Name: Makrofajlar tarafından apoptotik thymocyte engulfment deneysel Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Öğrenin apoptotik timositlerin makrofajlar tarafından fagositozunu analiz etme yöntemini. Bu protokol, C57BL/6 farelerinden hücre izolasyonu ve efferositoz verimliliğini değerlendirme tekniklerini içerir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Shao laboratuvarında yapılan araştırmalar, tıp fakültesinden araştırma yenilikçi Ödülü ve Iç tıp bölümü 'nden küçük fakülte pilot Ödülü, Cincinnati Üniversitesi ve NIDDK/NıH 'dan Grant DK K01_095067 tarafından desteklenmektedir.

Deneysel fareler, fareler kolonisinde yetiştirilen ve sürdürülür. Tüm hayvan çalışmaları, Cincinnati Üniversitesi 'nin kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi 'nin (ıERUC) yönergelerine göre yapılmıştır.
1. CFD etiketli apoptotik thymosit hazırlanması
<ol><li>İki naif C57/B6 fareler tarafından Co2 inhalasyon için 10 dakika ve göğüs boşluğu açmak için ortadan kaldırmak, çıkarmak (dışarı çekin) eğri ince uçlu forseps ile doku kültürü Petri yemek içine timus 10 ml RPMI1640 orta.</li>
	<li>Mikroskop slaytlar iki buzlu uçları karşı tüm timus taşlama ve sonra 100 μm hücre süzgeci ile süspansiyon filtre tek hücreli süspansiyon elde.</li>
	<li>10 ml timus süspansiyon 50 ml tüp içine toplamak ve 5 dakika için 300 x g Santrifüjü.</li>
	<li>, 40 ml 1x PBS içinde pelletini, supernatant çıkarın ve bir hemocytometer ile hücre numaralarını saymak.</li>
	<li>300 x g 'de santrifüjün 5 dakika ve süpernatant çıkarın.</li>
	<li>2 x 10 8 hücrelere kadar tek hücreli süspansiyon olarak 50 ml 'lik bir tüpte 20 ml 1x PBS içinde pelletini ( Eğer daha fazla 2 x 108 hücreler, başka bir hücre geri kalanı yeniden pelletini 20 ml farklı bir 50 ml tüp 1 x PBS).</li>
	<li>5 μM CFSE 'ye eşit hacimli (20 mL) 1x PBS ile ayrı bir 50 mL tüpte pipetleme 40 μL CFSE stok çözeltisi (2,5 mM) ile 20 mL 1x PBS içine yerleştirin ve tüpü 2-3 kez tersine çevirerek iyi karıştırın.</li>
	<li>Ekle 20 mL CFSE dan adım 1,7 içine 20 mL hücre süspansiyon adım 1,6 (CFSE son konsantrasyonu şimdi 2,5 μM). Not: her 20 mL hücreli süspansiyon Için 20 mL CFSE tüpü gereklidir.</li>
	<li>Hücre ve CFSE karışımı tüp 2-3 kez tersine çevir ve 2 dakika en fazla oda sıcaklığında karanlıkta karışımı inhale, daha sonra 10 mL ısı inaktive at serumu ekleyerek reaksiyonu durdurun.</li>
	<li>50 mL tüp karışımından 300 x g 'de oda sıcaklığında 5 dakika Santrifüjü. Not: CFSE etiketleme başarılı olursa, hücre Pelet renk açık sarı olacak.</li>
	<li>Süpernatant çıkarın ve 40 ml 1x PBS içinde hücre Pelet pelletini ve bir hemocytometer ile saymak hücre numaraları.</li>
	<li>Hücre süspansiyon 300 x g 5 dakika Santrifüjü ve supernatant atın.</li>
	<li>40 ml RPMI1640 orta ile tekrar hücre Pelet yıkayın.</li>
	<li>RPMI1640 doku kültürü Orta (RPMI1640, 20 mm HEPES, 10% FBS (ısı inaktive), 20 mm glutamin ve 1x pen/strep) ile süpernatant ve pelletini hücreleri kaldırmak 100 mm doku kültürü çanak 7 x 106 hücreler/ml konsantrasyonda. Not: daha fazla hücre elde edilir, ayrı bir 100 mm doku kültürü çanak gerekir.</li>
	<li>% 5 CO2ile birlikte verilen doku kültürü inkübatörü Içinde 37 °c ' de 4 h Için 1 μM ve kültürün son konsantrasyonunda hücre süspansiyon kültürüne staurosporin ekleyin.</li>
</ol>2. periton makrofajlar hazırlanması
<ol><li>İki C57B6 fareler (veya laboratuvarda herhangi bir gen manipüle fareler) intraperitoneal 1 ml% 3 yaş thioglycollate 0 ile enjekte.</li>
	<li>Adım 1,1 olarak gün 5 ' te fareler euthanize, kesilmiş ve karın derisi açık soyma ama periton bozulmamış bırakın. Periton boşluğu, 18 G iğne ile bağlı 10 ml 'lik bir şırınga kullanarak periton boşluğa 10 ml yıkama tamponunu (RPMI1640% FBS, 0,04% EDTA) hızlı bir şekilde itmek suretiyle temizleyin.</li>
	<li>Yıkama tamponunu aynı iğne/şırınga ile yavaşça alın ve yıkama tamponunu 50 mL 'Lik bir tüpün içine toplayın (detaylar Janssen Lab madde15' e bakın).</li>
	<li>İki kez 1x PBS ile periton gavaj yıkayın, 2 x 106 hücreler/ml ve kısım 500 μL bir yoğunlukta RPMI1640 doku kültürü ortamında periton makrofajlar pelletini her iyi 24-kuyu plaka içine. 2 h için bir doku kültürü kuluçk plaka bırakın.</li>
	<li>Kayan hücreleri, iki kez 500 μL taze kültür ortamı ile duman çekiş ve değiştirerek kaldırın.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, TAM reseptör Tirozin inhibitörü, RXDX-106, şekil efsanelerinde gösterilen konsantrasyonlarda makrophaj kültürünün her bir iyi içine ekleyin ve başka bir 2 h için inküye.</li>
</ol>3. apoptotik thymosit ile periton makrofajların ortak kültürü
<ol><li>1. adımda apoptotik thymositler toplayın ve RPMI1640 orta ile üç kez yıkayın. Apoptotik indüksiyon verimliliği bu aşamada Annexin V/7-AAD kiti ile ölçülebilir.</li>
	<li>Deneysel düzenlemeye göre (örn., bkz. Şekil 1) 0-12 x 106 hücreleri (500 μL orta) protokol #2 makrophaj kültürlerinin her bir kuyunda dağıtın. Bu 24-kuyu plaka her iyi 1 mL tüm kültür hacmi yapar. Apoptotik thymosit ilavesi hemen önce kültür içine engelleme antikor ekleyin.</li>
	<li>% 5 CO2ile birlikte verilen bir doku kültürü kuluçte 4 h Için 37 °c ' de hücre karışımı kültürü.</li>
	<li>Ücretsiz yüzen apoptotik hücreleri kaldırmak için iki kez 1x PBS (500 μM EDTA içeren) ile kültürün her iyi yıkayın.</li>
	<li>Bu aşamada CD11b-PE ile plaka bağlı makrofajlar leke.<ol>
<li>Plakaya bağlı makrofajları bir kez boyama tamponunu (1x PBS,% 1 BSA) yıkayın.</li>
		<li>Her kuyunda 2 μL CD11b-PE içeren 200 μL boyama tamponu ekleyin.</li>
		<li>Plakası 4 °C ' de 20 dakika boyunca inküyin.</li>
		<li>Boya tamponu ile plakanın her iyi üç kez yıkayın.</li>
		<li>200 μL boyama tamponu ekleyin ve floresan mikroskobu altında görüntü analizi için plaka devam edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alternatif olarak, PBS 'de 1% 1 ml lidokain ekleyerek plakaya bağlı makrofajları ayırın ve 37 °c ' de 10 dak.</li>
	<li>Plakaya bağlı makrofajları tekrar pipetleme ile ayırın.</li>
	<li>Makrophaj süspansiyonunu bireysel 5 mL yuvarlak alt FACS tüpüne 24-kuyu plakasının her bir kuyusuna aktarın.</li>
	<li>300 x g 'de santrifüjün 5 dk.</li>
	<li>Süpernatant 'ı çıkarın ve 2 μL CD11b-PE (boyama tamponunda 1:200 seyreltme) içeren 200 μL boya tamponu ekleyin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 4 °C ' de 20 dakika boyunca boyama tamponunun içine atın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu iki kez boyama tampon ile yıkayın.</li>
	<li>200 μL boyama tamponu ekleyin ve bir akış sitometresi ile FACS analizi için devam ve cfse pozitifliği makrofajlar yüzdesi için analiz.</li>
</ol>

<ol><li>Shao, W. H., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disturbances+of+apoptotic+cell+clearance+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202(2011).</li>
<li>Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell+death+and+lupus%5BTitle%5D)+AND+%22Springer+Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell death and lupus.</a> Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 145-152 (2006).</li>
<li>Wong, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+cancer%3A+from+pathogenesis+to+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+and+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87(2011).</li>
<li>Baig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+apoptotic+pathway-targeted+cancer+therapeutic+research%3A+Where+do+we+stand%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand.</a> Cell Death and Disease. 7, 2058(2016).</li>
<li>Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell+clearance%3A+basic+biology+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 166-180 (2014).</li>
<li>Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+clearance+of+apoptotic+cells+induces+the+activation+of+autoreactive+anti-Sm+marginal+zone+and+B-1+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells.</a> Journal of Immunology. 172 (1), 625-635 (2004).</li>
<li>Hawkins, L. A., Devitt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+understanding+of+the+mechanisms+for+clearance+of+apoptotic+cells-a+fine+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Death%22%5BJournal%5D)">Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance.</a> Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).</li>
<li>Lemke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+TAM+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Biology of the TAM receptors.</a> Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (11), 009076(2013).</li>
<li>Stitt, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anticoagulation+factor+protein+S+and+its+relative%2C+Gas6%2C+are+ligands+for+the+Tyro+3%2FAxl+family+of+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases.</a> Cell. 80 (4), 661-670 (1995).</li>
<li>Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAM+receptor+tyrosine+kinases%3A+biologic+functions%2C+signaling%2C+and+potential+therapeutic+targeting+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer.</a> Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).</li>
<li>van der Meer, J. H., van der Poll, T., van 'T Veer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAM+receptors%2C+Gas6%2C+and+protein+S%3A+roles+in+inflammation+and+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis.</a> Blood. 123 (16), 2460-2469 (2014).</li>
<li>Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAM+receptors+and+the+clearance+of+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annal+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">TAM receptors and the clearance of apoptotic cells.</a> Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).</li>
<li>Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mer+receptor+tyrosine+kinase+is+expressed+on+discrete+macrophage+subpopulations+and+mainly+uses+Gas6+as+its+ligand+for+uptake+of+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells.</a> Clinical Immunology. 133 (1), 138-144 (2009).</li>
<li>Scott, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+clearance+of+apoptotic+cells+is+mediated+by+MER%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER.</a> Nature. 411 (6834), 207-211 (2001).</li>
<li>Klarquist, J., Janssen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bm12+Inducible+Model+of+Systemic+Lupus+Erythematosus+%28SLE%29+in+C57BL%2F6+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice.</a> Journal of Visualized Experiment. (105), e53319(2015).</li>
<li>Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+expression+of+tyro3%2C+axl%2C+and+mer+receptors+in+macrophage+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Macrophage+%28Houst%29%22%5BJournal%5D)">Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny.</a> Macrophage (Houst). 3, (2016).</li>
<li>Elmore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+a+review+of+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: a review of programmed cell death.</a> Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).</li>
<li>Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Find-me+and+eat-me+signals+in+apoptotic+cell+clearance%3A+progress+and+conundrums%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).</li>
<li>Rock, K. L., Kono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+response+to+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+in+Pathology%22%5BJournal%5D)">The inflammatory response to cell death.</a> Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).</li>
<li>Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+inducing+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Methods for inducing apoptosis.</a> Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).</li>
<li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+seeing+to+believing%3A+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001(2013).</li>
<li>Stijlemans, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+pHrodo-based+assay+for+the+assessment+of+in+vitro+and+in+vivo+erythrophagocytosis+during+experimental+trypanosomosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003561(2015).</li>
<li>Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearing+the+dead%3A+apoptotic+cell+sensing%2C+recognition%2C+engulfment%2C+and+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion.</a> Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (1), 008748(2013).</li>
<li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).</li>
<li>Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+recovery+of+macrophages+and+cell+lines+from+tissue+culture-treated+and+-untreated+plastic+dishes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Methods%22%5BJournal%5D)">Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes.</a> Journal of Immunology Methods. 68 (1-2), 119-129 (1984).</li>
<li>Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Human+and+Mouse+Neutrophil+Phagocytosis+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry.</a> Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).</li>
<li>Summers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+kinetics+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil kinetics in health and disease.</a> Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).</li>
<li>Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phagocytes%3A+neutrophils+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The phagocytes: neutrophils and monocytes.</a> Blood. 112 (4), 935-945 (2008).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Apoptozis birçok sinyal Cascades içeren ve protein ifadesi, salgılanması ve ulaşım indükler bir son derece uyumlu hücre ölüm sürecidir. Apoptozis genellikle hücresel morfoloji değişiklikleri ile ilişkilidir17. Apoptotik hücreler, site 'ye göç etmek için fagositler çeken sitokinleri ve kemokinlere aktif olarak serbest bırakır ve sıkı kontrol18' in altında son derece karmaşık bir yol olan alay sürecini başlatır. Öte yandan, necrotik hücre ölümü iltihaplı tepkiler tetikleyen t...

Vücudumuzun günlük olarak 1-10 milyar apoptotik hücreler üretir. Apoptotik hücrelerin böyle çok sayıda bağışıklık tepkiler sessiz kalır bir şekilde temizlenmelidir. Apoptotik hücrelerin zamanında temizlenmesini sağlamak için, çok sayıda doku yerleşik hücresi ve dolaşım hücresi apoptotik hücreleri yutan mekanizmalar geliştirir1. Çeşitli enflamatuar hastalığın ve otoimmün2' nin başlangıcı ve progresyonunda apoptozin işlevsiz olarak düzenlenmesi ortaya çıkarılmıştır. Apoptosis Ayrıca kanser gelişiminin patogenezinde ve Konvansiyonel tedavilere karşı sonraki direncinde kritik bir rol oynamaktadır3,4. Apoptotik hücrelerin kaldırılması genellikle immünolojik tolerans5ile bağlantılı olabilecek bir anti-inflamatuar yanıtı teşvik eder. Apoptotik hücre boşluklarının bozulması kendi kendine immünizasyonu tahrik ediyor ve hem insanlar hem de fareler6' da sistemik otoimmün hastalıkların gelişmesine katkıda bulunur.
Hücreler apoptozis geçmesi, onlar fosfatidilserine maruz (PtdSer) membranın dış broşür için iç broşür. Ptdser daha sonra yüzey reseptörleri ile fagositler tarafından tanınacaktır. Bir düzine reseptörlerin üzerinde tanımak ve/veya apoptotik hücrelerin yutulma kolaylaştırmak için tespit edilmiştir. Genel olarak, apoptotik hücre boşlukunda yer alan en az üç tip yüzey reseptörü vardır: reseptörleri tethering, apoptotik hücreleri tanımak; gıdıklamalar reseptörleri, başlatmak engulfment; reseptörleri, tüm süreci kolaylaştırmak7. TAM reseptör Tirozin kinazlar (TAM RTKs) TYRO-3, AXL ve Mer oluşur ve öncelikle bağışıklık sisteminin miyeloid hücreleri tarafından ifade edilir8. TAM RTKs 'nin birincil fonksiyonu, apoptotik hücrelerin ve enkaz fagositik çıkarılması kolaylaştırarak, tethering reseptörleri olarak hizmet etmektir. Grubumuz yıllardır otoimmünite ortamında TAM aracılı apoptotik hücre boşluğu okudu. K vitamini bağımlı protein büyüme tutuklama spesifik protein 6 (Gas6) ve protein S (artıları) bağlar ve tam reseptörleri aktive9,10. Gas6 kalp, böbrek ve akciğerde üretilmektedir. Artılar ağırlıklı olarak karaciğerde üretilmektedir11. TAM apoptotik hücrelerin Gas6/ProS N-terminali apoptotik bir hücre üzerinde PtdSer bağlanır ve Gas6/ProS C-terminali fagositlerin yüzeyine demirlemiş TAM reseptörlerine bağlanır böyle bir şekilde tanır. Diğer reseptörlerle birlikte, apoptotik hücrelerin Yutulmaları12oluşur. Mer hem ligin artıları ve Gas6 bağlayabilirsiniz olsa da, biz Gas6 tek ligand olarak görünür olduğunu bulundu, bu anti-Mer antikor tarafından engellenmiş olabilir apoptotik hücrelerin Mer-aracılı makrophaj fagositoz13. Macrofajlar profesyonel phagocytes vardır. Apoptotik hücrelerin makrofajlar tarafından hızlı bir şekilde temizlenmesi, inflamasyonun inhibisyonu ve hücre içi antijenlere karşı otoimmün tepkiler için önemlidir. Mer reseptörü Tirozin kinaz, makrophaj Yutulmaları ve apoptotik hücrelerin etkili boşluğu için önemlidir14. Fare dalağında, Mer ağırlıklı olarak marjinal bölge ve somut vücut makrofajlar13ifade eder.
Burada sunulan protokol, hücre apoptozu ikna etmek ve süreci ve efferocytosis etkinliğini ölçmek için yollar göstermek için temel bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokoller, farklı kökenlerin apoptotik hücrelerin yutulmasında diğer hücre türleri tarafından effersitoz çalışması için kolayca adapte edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Ack parçalama tamponu</td><td>GIBCO</td><td>A10492</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V/7-AAD</td><td>BD Pharmingen</td><td>559763</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mer antikoru</td><td>R& D Systems</td><td>BAF591</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-PE (klon M1 / 70)</td> <td>BD Pharmingen</td><td>553311</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Invitrogen</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 mM)</td> <td>GIBCO</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>FACS tüpleri</td><td>BD Biosciences</td><td>352017</td><td></td></tr><tr><td>Buzlu slaytlar</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552-343</td><td></td></tr><tr><td>At Serumu (Isı ile Aktive Edilmiş)</td><td>İnvitrojen</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Lidokain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-5647</td><td>1x PBS</td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>Corning</td><td>21040CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640'ta</td> %1 tampon hazırlayın <td>Corning</td><td>10040CV</td><td></td></tr><tr><td>RXDX-106</td><td>Selleck Kimyasalları</td><td>CEP-40783</td><td></td></tr><tr><td>Staurosprine (100mg)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP2541-100</td><td>1mM stoklama çözeltisi yapmak için 100 mg'a 214.3 ml DMSO ekleyin</td></tr><tr><td>Tiyoglikolat Orta Brewer Modifiye BD</td><td>Biosciences</td><td>243010</td><td>1 akut% 3 tiyoglikolat tamponu hazırlayın; PBS, otoklavlanmış ve 3 ay boyunca karanlıkta saklanmalıdır.</td></tr></tbody></table>

makrofajlar tarafından apoptotik thymocyte engulfment deneysel analizi

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

Hücre apoptozis doğal bir süreçtir ve embriyonik gelişim, homeostatik düzenleme, bağışıklık toleransı indüksiyon ve inflamasyonun çözünürlüğü önemli bir rol oynar. Vücutta apoptotik enkaz birikimi zaman içinde sistemik otoimmün hastalıklara yol açan kronik inflamatuar tepkiler tetikleyebilir. Engelli apoptotik hücre boşluğu, çeşitli otoimmün hastalıklarda karışmıştır. Apoptotik boşluk fizyolojik koşullarda nadiren algılanan karmaşık bir süreçtir. Bu bol yüzey reseptörleri ve sinyalizasyon molekülleri içerir. Apoptotik hücre boşluğu sürecini incelemek, yeni terapilerinin gelişmesine yol açabilecek anlayışlı moleküler mekanizmalar ve sonraki biyolojik tepkiler sağlar. Burada, apoptotik tirositlerin indüksiyonu, periton makrofajların hazırlanması, ve osiyometri ve mikroskopi ile apoptotik hücre boşluğu analizi için protokoller açıklanmaktadır. Tüm hücreler belirli bir aşamada apoptozis geçecek, ve birçok konut ve dolaşım hücreleri apoptotik enkaz alabilir. Bu nedenle, burada açıklanan protokol birçok uygulamada apoptotik hücre bağlama ve diğer birçok hücre türleri tarafından yutulması karakterize etmek için kullanılabilir.

Apoptotik tirmositlerin periton makrophaj aracılı Yutulmaları analizi. Peritoneal makrofajlar ve apoptotik hücreler, protokolde açıklandığı gibi hazırlanmış ve kültürlü bir şekilde hazırlanmıştır. Macrofajlar müstakil ve buz üzerinde 20 dakika boyunca PE konjuza Anti-CD11b antikor ile lekelenmiş. Makrofajlar sonra yıkanır ve bir akış cytometer işlenir. Görüldüğü gibi, kültürde hiçbir apoptotik hücre eklenmediği zaman sağ alt çeyreğinde CFSE pozitif makrophaj bulunmamaktadır (Şekil 1<...

Burada, apoptotik tirositler ve periton makrofajlar hazırlamak ve effersitoz verimliliğini ve apoptotik tirositlerin özel inhibitörü-aracılı engellemesini analiz etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol yapay boncuk ve bakteri dahil olmak üzere diğer parçacıklar hücre aracılı boşluk geniş bir uygulama vardır.

Makrofajlar tarafından apoptotik thymocyte engulfment deneysel Analizi

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...

Vücudumuz her gün 1 ila 10 milyar apoptotik hücre üretir. Bu hücrelerin verimli temizlenmesi hücre enkaz kaldırma ve stokların korunmasında yardımcı olur. Bu yöntem birçok uygulamada apoptotik hücre bağlanmasını ve diğer birçok fagositik hücre tipi tarafından yenmesini karakterize etmek için kullanılabilir.Bu prosedürü gösteren Yuxuan Zhen, benim laboratuvarda kıdemli bir teknisyen olacaktır. Timositleri hasat etmek için, saf bir C57 siyah 6 farenin göğüs boşluğunu açtıktan sonra, timusu çıkarmak için kavisli ince uçlu forceps kullanın. RPMI 1640 Orta 10 mililitre içeren bir doku kültür çanak içine organ yerleştirin.Tüm timusu iki mikroskop kaydırağının buzlu uçlarına karşı öğütün ve ortaya çıkan doku süspansiyonunu 70 mikrometrelik bir süzgeçten 50 mililitrelik bir tüpe süzün. Santrifüj ile timositler toplamak ve 40 mililitre pelet resuspend. Sayma sonra, hücreleri tekrar santrifüj ve 50 mililitre tüp başına taze PBS 20 mililitre sekiz hücre ye kadar iki kez 10 kadar askıya.Hücreleri tüp başına 20 mililitre PBS cinsinden beş mikromolar CFSE ile etiketlayın. Tüpleri karıştırmak için 2-3 kez ters oda sıcaklığında ışıktan korunan en fazla iki dakika timositler kuluçkadan önce. Kuluçka sonunda, ısı inaktive at serum 10 mililitre ile reaksiyonu durdurmak ve santrifüj ile hücreleri toplamak.Sayım ve santrifüj için 40 mililitre taze PBS etiketli hücreleri yeniden askıya alın ve ardından 40 mililitre orta ile ilave bir yıkama. Orta yıkamadan sonra, doku kültürü orta konsantrasyon mililitre başına altı hücreye yedi kez 10 timositler resuspend ve 100 milimetre doku kültür çanak hücreleri tohum. Sonra bir mikromolar son konsantrasyonda hücre kültürüne staurosporine ekleyin ve dört saat boyunca bir doku kültürü kuluçka plaka yerleştirin.Periton makrofaj izolasyonu için, iki C57 siyah 6 fareintraperitoneally bir mililitre ile enjekte 3% yaşlı tiyoglikololat gün sıfır da periton rahatsız etmeden önce karın deri açmadan önce beşinci gün. Periton boşluğunu temizlemek için, 18 gauge iğneile donatılmış 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak 10 mililitrelik yıkama tamponunu yavaşça 50 mililitrelik bir tüpe toplama için azarlamadan önce boşluğa doğru hızla itin. Periton lavajını PBS ile iki kez yıkayın.Periton makrofajlarını iki kez 10'da doku kültürü orta konsantrasyonunun mililitresi başına altı hücreye yeniden askıya alın. Sonraki tohum 24 kuyu plaka her kuyuiçine makrofajlar 500 mikrolitre ve iki saat boyunca bir doku kültürü kuluçka plaka yerleştirin. Kuluçka sonunda, yüzen hücreleri kaldırmak ve her kuyuya doku kültürü orta 500 mikrolitre eklemek için supernatant aspire.Kültürün her kuyusuna 500 mikrolitre orta daki altı timosite 12 çarpı 10'a hemen sıfır ekleyin ve plakayı dört saat boyunca doku kültürü kuluçka makinesine yerleştirin. Kuluçka sonunda, herhangi bir serbest yüzen apoptotik hücreleri ve ardından boyama tampon ile tek bir yıkama kaldırmak için taze PBS ile her iki kez yıkayın. Sonraki etiket iyi başına uygun bir anti-CD11b antikor ile desteklenen boyama tampon 200 mikrolitre ile plaka bağlı makrofajlar ve 20 dakika boyunca dört derece santigrat plaka yerleştirin.Bu temsili deneyde, tiyoglikolat uyarılmış periton makrofajlarının %30'a kadarı CFSE kanalında bu fagositlerin CFSE etiketli apoptotik hücreleri yutturduklarına dair olumlu bir sinyal göstermiştir. Cfse pozitif makrofajlar farklı yoğunluklara bağlı olarak sağ alt kadranda yayıldığı için apoptotik hücrelerin makrofaj yutma makrofajlarının mikroskobik gözlemi, tek tek makrofajlar içindeki apoptotik hücre sayısının farklı olduğunu gösterir. Apoptotik hücrelerin makrofajlara oranı nın artması sadece apoptotik hücreleri sindiren makrofajların sayısını artırmakla kalmamış, aynı zamanda makrofajların daha apoptotik hücreleri yutma yeteneğini de arttırır.Başka bir deney setinde, CFSE etiketli apoptotik timositler makrofaj kültürüne dört saat eklendiğinde bu makrofajların fagositik makrofajlar olduğunu gösteren makrofajların yaklaşık %15'i CFSE pozitif hale gelmiştir. Mer antikor, makrofaj eferositozisindoza bağlı bir şekilde bloke edilmesive genel tıkanıklık mevcut ortamda eferositoz veriminin yaklaşık %30'una neden olabilir. Buna ek olarak, yeni onaylanmış TAM reseptör inhibitörü makrofaj eferositoz yaklaşık 100 nanomolar konsantrasyona kadar doza bağımlı bir şekilde zayıflatır.Bu sayı eferositozun verimliliğini doğrudan etkilediği için her zaman apoptotik hücrelerin yüzdesini kontrol etmeyi unutmayın. Fagositik makrofajlar, yutma işlemi yle düzenlenen sinyal moleküllerinin araştırılması için Batı lekeleri ve yutma dinamiklerini incelemek için mikroskobik tarafından daha fazla analiz edilebilir.

experimental-analysis-of-apoptotic-thymocyte-engulfment-by-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, konfokal mikroskopi kullanarak apoptotik hücrelerin klirensini incelemek için efferositoz testini gösteriyoruz. Efferositoz, apoptotik hücrelerin fagositler tarafından yutulduğu ve efferozom adı verilen veziküller içinde parçalandığı çok aşamalı bir süreçtir. Bu protokol, tek tek apoptotik hücrelerin içselleştirilmiş ve içselleştirilmemiş kısımlarını görselleştirmek ve efferositozu ölçmek için bir yöntem sağlar.

Sabit Hücreli Efferositoz Deneyi: Floresan Mikroskobu Kullanarak Apoptotik Hücrelerin Makrofajlar Tarafından Efferositik Alımını İncelemek İçin Bir Yöntem

Bu videoda, floresan mikroskobu ile apoptotik fare timositlerinin peritoneal makrofaj aracılı efferositozunu analiz etmek için bir prosedür gösterilmektedir.

Apoptotik Timositlerin Peritoneal Makrofajlarla Efferositozunun Analizi

Bu video, önceden aktive edilmiş efektör T hücreleri tarafından indüklenen kanser hücrelerinde bir apoptoz testini göstermektedir. Bu hücrelerin floresan çekirdeklerle işaretlenmiş kanser hücreleri ile birlikte kültürlenmesiyle, kaspaz ile bölünebilir bir florojenik substrat eklenir. Apoptotik kanser hücreleri, çekirdeklerinde farklı bir renk gösterecek ve bu da çift floresansa yol açacaktır. Bu ikili floresan, apoptoz geçiren kanser hücrelerinin göstergesidir.

Önceden Aktive Edilmiş CD8 + T Hücrelerinin Kanser Hücrelerine Karşı Sitotoksisitesini İncelemek İçin Bir İn Vitro Test

Burada, bitişik ölü veya ölmekte olan hücrelerle fiziksel etkileşim yoluyla canlı hücrelerde indüklenen hücre içi sinyal olaylarının belirlenmesi için bir protokol sunuyoruz. Protokol, fagositik alımlarının veya çözünür aracıların salınmasının aksine, ölü hücrelerin reseptör aracılı tanınmasıyla indüklenen sinyal olaylarına odaklanır.

Hücre içi Komşu maruz kalan hücreler, apoptotik hücre ölümü ile etkileşim yoluyla canlı hücreler İndüklenen sinyal olaylarının tanımlanması

Drosophila'nın dağıtılmış embriyonik hücrelerini kullanarak bir fagositoz tahlili burada tarif edilmektedir. Bu, in vivo fagositoz seviyelerini kolay ve kesin bir şekilde ölçmemize ve apoptotik hücrelerin fagositozu için gerekli olan yeni molekülleri belirlememize olanak tanır.

Apoptotik Hücreler İçin Fagositoz Testi Drosophila

Burada dönen disk confocal mikroskobu görüntüsü tek fagositik olayları için fare ikamet periton makrofajlar tarafından kullanma yöntemleri açıklanmaktadır. İletişim kuralları diğer fagositik hücreler için genişletilebilir.

Fagositoz fare makrofajlar tarafından hızlandırılmış 3D görüntüleme

Efferocytosis, apoptotik hücreler, fagositik kaldırılması homeostazı korumak için gerekli ve reseptörleri ve tanıma, engulfment ve apoptotik hücreler içselleştirilmesi için izin sinyal yollar tarafından yönetilir. Burada, biz efferocytosis miktar ve efferocytic sinyal yolları etkinlik için bir floresans mikroskobu Protokolü mevcut.

Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar

Biz burada pre-harekete geçirmek CD8 sitotoksisite araştırmak için bir protokol tarif+ T hücreleri kanser hücrelerine karşı apoptotik kanser hücreleri aracılığıyla gerçek zamanlı mikroskobu tespit ederek. Bu protokol mekanizmaları myeloid hücre kaynaklı T hücre bastırma arkasında araştırmak ve T hücreleri ile abluka bağışıklık baskılayıcı myeloid hücre yenileyici amaçlı bileşikler değerlendirmek.

Gerçek zamanlı hafiye-in Vitro tümör hücre Apoptosis içinde CD8 tarafından indüklenen+ T hücreleri Myeloid hücrelerin tümör infiltre bağışıklık baskılayıcı işlevlerini çalışmaya

Nörodejeneratif hastalıklar düzensiz mikroglia fonksiyonları ile ilişkilidir. Bu makalede, iPSC-makrofajlar tarafından nöroblastom hücrelerinin fagositozunun in vitro bir tahlili özetlenen bir makale verilmiştir. Nicel mikroskopi okumaları hem canlı hücre zaman atlamalı görüntüleme hem de sabit hücreli yüksek içerikli görüntüleme için açıklanmıştır.

İPSC-Makrofajlar tarafından Ölü Nöroblastom Hücrelerinin Fagositozu için İn vitro Nicel Görüntüleme Tahlili

Bu protokol, PMA ile farklılaşmış THP-1 makrofajlarının LPS ve ATP'ye bağlı ölümüne dayanmaktadır. Hücre ölümünü tespit etmek için Annexin V ve 7-AAD çift boyamayı analiz etmek için akış sitometrisi kullanıyoruz, tüm hücreyi kullanıyoruz ve hücre zarı morfolojisini gözlemlemek için taramalı elektron mikroskobu kullanıyoruz.

PMA ile Farklılaşmış THP-1 Makrofajlarının LPS ve ATP ile İndüklenen Ölümü ve Validasyonu

Öğrenin apoptotik timositlerin makrofajlar tarafından fagositozunu analiz etme yöntemini. Bu protokol, C57BL/6 farelerinden hücre izolasyonu ve efferositoz verimliliğini değerlendirme tekniklerini içerir.

Makrofajlar tarafından apoptotik thymocyte engulfment deneysel Analizi

Daha fazla video keşfet