliklerini koruyan hasta kaynaklı organoidler (PDO'lar) üretmek için bir protokol açıklıyoruz. Bu standartlaştırılmış model, ilaç taramasını ve hassas tıptaki gelişmeleri destekler.

Hasta Kaynaklı Prostat Kanseri Organoidlerinin Oluşturulması ve Sürdürülmesi: Ayrıntılı Bir Deneysel Protokol

Bu protokol, 2D olarak yetiştirilen bir mare prostat organoidi tabanlı modelin oluşturulmasını tanımlar. Organoid ayrıştırma, hücre tohumlama, farklılaşma, epitel bütünlüğü değerlendirmesi ve üropatogenik Escherichia coli ile in vitro enfeksiyonu içerir. Model, apikal erişilebilirlik sağlar ve geleneksel 3B organoid sistemlerin sınırlamalarını aşarak konak-patojen etkileşimlerini incelemek için uygundur.

Konak-Patojen Etkileşimlerini İncelemek İçin Fare Prostat Organoid-Tabanlı Modelin Oluşturulması

Keşfedin fare prostat kanser modeli nekropsi ve diseksiyon yöntemini. Tümör organoidleri üretme protokolü ile kanser biyolojisini in vivo benzeri 3D kültürlerde çalışın ve yeni tedaviler geliştirin.

Prostat kanseri genetiği Işlenmiş fare modelleri tümör Organoids üretimi

Daha fazla video keşfet