Bir on-membran sindirim tekniği kullanılarak protein-protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi
July 19th, 2019
Burada, kütle spektrometresi için numunelerin hazırlanması için bir on-membran sindirim tekniği için bir protokol sunuyoruz. Bu teknik, protein-protein etkileşimlerinin uygun analizini kolaylaştırır.
Protein-protein etkileşiminin araştırılması, fizyolojik süreçlerin çeşitli alanlarda anlaşılması için vazgeçilmezdir. Bu videoda, araştırmacıların MS tarafından bağlayıcı proteinlerin kapsamlı bir analizini uygun bir şekilde yapmalarını sağlayan membran üzerinde sindirim tekniğini tanıtıyoruz. Bu tekniğin en büyük avantajı, proteinlerin poliakrilamid jel elektroforezile ayrılması gerekli olmadığı için ham immünopprecipitantlar için proteomik analizin kolaylığını artırabiliyor olmamızdır.
Anti-GFP antikorlarını 500 mikrolitre sitrat fosfat tamponundaki boncuklarla karıştırarak antikorları manyetik boncuklara uygun hale getirmek için antikorları konjuge etmeye başlayın. Karışımı oda sıcaklığında bir saat boyunca 50 RPM'de döndürün. Ve sonra% 1 polisorbat 20 içeren sitrat fosfat tampon ile üç kez konjuge boncukyı yıkayın.
Lyse transfected hücreleri el yazması yönlere göre. Çanak kazıyın ve 1.5 mililitrelik test tüpü içine lysate aktarın. Daha sonra 15, 000 x g'de beş dakika santrifüj ederek lysate'yi temizleyin ve supernatant'ı toplayın.
500 mikrolitre sitrat fosfat tamponu ile üç kez yıkayarak etiketsiz manyetik boncuklar hazırlayın. Son yıkamadan sonra, tampon kaldırın ve boncuk hücre lysate ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 50 RPM'de döndürün.
Manyetik stand üzerinde manyetik ayırma gerçekleştirin ve hücre lysate toplamak. Hedef proteinleri immünglobulin konjuge boncuklara bağlamak için boncukları beş dakika boyunca manyetik standa yerleştirin. Sitrat arabelleği atın ve boncuklar için hücre lysate ekleyin.
Karışımı 50 RPM'de bir saat döndürün. Hedef proteinleri hedef olmayan serbest proteinlerden ayırmak için boncukları %1 polisorbat 20 içeren 500 mikrolitre sitrat fosfat tamponu ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, sitrat tampon 30 mikrolitre ekleyin ve boncuk hedef proteinleri temizlemek için oda sıcaklığında beş dakika oturup sağlar.
Membranı hazırlamak için, PVDF membranları kullanılmadan hemen önce temizlenen cerrahi makaslar kullanarak 3 milimetrelik parçalara bölün. Alüminyum folyo üzerine membran parçaları yerleştirin ve her parça ya etanol iki ila beş mikrolitre ekleyin. Membranlar tamamen kurumadan önce, her parçaya elüent proteininin iki ila beş mikrolitresini ekleyin ve membran yüzeyi matlaşana kadar hava kurutun.
Daha sonra membranları 1,5 mililitrelik tüplere aktarın ve onları dört santigrat derecede saklayın. Hemen kullanıyorsanız, onları hidrofilik yapacak etanol iki ila 30 mikrolitre ekleyin. Bir pipet ile etanol çıkarın, ancak membranlar kurumadan önce, tamamen her tüp için DTT tabanlı reaksiyon çözeltisi 200 mikrolitre ekleyin ve bir saat boyunca 56 derece santigrat onları kuluçka.
Kuluçkadan sonra reaksiyon çözeltisini 300 mikrolitre iyodoasetamid çözeltisi ile değiştirin ve karanlıkta 45 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra membranları iki kez distile suyla ve bir kez de %2 asetonitile en az on saniye girdap ile yıkayın. Diaphanous ile ilgili asetonitril ile çalışmak son derece tehlikeli olabilir.
Membran üzerinde sindirim işlemi yapılırken her zaman maske, gözlük ve eldiven takılmalıdır. El yazması talimatlara göre tripsin hazırlayın ve her membrana 100 mikrolitre tripsin reaksiyon çözeltisi ekleyin. Bir gecede 37 santigrat derecede sindirimi için kuluçkaya yatırın.
Ertesi gün, reaksiyon çözeltisini temiz bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın ve membrana 100 mikrolitre yıkama çözeltisi ekleyin. Membranı 60 derecede iki saat kuluçkaya yatırın, ardından yıkama çözeltisini toplayın ve reaksiyon çözeltisi ile karıştırın. Membrana 100 mikrolitre daha yıkama solüsyonu ekleyin ve 10 dakika sonicate edin.
Daha sonra yıkama çözeltisini toplayın ve reaksiyon çözeltisi ile karıştırın. Laboratuvar filmi bir parça ile test tüpü kapağı ve bir iğne ile filmde küçük delikler yapmak. Bir vakum konsantratörü kullanarak çözeltiyi kurutun ve kalıntıyı %2 formik asitin 10 mikrolitresinde çözün.
Tüpü 12, 000 x g'de üç dakika santrifüj edin ve süpernatantı örnek bir tüpe aktarın. Nano LC/HPLC sistemine bağlı bir kütle spektrometresi kullanarak numuneyi analiz edin. Bu protokol kullanılarak Calpain-6 ilişkili immünopsipitantta 17, GFP ile ilişkili immünoppitetitantta 15 ve her ikisinde de 11 protein saptandı.
Aday proteinin pozitif teşhisi için en az bir yüksek sadakat peptid parçasının saptanması gerektiğini belirtmek önemlidir. GFP ekspresyonu ile çökelen proteinlerin yanı sıra histones, ekzojen ve ribozomal proteinler listeden çıkarıldı. Membranların triptik sindirimden önce distile su ve %2 asetonitril ile yıkanması, proteinler üzerinde membran üstü sindirim işleminin en önemli adımıdır.
Bu yöntemden sonra immünopreplit ve Batı leke analizi gibi diğer deneyler yaparak hedef proteinin birlikte çökeltmesini doğrulamak mümkündür. Bu basit yöntem araştırmacılar Uygun ve yüksek duyarlı analiz ile yeni protein-protein etkileşimleri keşfetmek için izin verir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, kütle spektrometrisi için örneklerin hazırlanmasında zar üzerinde sindirim tekniğini sunar ve protein-protein etkileşimlerinin analizini geliştirir. Bu yöntem, poliakrilamid jel elektroforezi gerekliliğini ortadan kaldırarak süreci basitleştirir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyokimya
- Proteomiks
Arka Plan
- Protein-protein etkileşimlerini anlamak fizyolojik araştırmalar için kritiktir.
- Kütle spektrometrisi bu etkileşimleri analiz etmek için önemli bir araçtır.
- Geleneksel yöntemler zaman alıcı ve karmaşık olabilir.
- Bu teknik süreci basitleştirmeyi amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Yeni bir zar üzerinde sindirim yöntemi tanıtmak.
- Proteomik analizde verimliliği artırmak.
- Bağlanma proteinlerinin analizini rahatça kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Antikorların manyetik boncuklara bağlanması.
- Anti-GFP antikorunun sitrat fosfat tamponunda boncuklarla karıştırılması.
- Karışımın oda sıcaklığında döndürülmesi.
- Konjuge boncukların polisorbet 20 içeren bir tamponla yıkanması.
Ana Sonuçlar
- Zar üzerinde sindirim tekniği verimli örnek hazırlamasına izin verir.
- Jel elektroforezi gerekliliğini ortadan kaldırır.
- Ham immünopresipitaların analizinde artan verimlilik.
- Protein etkileşimlerinin kapsamlı analizini kolaylaştırır.
Sonuçlar
- Zar üzerinde sindirim tekniği proteomikte önemli bir ilerlemedir.
- Protein etkileşimlerini inceleyen araştırmacılar için iş akışını basitleştirir.
- Bu yöntem kütle spektrometrisi analizlerin verimliliğini artırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Protein-protein interaction analysis is critical for target validation and mechanistic de-risking in early drug discovery. The on-membrane digestion technique enhances throughput by eliminating gel electrophoresis, enabling rapid screening of crude immunoprecipitants. This supports predictive confidence in target selection and portfolio triage by providing reliable interaction data from complex biological samples.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct identification of binding partners in native complexes.
- Operational Value: Reduces assay time by bypassing gel electrophoresis, accelerating target validation workflows.
- Predictive Value: Increases confidence in target selection by detecting co-precipitated proteins with high-fidelity peptide fragments.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative LC-MS/MS data suitable for hit confirmation in interaction screening campaigns.
- Operational Value: Standardizes sample preparation for reproducible proteomic analysis across multiple targets.
- Scalability: Processes multiple immunoprecipitants simultaneously, increasing screening capacity without gel-based bottlenecks.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides mechanistic insights into protein networks that inform disease-relevant model selection.
- Preclinical De-risking: Identifies potential off-target interactions early, reducing late-stage attrition risk.
- Biomarker Alignment: Supports discovery of interaction-based biomarkers linked to pathophysiological states.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement to lead optimization, enabling interaction profiling at multiple stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by validating protein complexes in physiologically relevant conditions.
- Screening: Delivers assay-ready samples with consistent digestion efficiency for reliable compound interaction profiling.
- Analytics: Generates peptide-level LC-MS/MS outputs that allow quantitative comparison of interaction strengths across conditions.
- Translational Research: Connects molecular interaction data to phenotypic outcomes through pathway enrichment analysis.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable proteomic preparation module applicable to diverse targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through direct detection of interaction partners in native lysates.
- Operational Value: Enhances reproducibility by standardizing membrane-based digestion across laboratories.
- Strategic Value: Reduces biological risk in lead selection by illuminating interaction networks early.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization of targets based on interaction strength and specificity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoprecipitation, membrane handling, and LC-MS/MS sample preparation.
- Needs access to vacuum concentrators, sonicators, and nano-LC/MS systems for peptide recovery and analysis.
- Demands standardized washing protocols to minimize contamination and ensure digestion efficiency.
- Requires optimization of antibody-bead conjugation for each target to maximize specific pull-down.
- Limited by the availability of high-quality antibodies and the solubility of membrane-bound proteins post-digestion.
