Minimal arka plan saçılma ile Macromoleküler X-ışını Kristalografi için bir hepsi bir arada örnek tutucu
July 6th, 2019
Makromoleküler X-ışını Kristalografi için yeni bir örnek tutucu ile birlikte uygun bir kullanım Protokolü sunulmaktadır. Sistem, kristal büyümesi, kristal ıslanmasına ve herhangi bir kristal manipülasyon veya montaj gerek kalmadan her iki, ortam ve kriyojenik sıcaklık içinde situ dikesasyon veri toplama sağlar.
Bu örnek tutucu kristalleri büyütmek ve X-ışını kırınım verilerini toplamak için kullanılabilir. Bu örnek tutucu, MX topluluğunda yaygın olarak kullanılan 24 kuyulu plakaların kullanımı için yapılmıştır. Çok önemli olan, manipülasyona gerek olmamasıdır.
Burada açıklanan bu yönleri içeren bir örnek tutucu daha önce yoktu. Bir şey görmek her zaman sadece bu konuda okuma ktan çok daha iyidir. Videoyu izleyerek, olası bir kullanıcı yeni örnek sahibinin özelliklerini ve inceliklerini hemen kavrayabilir.
Başlamak için, nemli, tüy bırakmayan bir bez kullanarak temiz ve tozsuz bir yüzey oluşturun. Kutusundan bir örnek tutucu alın ve yavaşça arka coc folyo hasar veya istenmeyen delinme önlemek için temiz yüzeye bakan, sarı folyo kadar yerleştirin. Yaygın olarak kullanılan kapak slaytlar üzerinde yapılacak gibi sarı folyo üzerinde kristalizasyon damla ayarlayın.
Bir pipet kullanarak folyo herhangi bir yırtık veya piercing önlemek için yavaşça damla yerleştirin. Tip 2 ve tip 3 örnek tutucularda en fazla iki damla önerilir. Tip 1 numune tutucuya en fazla üç damla yerleştirilebilir.
Numune tutucuyu ters çevirin ve 24 kuyulu Linbro tarzı bir plakanın önceden yağlanmış bir boşluğuna yerleştirin. En uygun konumuna getirmek için numune tutucunun konumlandırma yardımcılarını kullanın. İstenmeyen buharlaşmayı önlemek için numune tutucunun doğru konumunu sağlayın.
Kristalizasyon plakasını polarize olmadan veya polarize olmadan iletim ışığı mikroskobu altına yerleştirerek, deneyde herhangi bir bozulma olmadan kristal büyümesini izleyin. Bir iletim ışık mikroskobu altında kriyokoruma gerçekleştirin. Hafifçe ince bir kanula kullanarak dış COC folyo delin.
İç sarı folyo dokunulmamış kalır emin olun. Delik manipüle edilecek damlanın hemen yanında olmalı. Dürttü deliğe ince bir kağıt fitil takın.
Sarı poliimid folyoya değene kadar fitili dikkatlice ileri doğru itin. Fitili delikli folyoyla temas halinde tutun. Fitil tüm aşırı çözeltiyi emecek.
Tam sıvı giderilmesi için gereken süre çözeltilerin viskozitesi ve anne likörü bileşimine bağlıdır. Tüm sıvı emildikten sonra, yavaşça kağıt fitil çekin. Anne likörü çıkarıldıktan sonra görülemeyebilir, çünkü damla konumunu unutmayın.
Aynı delikten ekstrüzyonlu bir uç kullanarak küçük hacimli kriyo-koruyucu çözelti uygulamak için standart bir pipet alın. Kendi kendini iyileştiren COC folyosunu yeniden mühürlemek için, korunan bir parmağı yavaşça deliğe bir saniye yerleştirin ve delinme boyunca kaydırın. Yüksek sıcaklık ile birlikte hafif basınç çok büyük olmayan deliklerin resealing teşvik edecektir.
Bir reaksiyon tüpünde istenilen konsantrasyonda anne liköründe ligand çözün. Çözünmez parçacıkları çıkarmak için çözeltiyi 12,000 kez 10 dakika döndürün. Gerekirse sıcaklık kontrollü bir santrifüj kullanın.
CoC folyo ile poliimid film arasındaki boşluğa en fazla üç mikrolitre ligand içeren çözelti yerleştirin. Kendi kendini iyileştiren COC folyosunu yeniden mühürlemek için, korunan bir parmağı yavaşça deliğe bir saniye yerleştirin ve delinme boyunca kaydırın. Membran boyunca difüzyon için izin vermek için bir süre için deney kuluçka.
Islatma süresi, difüzyon çözeltisinin ve bileşenlerinin viskozitesine bağlıdır. Daha sonra farklı ligands ıslatmak için ligand ıslatma adımları birden çok kez tekrarlayın. Çözücü saçılımı en aza indirmek için, veri toplama dan önce fazla çözümü çıkarın.
Önceden belirlenmiş koşullara sahip, kararlı, nem kontrollü bir ışın hattı ortamı sağlayın. Ortam sıcaklığında situ kırınım veri toplama gerçekleştirmek için, hafifçe forseps kullanarak belirlenen noktada şeffaf COC folyo kaldırın ve soyma. Şimdi numune tutucuyu yavaşça boşluğundan kaldırın ve hemen önceden hazırlanmış manyetik numune tutucu tabanına takın.
Bu adım için tutkal gerekmez. Numune tutucunun taban içinde doğru konumlandırMasını sağlamak için hafif basınç uygulayın. Çıkarılabilir dış halkası olan numune tutucular için, dış halkaya tutunarak hafif basınç uygulayın ve belirlenen mola noktalarında kırın.
Örnek artık merkezleme ve kırınım veri toplama için hazırdır. Numune tutucuyu bir ışın çizgisi goniometreye monte edin ve tutucunun doğru konumlandırIlmesini sağlayın. Goniyometre geometrisine bağlı olarak, numune tutucu kırınım deneyi sırasında herhangi bir gölgeleme neden olmadan 160 dereceye kadar döndürülebilir.
Bir kağıt fitil kullanın ve yavaşça aşırı anne likör kaldırmak için arka sarı poliimid folyo dokunun. Örnek artık merkezleme ve kırınım veri toplama için hazırdır. Ortam sıcaklığı için yapılan kriyojenik sıcaklıkta yerinde kırınım veri toplama için hazırlayın, sonra sıvı nitrojen içine örnek dalma ve bir OMURGA uyumlu şişe içine aktarın.
Örnek tutucu tip 2 ve 3'ün geometrisi, robot destekli numune montajı için kullanılabilen standart Omurga numune şişelerine aktarılmasını sağlar. Örnek tutucu tip 1 ve tip 2, 24 kuyulu Linbro tarzı bir tabağa sığacak şekilde tasarlanmıştır. Her bir numune tutucu, kuyunun kenarına en iyi konumlandırmayı sağlamak için dış kenarın her iki tarafında konumlandırma yardımcıları içerir.
293 Kelvin'de 500 mikrolitre ana likörüne karşı bir düşüşü dengelemek için tip 1 numune tutucuile birlikte 24 kuyuluklinbro tarzı bir plaka kullanılmıştır. Polarize veya polarize olmayan bir iletim ışığı mikroskobu kullanılarak beş saat sonra 40 ila 50 mikron kristaller gözlendi. Tavuk yumurtası-beyaz lysozyme kristalli bir numune tutucu, HZB-MX ışın hattı 14.3'te nem kontrollü bir hava akımına yerleştirildi.
Tipik bir kırınım görüntüsü burada gösterilmiştir. Kırınım görüntüsünde yükseltilmiş arka plan saçılımı algılanamamıştır. Poliimid folyo kontaminasyonlarının önlenmesi çok önemlidir.
Ayrıca, numune tutucunun doğru bir şekilde konumlandırılması ve kristal manipülasyonunun dikkatle yapılması önemlidir. Numune tutucu, mikromoleküler kristalografinin en önemli adımlarından biri olan çok hassas kristallerin işlenmesine olanak tanır. Kullanımı, numuneyi yok etme şansını büyük ölçüde azaltır.
Genel Bakış
Makromoleküler X-ışını kristalografisi için yeni bir numune tutucu tanıtılmakta olup, kristal büyümesini ve çeşitli sıcaklıklarda kristal manipülasyonu olmadan yerinde kırınım verisi toplamaya olanak tanımaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Makromoleküler X-ışını kristalografisi
- Kristal büyüme teknikleri
- Kırınım verisi toplanması
Arka Plan
- Geleneksel yöntemler, hataların ortaya çıkmasına neden olabilecek kristal manipülasyonu gerektirir.
- Mevcut numune tutucuları, deneyler sırasında kolay elleçlemeye izin vermez.
- MX topluluğunda kristalizasyon için yaygın olarak 24 kuyuluk plakalar kullanılır.
- Kristal büyümesinin rahatsız edilmeden izlenmesi, doğru sonuçlar için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- Kristal büyüme ve veri toplama sürecini basitleştiren bir numune tutucusunu sunmak.
- Deneyler sırasında kristal manipülasyonu ihtiyacını ortadan kaldırmak.
- Numune tutucusunun etkili kullanımı için bir protokol sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Numune tutucusunun temiz bir yüzeyi için hazırlık.
- Kristallizasyon damlalarının tutucuya yerleştirilmesi.
- Kristal büyümesinin bir geçiş ışık mikroskobu kullanılarak izlenmesi.
- Ortam ve kriyojenik sıcaklıklarda yerinde kırınım verisi toplanması.
Ana Sonuçlar
- Minimal manipülasyon ile başarılı kristal büyümesi gözlendi.
- Veri toplama, arka plan dağılımı olmadan net kırınım görüntüleri üretti.
- Standart 24 kuyuluk plakalar ile uyumlu olarak tasarlanmış numune tutucuları.
- Etkili kriyokoruma ve ligand ıslatma protokolleri kuruldu.
Sonuçlar
- Yeni numune tutucu, X-ışını kristalografisi deneylerinin kolaylığını önemli ölçüde artırır.
- Kristallezasyon süreçlerinin verimli izlenmesine ve manipülasyonuna izin verir.
- Bu yenilik, toplanan kırınım verilerinin kalitesini artırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Macromolecular X-ray crystallography remains a cornerstone for high-resolution structural biology in drug discovery, yet fragile crystal handling introduces significant risk of sample loss and data degradation. This all-in-one sample holder minimizes mechanical intervention during crystal growth, ligand soaking, cryoprotection, and data collection, thereby increasing the likelihood of obtaining usable diffraction data from delicate macromolecular crystals. By reducing handling-induced damage, the tool supports more reliable target structure determination, a critical early step in structure-guided drug design and lead optimization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables structural characterization of fragile macromolecular targets without inducing lattice damage during manipulation.
- Operational Value: Reduces crystal loss during ligand soaking and cryoprotection steps, improving success rates in early-stage target de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports in situ monitoring of crystal growth and ligand diffusion under controlled conditions, enabling real-time assessment of compound binding.
- Operational Value: Eliminates need for crystal transfer between plates or mounts, streamlining workflow for high-throughput crystallization screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides structural data from native-state crystals preserved through minimal handling, enhancing confidence in target-ligand interaction models.
- Operational Value: Compatible with standard 24-well Linbro plates and SPINE vials, facilitating integration into automated crystal mounting and beamline pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
The sample holder supports a seamless workflow from crystallization drop setup to in situ X-ray diffraction data collection at ambient or cryogenic temperatures, reducing transfer steps between discovery and structural validation stages.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing via structural observation of ligand-bound states without disrupting crystal integrity during screening.
- Screening: Provides a standardized, reusable platform for drop setup and monitoring, improving reproducibility across crystallization trials.
- Analytics: Yields low-background diffraction images suitable for quantitative electron density mapping and ligand pose validation.
- Translational Research: Maintains crystal viability from ambient screening to cryogenic data collection, supporting continuous structural analysis.
- Enterprise Reuse: Designed for repeated use across multiple targets and campaigns, reducing consumable waste and setup time in shared crystallography facilities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases confidence in structural data by minimizing handling-induced artifacts and preserving native crystal packing.
- Operational Value: Standardizes crystal manipulation steps, reducing variability and training burden across multidisciplinary teams.
- Strategic Value: Lowers failure rate in structure determination projects, improving return on investment in target validation efforts.
- Portfolio Impact: Enables faster go/no-go decisions based on reliable structural data, reducing late-stage attrition due to incorrect target assumptions.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with micropipette techniques and fluorescence- or transmission-light microscopy for drop setup and monitoring.
- Dependent on access to beamlines equipped for in situ diffraction and humidity-controlled environments.
- Necessitates standardized training to ensure consistent foil piercing, wick use, and resealing procedures across users.
- Must account for variations in mother liquor viscosity when optimizing cryoprotectant and ligand soaking durations.
- Limited to compatible plate formats (e.g., 24-well Linbro-style) and may require adaptation for other crystallization screening platforms.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:37
Setting up Crystallization Drops and Observing Crystal Growth
1:56
Crystal Manipulation
4:23
In Situ Diffraction Data Collection at Ambient Temperature and at Cryogenic Temperature
6:20
Results: Novel Sample Holder in Macromolecular X-Ray Crystallography for Crystal Growth, Crystal Manipulation, and X-Ray Diffraction Data Collection
7:23
Conclusion
