In Vitro Bath Fermantasyon Sistemleri Kullanılarak Endobiyotikler ve İnsan Bağırsak Mikrobiyotları Arasındaki Etkileşimlerin Analizi
August 23rd, 2019
Burada açıklanan in vitro toplu fermantasyon sistemleri kullanarak endobiyotikler ve insan bağırsak mikrobiyotları arasındaki etkileşimleri araştırmak için bir protokoldür.
Protokolümüz yaygın olarak endobiyotikler ve insan bağırsak mikrobiyotası arasındaki etkileşimlerin yüksek iş ve hızlı tarama için kullanılabilir. Düşük maliyet ve konak metabolizmasından girişim etkileri kaçınma. Bu işlem tanıda kullanılma potansiyeline sahiptir.
İlk olarak, BIF EPS çözün ve litre başına sekiz gram konsantrasyon yapmak için bir manyetik karıştırıcı üzerinde sıcak suda ayrı ayrı nişasta. Hazırlanan temel kültür ortamı, VI, kültür VI BIF çözüm yapmak için BIF EPS çözüm 100 mililitre ekleyin. Kültür VI nişasta çözüm yapmak için nişasta çözeltisi 100 mililitre ekleyin.
Otoklav karbon kaynağı ile iki medya, ve bir kontrol olarak karbon kaynağı olmadan orta, 121 derece santigrat dakika için. Onları oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve haymen ve sistein ekleyin. Her ortamdan beş mililitrelik bir alt numuneyi kültür tüplerine aktarın.
Ve anaerobik bir kuluçka makinesinde saklayın. Kalan ortamı dört santigrat derecede saklayın. İnsan dışkı örneği hazırlamak için, bir cam kabın pH yedi 0.1 molar anaerobik PBS 10 mililitre içine taze dışkı örnek bir gram aktarın.
Sonra bir bulamaç elde etmek için karıştırmak için bir cam çubuk kullanın. Bir anaerobik odada, üç hazırlanan fermantasyon medya içine filtrelenmiş dışkı bulamaç 500 mikrolitre ekleyin, ayrı ayrı. Sonra, 37 derecede kuluçkaya yat.
24 saat ve 48 saat sonra, anaerobik odada fermente örnekleri iki mililitre toplamak. Ve sonra odanın dışında 6000 kez G'de üç dakika santrifüj. Süpernatanları polisakkarit yıkım analizi ve kısa zincirli yağ asidi ölçümleri için kullanılacak yeni santrifüj tüplerine dikkatlice aktarın.
Santrifüj peletlerini 80 derecede saklayın. Her önceden kaplanmış silika jel 60 TLC alüminyum plaka üzerine fermente supernatants 0,2 mikrolitre yükleyin ve yayMak için girdap. Sonra kuruması için sıcak hava ile bir saç kurutma makinesi kullanın.
Örneklenmiş plakaların bir ucunu 20 mililitre formik asit:n-butanol:su çözeltisine, elektroforez neredeyse diğer uca kadar uzatAna kadar birkaç dakika batırın. Sonra ponpile plakaları çıkarmak ve bir saç kurutma makinesi ile kuru. Sonra boyamak için iki dakika orsinol reaktif plakaları ıslatın.
Ve tekrar kuru. Üç dakika ısıtmak için 120 santigrat derece bir fırına plakaları aktarın. Daha sonra TLC bantlarını ölçerek EPS'nin bozulmasını değerlendirmek için plakanın fotoğraflarını çekin.
EPS'nin SCFA üretimi üzerindeki etkilerini incelemek için, iki mililitrelik santrifüj tüplere bir mililitre fermente süpernatant ekleyin ve her numuneye metafosforik asitin yüzde 25 ağırlık/hacim yüzdesi 0,2 mililitre ekleyin. Girdap iyice çözümleri karıştırmak için. Karışımları 13,000 kez G'de 20 dakika santrifüj edin.
Bu arada, tüplerde 120 milimolar asetik, propiyonik, bütirik, izobütirik, valerik ve izovalerik asitlerin çözeltilerini hazırlayın. Daha sonra her bir hazırlanan asit bir mililitre ekleyin 1.2 mililitre içeren 25 ağırlık / hacim yüzde metafosforik asit. Ve standart kokteyller olarak gaz kromatografi aletiörnek şişe içine yükleyin.
Tüpleri santrifüjden çıkarve süpernatantları taze tüplere aktarın. Gaz kromatografisi analizi için süpernatantları yeni tüplere filtrelemek için 0,22 mikron filtre ile donatılmış bir şırınga kullanın. Bu çalışmada, pyg plakalarında bifidobacterium longum kültürlerinde 72 saat anaerobik kuluçka sonrası mukoid EPS üretimi gözlendi.
Kültür kazımalarının santrifüjünün, ardından etanol çökemi ve kurutulması, selüloz benzeri EPS'lerin toplanmasıyla sonuçlandı. TLC analizi, insan dışkı mikrobiyotası tarafından nişasta nın bozulma oranının BIF EPS'den daha hızlı olduğunu ortaya koymuştur. Ana Koordinat Analizi kültür VI BIF gösterir, ve kültür VI nişasta grupları, birbirinden ayrı kümelenmiş, EPS ve nişasta durumu farklı insan dışkı bakteri toplulukları şekil gösteren.
Etki boyutu üzerine Lineer Ayırıcı Analiz, collinsella, coprococcus, parabacteroides ve rhodopseudomonas cinsinin vi nişasta örneklerine göre kültür VI BIF örneklerinde anlamlı olarak daha bol olduğunu göstermektedir. Ayrıca, GC ölçümleri fermantasyon kültürlerinden ölçülen SCFA'ları asetik, propiyonik, izobütirik, bütirik, izovalerik ve valerik asitleri göstermektedir. 24 saat 48 saat fermantasyondan sonra, altı SCFA konsantrasyonundan beşi benzerdi ve kültür VI BIF, kültür VI nişastası ve kültür VI grupları arasında istatistiksel olarak farklı değildi.
Ancak, proprionik asit konsantrasyonları kültür VI BIF grubunda kültür VI nişasta grubuna göre anlamlı olarak daha yüksekti, fermantasyon 48 saat sonra. Anaerobik koşullar altında bu deneyi yapın ve sonra en kısa sürede bir anaerobik kuluçka içine sabit örnekleri aktarın. Bazı TLC reaktifleri tehlikelidir.
Onları kullanırken dikkatli olmalısın.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, in vitro toplu fermantasyon sistemleri kullanarak endobiotikler ve insan bağırsak mikrobiyal ekosistemleri arasındaki etkileşimleri araştırır. Yüksek verimli ve hızlı tarama için tasarlanmış olup, konak metabolizmasından gelen müdahaleleri en aza indirir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Bağırsak Sağlığı
- Metabolomik
Arka Plan
- Endobiotikler insan sağlığında önemli bir rol oynar.
- Bağırsak mikrobiyal ekosistem metabolik süreçleri önemli ölçüde etkiler.
- Bu etkileşimleri anlamak tanı koymaya yardımcı olabilir.
- Mevcut yöntemler konak metabolizması müdahalesi ile sınırlı olabilir.
Çalışmanın Amacı
- Endobiotik-mikrobiyal etkileşimler çalışması için bir protokol geliştirmek.
- Bu etkileşimlerin yüksek verimli taramasını sağlamak.
- Araştırma için düşük maliyetli bir alternatif sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- BIF EPS ve nişastayı sıcak suda çözmek.
- Fermantasyon için kültür ortamının hazırlanması.
- Etkileşim çalışmaları için toplu fermantasyon sistemlerinin kullanılması.
- Endobiotiklerin bağırsak mikrobiyal ekosistem üzerindeki etkilerinin izlenmesi.
Ana Sonuçlar
- BIF EPS ve nişasta çözeltilerinin başarılı bir şekilde hazırlanması.
- Güvenilir bir fermantasyon protokolünün kurulması.
- Protokolün tanı koyma potansiyelinin gösterilmesi.
- Endobiotikler ve mikrobiyal ekosistem arasındaki etkileşimlere ilişkin görüşler.
Sonuçlar
- Protokol, mikrobiyal ekosistem araştırmaları için değerli bir araç sunar.
- Metabolik etkileşimlerin anlaşılmasına yardımcı olabilir.
- Gelecekteki uygulamalar tanı koyma yeteneklerini artırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-throughput, low-cost in vitro screening of endobiotic-gut microbiota interactions, reducing reliance on animal models and minimizing host metabolism interference. It supports early-stage target validation by providing quantitative data on microbial community shifts and metabolite production, which are critical for de-risking microbiome-modulating therapeutics. The approach is directly applicable to preclinical discovery workflows where mechanistic understanding of compound-microbiota effects informs lead selection and portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of how endobiotics like prebiotics or drugs modulate human gut bacterial communities, supporting target hypothesis testing.
- Operational Value: Uses accessible methods such as 16S rRNA sequencing and SCFA quantification to generate reproducible, mechanistically informative data.
- Predictive Value: Differentiates microbial responses to structurally distinct carbohydrates (e.g., EPS vs. starch), aiding in structure-activity relationship assessments.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides standardized anaerobic fermentation conditions for consistent evaluation of microbiota-mediated compound degradation.
- Operational Value: Compatible with high-throughput formats due to simple sample preparation and scalable readouts like TLC and GC.
- Assay Readiness: Generates quantifiable outputs (SCFA profiles, community shifts) that can be used to compare compound effects across screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Uses human fecal inoculum, enhancing relevance to human physiology compared to animal models.
- Mechanistic De-risking: Identifies specific microbial responders (e.g., Collinsella, Coprococcus) to endobiotics, supporting biomarker-linked mechanism of action.
- Preclinical Continuity: Enables dose- and time-dependent profiling (24h/48h) to inform safety and efficacy windows in later models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, particularly for microbiome-active compounds where understanding microbiota-mediated metabolism is essential for predicting in vivo behavior.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven screening of endobiotics by linking compound exposure to measurable changes in microbial composition and function.
- Screening: Enables rapid assessment of microbiota interactions using TLC for polysaccharide degradation and GC for SCFA quantification as orthogonal readouts.
- Analytics: Generates multivariate data (16S sequencing, SCFA concentrations) that allow statistical comparison of treatment effects and identification of significant shifts.
- Translational Research: Uses human-derived microbiota, improving predictive confidence for clinical translation over murine models.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to various endobiotics (drugs, prebiotics, polysaccharides), making it a reusable platform across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in microbiota-endobiotic interactions through direct observation of degradation patterns and microbial responders.
- Operational Value: Low cost, anaerobic workflow, and standardized sampling improve reproducibility and cross-lab comparability.
- Strategic Value: Enables earlier go/no-go decisions by flagging microbiota-mediated metabolism that could alter drug efficacy or toxicity.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on their impact on beneficial microbiota and SCFA profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in anaerobic microbiology and sterile technique to maintain sample integrity.
- Needs access to TLC plates, gas chromatography, and 16S rRNA sequencing infrastructure for full readout panel.
- Standardization across labs requires consistent fecal donor processing and anaerobic incubation conditions.
- Adaptation to other endobiotics necessitates solubility and stability testing under fermentation conditions.
- Practical limitations include variability in donor microbiota and the need for careful handling of hazardous TLC reagents (e.g., orcinol, formic acid).
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:29
Preparation of Fermentation Medium and Human Fecal Sample
1:48
In Vitro Batch Fermentation
2:33
EPS Degradation by Human Fecal Microbiota
3:29
Effects of EPS on SCFA (Short-chain Fatty Acids) Production by Human Intestinal Microbiota
4:41
Results: Degradation by Fermentation
6:24
Conclusion
