In Vitro Bath Fermantasyon Sistemleri Kullanılarak Endobiyotikler ve İnsan Bağırsak Mikrobiyotları Arasındaki Etkileşimlerin Analizi
23 Ağustos 2019
Burada açıklanan in vitro toplu fermantasyon sistemleri kullanarak endobiyotikler ve insan bağırsak mikrobiyotları arasındaki etkileşimleri araştırmak için bir protokoldür.
Protokolümüz yaygın olarak endobiyotikler ve insan bağırsak mikrobiyotası arasındaki etkileşimlerin yüksek iş ve hızlı tarama için kullanılabilir. Düşük maliyet ve konak metabolizmasından girişim etkileri kaçınma. Bu işlem tanıda kullanılma potansiyeline sahiptir.
İlk olarak, BIF EPS çözün ve litre başına sekiz gram konsantrasyon yapmak için bir manyetik karıştırıcı üzerinde sıcak suda ayrı ayrı nişasta. Hazırlanan temel kültür ortamı, VI, kültür VI BIF çözüm yapmak için BIF EPS çözüm 100 mililitre ekleyin. Kültür VI nişasta çözüm yapmak için nişasta çözeltisi 100 mililitre ekleyin.
Otoklav karbon kaynağı ile iki medya, ve bir kontrol olarak karbon kaynağı olmadan orta, 121 derece santigrat dakika için. Onları oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve haymen ve sistein ekleyin. Her ortamdan beş mililitrelik bir alt numuneyi kültür tüplerine aktarın.
Ve anaerobik bir kuluçka makinesinde saklayın. Kalan ortamı dört santigrat derecede saklayın. İnsan dışkı örneği hazırlamak için, bir cam kabın pH yedi 0.1 molar anaerobik PBS 10 mililitre içine taze dışkı örnek bir gram aktarın.
Sonra bir bulamaç elde etmek için karıştırmak için bir cam çubuk kullanın. Bir anaerobik odada, üç hazırlanan fermantasyon medya içine filtrelenmiş dışkı bulamaç 500 mikrolitre ekleyin, ayrı ayrı. Sonra, 37 derecede kuluçkaya yat.
24 saat ve 48 saat sonra, anaerobik odada fermente örnekleri iki mililitre toplamak. Ve sonra odanın dışında 6000 kez G'de üç dakika santrifüj. Süpernatanları polisakkarit yıkım analizi ve kısa zincirli yağ asidi ölçümleri için kullanılacak yeni santrifüj tüplerine dikkatlice aktarın.
Santrifüj peletlerini 80 derecede saklayın. Her önceden kaplanmış silika jel 60 TLC alüminyum plaka üzerine fermente supernatants 0,2 mikrolitre yükleyin ve yayMak için girdap. Sonra kuruması için sıcak hava ile bir saç kurutma makinesi kullanın.
Örneklenmiş plakaların bir ucunu 20 mililitre formik asit:n-butanol:su çözeltisine, elektroforez neredeyse diğer uca kadar uzatAna kadar birkaç dakika batırın. Sonra ponpile plakaları çıkarmak ve bir saç kurutma makinesi ile kuru. Sonra boyamak için iki dakika orsinol reaktif plakaları ıslatın.
Ve tekrar kuru. Üç dakika ısıtmak için 120 santigrat derece bir fırına plakaları aktarın. Daha sonra TLC bantlarını ölçerek EPS'nin bozulmasını değerlendirmek için plakanın fotoğraflarını çekin.
EPS'nin SCFA üretimi üzerindeki etkilerini incelemek için, iki mililitrelik santrifüj tüplere bir mililitre fermente süpernatant ekleyin ve her numuneye metafosforik asitin yüzde 25 ağırlık/hacim yüzdesi 0,2 mililitre ekleyin. Girdap iyice çözümleri karıştırmak için. Karışımları 13,000 kez G'de 20 dakika santrifüj edin.
Bu arada, tüplerde 120 milimolar asetik, propiyonik, bütirik, izobütirik, valerik ve izovalerik asitlerin çözeltilerini hazırlayın. Daha sonra her bir hazırlanan asit bir mililitre ekleyin 1.2 mililitre içeren 25 ağırlık / hacim yüzde metafosforik asit. Ve standart kokteyller olarak gaz kromatografi aletiörnek şişe içine yükleyin.
Tüpleri santrifüjden çıkarve süpernatantları taze tüplere aktarın. Gaz kromatografisi analizi için süpernatantları yeni tüplere filtrelemek için 0,22 mikron filtre ile donatılmış bir şırınga kullanın. Bu çalışmada, pyg plakalarında bifidobacterium longum kültürlerinde 72 saat anaerobik kuluçka sonrası mukoid EPS üretimi gözlendi.
Kültür kazımalarının santrifüjünün, ardından etanol çökemi ve kurutulması, selüloz benzeri EPS'lerin toplanmasıyla sonuçlandı. TLC analizi, insan dışkı mikrobiyotası tarafından nişasta nın bozulma oranının BIF EPS'den daha hızlı olduğunu ortaya koymuştur. Ana Koordinat Analizi kültür VI BIF gösterir, ve kültür VI nişasta grupları, birbirinden ayrı kümelenmiş, EPS ve nişasta durumu farklı insan dışkı bakteri toplulukları şekil gösteren.
Etki boyutu üzerine Lineer Ayırıcı Analiz, collinsella, coprococcus, parabacteroides ve rhodopseudomonas cinsinin vi nişasta örneklerine göre kültür VI BIF örneklerinde anlamlı olarak daha bol olduğunu göstermektedir. Ayrıca, GC ölçümleri fermantasyon kültürlerinden ölçülen SCFA'ları asetik, propiyonik, izobütirik, bütirik, izovalerik ve valerik asitleri göstermektedir. 24 saat 48 saat fermantasyondan sonra, altı SCFA konsantrasyonundan beşi benzerdi ve kültür VI BIF, kültür VI nişastası ve kültür VI grupları arasında istatistiksel olarak farklı değildi.
Ancak, proprionik asit konsantrasyonları kültür VI BIF grubunda kültür VI nişasta grubuna göre anlamlı olarak daha yüksekti, fermantasyon 48 saat sonra. Anaerobik koşullar altında bu deneyi yapın ve sonra en kısa sürede bir anaerobik kuluçka içine sabit örnekleri aktarın. Bazı TLC reaktifleri tehlikelidir.
Onları kullanırken dikkatli olmalısın.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, in vitro kesikli fermantasyon sistemleri kullanarak endobiyotikler ve insan bağırsak mikrobiyotası arasındaki etkileşimleri incelemektedir. Konak metabolizmasından kaynaklanan girişimleri minimize ederek, yüksek kapasiteli ve hızlı tarama için tasarlanmıştır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Bağırsak Sağlığı
- Metabolomik
Arka Plan
- Endobiyotikler insan sağlığında kritik bir rol oynar.
- Bağırsak mikrobiyotası metabolik süreçleri önemli ölçüde etkiler.
- Bu etkileşimlerin anlaşılması tanıya yardımcı olabilir.
- Mevcut yöntemler, konakçı metabolizması girişimi nedeniyle sınırlı kalabilir.
Çalışmanın Amacı
- Endobiyotik-mikrobiyota etkileşimlerini incelemek için bir protokol geliştirmek.
- Bu etkileşimlerin yüksek çıktılı taramasını mümkün kılmak.
- Araştırmalar için düşük maliyetli bir alternatif sunmak.
Kullanılan Yöntemler
- BIF EPS ve nişastanın sıcak suda çözündürülmesi.
- Fermentasyon için kültür ortamlarının hazırlanması.
- Etkileşim çalışmaları için kesikli (batch) fermentasyon sistemlerinin kullanılması.
- Endobiyotiklerin bağırsak mikrobiyotası üzerindeki etkilerinin izlenmesi.
Temel Sonuçlar
- BIF EPS ve nişasta çözeltilerinin başarılı bir şekilde hazırlanması.
- Güvenilir bir fermantasyon protokolünün oluşturulması.
- Protokolün tanısal potansiyelinin gösterilmesi.
- Endobiyotikler ve mikrobiyota arasındaki etkileşimlere dair içgörüler.
Sonuçlar
- Bu protokol, mikrobiyota araştırmaları için değerli bir araç sunmaktadır.
- Metabolik etkileşimlerin anlaşılmasını kolaylaştırabilir.
- Gelecekteki uygulamalar, tanı kapasitesini artırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulanabilirlik ve Önem
Bu protokol, endobiyotik-bağırsak mikrobiyota etkileşimlerinin yüksek verimli ve düşük maliyetli in vitro taramasını sağlayarak hayvan modellerine olan bağımlılığı azaltır ve konak metabolizması girişimini minimize eder. Mikrobiyal topluluk değişimleri ve metabolit üretimi hakkında kantitatif veriler sağlayarak, mikrobiyom modüle eden terapötiklerin risklerinin azaltılması için kritik olan erken aşama hedef doğrulamasını destekler. Bu yaklaşım, bileşik-mikrobiyota etkilerinin mekanistik anlayışının öncü bileşik seçimi ve portföy kararlarını bilgilendirdiği preklinik keşif iş akışlarına doğrudan uygulanabilirdir.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Prebiyotikler veya ilaçlar gibi endobiyotiklerin insan bağırsak bakteri topluluklarını nasıl modüle ettiğinin sorgulanmasına olanak tanıyarak hedef hipotez testlerini destekler.
- Operasyonel Değer: Tekrarlanabilir ve mekanistik olarak bilgilendirici veriler üretmek için 16S rRNA dizileme ve SCFA kantifikasyonu gibi erişilebilir yöntemler kullanır.
- Öngörücü Değer: Yapısal olarak farklı karbonhidratlara (örneğin, EPS ve nişasta) karşı mikrobiyal yanıtları ayırt ederek yapı-aktivite ilişkisi değerlendirmelerine yardımcı olur.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Mikrobiyota aracılı bileşik yıkımının tutarlı bir şekilde değerlendirilmesi için standardize anaerobik fermantasyon koşulları sağlar.
- Operasyonel Değer: Basit numune hazırlama süreçleri ve TLC ile GC gibi ölçeklenebilir okumalar sayesinde yüksek kapasiteli formatlarla uyumludur.
- Analiz Hazırlığı: Tarama kampanyaları boyunca bileşik etkilerini karşılaştırmak için kullanılabilecek nicel çıktılar (SCFA profilleri, topluluk değişimleri) üretir.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Değer: Hayvan modellerine kıyasla insan fizyolojisiyle olan ilgiyi artıran insan fekal inokülumu kullanır.
- Mekanistik Risk Azaltma: Endobiyotiklere yanıt veren spesifik mikrobiyal yanıtlayıcıları (örneğin, Collinsella, Coprococcus) belirleyerek biyobelirteç bağlantılı etki mekanizmasını destekler.
- Preklinik Süreklilik: Daha sonraki modellerde güvenlik ve etkinlik pencerelerini belirlemek için doz ve zamana bağlı profillemeye (24h/48h) olanak tanır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef doğrulamadan öncü bileşik optimizasyonuna kadar uzanan keşif sürecine uygundur; özellikle de mikrobiyota aracılı metabolizmanın anlaşılmasının in vivo davranışların öngörülmesi için temel olduğu mikrobiyom-aktif bileşikler için geçerlidir.
- Keşif Biyolojisi: Bileşik maruziyetini, mikrobiyel kompozisyon ve fonksiyondaki ölçülebilir değişikliklerle ilişkilendirerek endobiyotiklerin hipotez odaklı taramasını destekler.
- Tarama: Polisakkarit bozunması için TLC ve SCFA miktar tayini için GC'yi ortogonal okumalar olarak kullanarak mikrobiyota etkileşimlerinin hızlıca değerlendirilmesine olanak tanır.
- Analitik: Tedavi etkilerinin istatistiksel karşılaştırmasına ve anlamlı kaymaların tanımlanmasına izin veren çok değişkenli veriler (16S sekanslama, SCFA konsantrasyonları) üretir.
- Translasyonel Araştırma: İnsan kaynaklı mikrobiyota kullanarak, fare modellerine kıyasla klinik translasyon için öngörü güvenini artırır.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Protokol çeşitli endobiyotiklere (ilaçlar, prebiyotikler, polisakkaritler) uyarlanabilir olduğundan, farklı terapötik alanlarda yeniden kullanılabilir bir platform sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Degradasyon modellerinin ve mikrobiyal yanıt verenlerin doğrudan gözlemlenmesi yoluyla, mikrobiyota-endobiyotik etkileşimlerindeki mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Düşük maliyet, anaerobik iş akışı ve standartlaştırılmış örnekleme, tekrarlanabilirliği ve laboratuvarlar arası karşılaştırılabilirliği artırır.
- Stratejik Değer: İlaç etkinliğini veya toksisitesini değiştirebilecek mikrobiyota aracılı metabolizmayı işaretleyerek, daha erken aşamada devam/durdur kararları alınmasını sağlar.
- Portföy Etkisi: Bileşiklerin faydalı mikrobiyota ve SCFA profilleri üzerindeki etkilerine dayalı olarak, riske göre ayarlanmış önceliklendirmeyi destekler.
Uygulama Hususları
- Numune bütünlüğünü korumak için anaerobik mikrobiyoloji ve steril teknik konusunda uzmanlık gereklidir.
- Tam okuma paneli için TLC plakalarına, gaz kromatografisine ve 16S rRNA dizileme altyapısına erişim gereklidir.
- Laboratuvarlar arası standardizasyon, tutarlı fekal donör işleme ve anaerobik inkübasyon koşulları gerektirir.
- Diğer endobiyotiklere adaptasyon, fermantasyon koşulları altında çözünürlük ve stabilite testlerini gerektirir.
- Pratik kısıtlamalar arasında donör mikrobiyotasındaki değişkenlik ve tehlikeli TLC reaktiflerinin (örneğin orsinol, formik asit) dikkatli kullanımı yer almaktadır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:04
Title
0:29
Preparation of Fermentation Medium and Human Fecal Sample
1:48
In Vitro Batch Fermentation
2:33
EPS Degradation by Human Fecal Microbiota
3:29
Effects of EPS on SCFA (Short-chain Fatty Acids) Production by Human Intestinal Microbiota
4:41
Results: Degradation by Fermentation
6:24
Conclusion
