Prostat kanseri genetiği Işlenmiş fare modelleri tümör Organoids üretimi
13 Haziran 2019
Biz prostat tümörü diseksiyon odaklanmak, fare prostat kanseri modellerinin otopsi ve diseksiyon için bir yöntem göstermektedir. Fare prostat tümörü organoidlerin oluşturulması için adım adım bir protokol de sunulmaktadır.
Fare organoid kültürleri geleneksel hücre kültürlerine göre in vivo hücre organizasyonuna daha çok benzer. Kanser araştırmalarında, organoidler orijinal tümörü 2D hücre çizgilerinden daha iyi modeller ler ve yeni ilaç tedavileri geliştirmek için potansiyel kanser tedavilerini in vitro test etmek için kullanılabilirler. Erkek fare ürogenital sistemin en blok çıkarma için mesane her iki tarafında yağ yastığı kavramak ve testis ortaya çıkarmak için yukarı çekin.
Her testisi ürogenital bölgenin geri kalanından dikkatlice inceleyin. Mesaneyi yavaşça kaldırın, böylece ürogenital bölge birlikte yükselmiş ve altındaki üretrayı açığa çıkar. Mesane tutarken, üretra incise dorsal prostatın alt karşı makas yönlendirmek.
Tüm ürogenital bölge karın boşluğundan salınacak. Ürogenital sistem çıkarıldıktan sonra, ürogenital sistemin hemen arkasında ve omurganın her iki tarafında konumlandırılmış pelvik lenf düğümleri maruz kalacaktır. Lenf düğümleri kaldırmak için lenf dokusunun altında düz forseps yönlendirmek ve yukarı çekin.
Sonra, düz forseps ve kesme ile rektum kavramak, mezenterik lenf düğümlerinde metastatik lezyonlar aramak için tüm kolon ve ince bağırsak çözmek için rektum yukarı çekerek. Tüm ilium çıkarıldığında mide maruz kalmak için duodenum çekmeye devam edin. Tamamen mide kaldırmak için yemek borusu kesin.
Lenf düğümlerinde herhangi bir metastatik lezyon gözlenirse, PBS'de depolanması için bu düğümleri bağırsaktan dikkatlice inceleyin. Mide çıkarıldığında, dalak% 4 paraformaldehit depolama için karın sırt tarafında hasat edilebilir. PBS depolama için karaciğer çıkarın.
Metastatik lezyonlar içeren herhangi bir böbrek lenf düğümleri ile birlikte omurganın her iki tarafında böbrekler çıkarın. Göğüs boşluğu ortaya çıkarmak için dikkatle göğüs kafesi boyunca diyafram kesti. Göğüs boşluğunda salınan negatif basınç kalp ve akciğerleri ortaya çıkaracaktır.
Göğüs kafesini daha da açmak için göğüs kafesini yukarı çekin. Varsa diseksiyon için göğüs kafesi boyunca torasik kavitenin ventral yüzünü torasik lenf düğümlerinde metastatik lezyonlar için tarayın. Hala göğüs kafesi tutarken, kalp ve akciğerlere erişmek için ventral göğüs kafesi kesip ve akciğerlerin altında kesmek için kalp çekin.
Kalp ve akciğerleri tamamen çıkarmak için tüm ön kan damarlarını kesip trakea. Akciğer dokusuna veya akciğer metastatik lezyonlarına zarar vermeden kalbi pbs kabına dikkatlice aktarın. Prostat tümörü diseksiyon için bir diseksiyon mikroskobu altında ürogenital bölge yerleştirin.
Ürogenital bölgeyi sırt yüzeyine çevirmek için bir çift düz forceps ve bir çift kavisli forceps kullanın. Üretranın pembe-kırmızı rengi ile tanımlanabilecek proksimal prostat bölgesini bulun. Eğri forceps ile ürogenital dokunun manipülasyon izin vermek için üretra sıkıca tutun.
Onların dikkatli kaldırılmasına izin vermek için seminal veziküllerin tabanını bulun. Sonra vas deferens ve mümkün olduğunca çok yağlı ve bağ dokusu kaldırmak için çalgılar kavisli tarafı kullanın. Hala sıkıca üretra ve proksimal prostat bölgesi tutarken, üretra dan mesane kaldırmak için ince sivri makas bir çift kullanın.
Proksimal prostat bölgesini ve üretrayı düz çalgılarla sıkıca tutarak ön prostat bölgesini, keterlerin kavisli tarafıyla sıkıca tutarak dokuyu mesaneden ve prostatın geri kalanından sıkıca çeker. Ön prostat dokusunu PBS'ye yerleştirin ve ventral prostat bölgesini bulun. Ventral prostat bölgesini de aynı şekilde çıkarın.
Lateral bölge dorsal bölgeden ayırt edilebilir ise her iki tarafta lateral prostat bölgesi ni çıkarın. Daha sonra dorsal prostat bölgesini çıkarın ve proksimal prostat bölgesini %4 paraformaldehite yerleştirin. Kıyma sonra, 37 santigrat derece bir buçuk-iki saat sindirim için sindirim tampon 15 mililitrelik tüp içine tümör parçaları yerleştirin.
Sindirim sonunda, santrifüj ile sindirilmiş doku tortu ve supernatant atın. Hücre peletini gevşetmek için tüpü hafifçe kaydırın. Önceden ısıtılmış tripsin bir mililitre hücreleri resuspend 10 mikromolar Y-27632 ROCK inhibitörü ile takviye 37 santigrat derece beş dakika.
Kuluçka sonunda standart bir P1000 pipet ucu ile doku bulamaç beş kez triturate. Ek bir beş dakika kuluçka ve trituration için su banyosu için tüp dönün. Matris kubbe kaplama için soğuk ortamda dokuz mililitre sindirilmiş hücreleri yıkayın, sonra santrifüj ile hücreleri toplamak.
Saymak için taze orta bir mililitre hücreleri resuspend. Ve sayma sonra, bir kez daha santrifüj ile hücreleri toplamak. Tümör hücrelerini uygun matris hacminde seyreltin.
Dikkatle 55 derece santigrat her kuyuiçine matris hücre çözeltisi 200 mikrolitre damla altı kuyu plaka ısıtılır. Kubbelerin oda sıcaklığında iki dakika katılaşmasına izin verin ve tabağı 37 derecelik bir kuluçka makinesine 20 dakika baş aşağı yerleştirin. Kubbeler tamamen katılaşmış zaman her kuyuya androjen R1881 ve ROCK inhibitörü ile takviye prostat organoid orta iki mililitre ekleyin.
Plakayı hücre kültürü kuluçka makinesine geri ver. Floresan diseksiyon görüntüleri, katı prostat tümörleri tarafından yeşil floresan protein veya GFP ekspresyonu ortaya, tümör hücrelerinin Cre ifade gösteren. Aynı hayvanın karaciğer ve akciğerleri, bu tümörlerin primer prostat tümöründen kaynaklandığını gösteren GFP'yi ifade eden metastatik tümörler sergilemektadır.
Bu fareden pelvik lenf düğümü GFP değil, Domates ifade eder, Bu metastatik tümör lenf düğümü geçti ve normal doku kalır belirten. Katı prostat tümöründen üretilen küçük organoidler kültürün ilk gününde tümör organoid kültüründe bulunan domates ve GFP ifade eden hücrelerle oluşmaya başlar. Yedinci gün ve ötesinde prostat tümör organoidleri tam olarak oluşmuş ancak, organoidler GFP ifade, ama Domates değil, organoidler Cre-ifade tümör hücrelerinden değil, normal epitel hücrelerinden kaynaklandığını düşündürmektedir.
Sıvı dolu prostat tümöründen üretilen küçük organoidlerin kültürünün birinci gününde hem Domates hem de GFP ifade eden hücreler organoid kültürü içinde mevcuttur. Sıvı dolu prostat tümörlerinden organoidler yedinci gün ve ötesinde GFP veya Domates ifade, organoidler Cre ifade etmez hücrelerden oluşan belirten. Prostat dokusuhasalırken odaklı kalmak için, mesane ve üretra pozisyonları her zaman farkında olun.
Organoidler kendi nesilden sonra görüntüleme uygulamalarında, moleküler biyoloji analizinde ve ilaç ekranlarında kullanılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, fare prostat kanseri modellerinin nekropsi ve diseksiyonu için bir yöntem sunar ve prostat tümörü diseksiyonuna odaklanır. Ayrıca, fare prostat tümör organoidlerinin oluşturulması için adım adım bir protokol sunar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Onkoloji
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Organoid kültürleri, geleneksel hücre kültürlerinden daha yakından in vivo hücre organizasyonunu taklit eder.
- Organoidler, kanser araştırmalarında orijinal tümörler için etkili modellerdir.
- Onlar in vitro potansiyel kanser tedavilerini test etmek için kullanılabilir.
- Bu araştırma, organoid modelleri kullanarak yeni ilaç tedavileri geliştirmeyi amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Fare prostat kanseri modellerini diseksiyonu için bir yöntem göstermek.
- Prostat tümör organoidlerinin oluşturulması için bir protokol sağlamak.
- Organoid modelleri aracılığıyla tümör biyolojisi hakkındaki anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Erkek fare ürogenital sisteminin en bloc ekstraksiyonu.
- Prostati maruz bırakmak için testislerin ve mesanenin diseksiyonu.
- Mesane tutulurken makasla üretranın kesimi.
- Organoid üretimi için adım adım protokol.
Ana Sonuçlar
- Fare prostat kanseri modelleri için başarılı diseksiyon teknikleri.
- Orijinal tümörlere yakından benzeyen organoidlerin üretimi.
- Terapötik testler için bir platform olarak organoidlerin gösterimi.
- Prostat kanseri biyolojisi hakkında daha gelişmiş anlayış.
Sonuçlar
- Sunulan yöntemler, prostat kanserini incelemek için etkilidir.
- Organoidler, kanser araştırması için değerli bir araç sunar.
- Bu yaklaşım, iyileştirilmiş tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yol açabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Genetically engineered mouse models of prostate cancer provide a physiologically relevant system for studying tumorigenesis and therapeutic response. Combining these models with 3D tumor organoid culture enables in vitro systems that recapitulate tumor architecture and support drug screening. This approach improves predictive confidence in preclinical oncology research by bridging genetic models with functional assays.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of tumor suppressor loss in prostate cancer using Cre-loxP models to validate genetic targets.
- Operational Value: Provides a reproducible method to isolate tumor tissue from GEMMs for downstream organoid generation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates tumor organoids that maintain GFP expression from Cre-recombined tumor cells, enabling lineage tracking in drug response assays.
- Operational Value: Establishes a standardized 3D culture protocol using matrix domes and prostate organoid medium with R1881 and ROCK inhibitor for consistent tumor model propagation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports comparison of tumor and normal epithelial organoids via dual Tomato/GFP expression to assess tumor-specific phenotypes.
- Operational Value: Facilitates metastatic lesion detection in lymph nodes and organs during necropsy, informing preclinical models of cancer progression.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates genetic model dissection with 3D culture to support discovery biology, assay development, and translational validation in prostate cancer research.
- Discovery Biology: Enables functional validation of tumor suppressor pathways through Cre-dependent recombination in prostate-specific GEMMs.
- Screening: Produces organoid cultures suitable for drug screening applications after solidification and medium addition.
- Analytics: Allows fluorescence-based tracking of Cre activity (GFP) and recombination history (Tomato) to distinguish tumor-derived from normal epithelial organoids.
- Translational Research: Supports continuity from autochthonous tumor models to ex vivo drug testing via organoid platforms that retain genetic lineage markers.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable necropsy and organoid generation workflow applicable across multiple GEMMs and cancer types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation by linking genetic models to functional 3D phenotypes that reflect in vivo tumor behavior.
- Operational Value: Standardizes tumor tissue processing and organoid formation to improve reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Reduces reliance on 2D cell lines by providing genetically defined, microenvironment-informed models for preclinical testing.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of therapeutic candidates using organoid models that retain tumor-specific genetic signatures.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse necropsy, prostate dissection, and fluorescence tissue identification.
- Dependent on dissection microscopy, centrifuges, pipettes, and temperature-controlled water baths for tissue processing.
- Necessitates standardized organoid medium supplemented with androgen R1881 and Y-27632 ROCK inhibitor for consistent culture.
- Requires adaptation of digestion and trituration steps based on tumor tissue consistency from different GEMMs.
- Limited by the need for fresh tissue processing post-necropsy to maintain organoid viability and genetic fidelity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:30
En Bloc Male Urogenital System Extraction
1:08
Pelvic Lymph Node, Spleen, Liver, Kidney, Lung, Tibia, and Femur Extraction
3:16
Prostate Tumor Dissection
5:17
Tumor Tissue Digestion
6:07
Matrix Dome Plating
7:07
Results: Representative Solid and Fluid-filled Tumor Characterization
8:28
Conclusion
