Name: Bir on-membran sindirim tekniği kullanılarak protein-protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Keşfedin, on-membran sindirim tekniğiyle protein-protein etkileşimlerini kütle spektrometrisi için hazırlama yöntemini. Bu yöntem, poliakrilamid jel elektroforezi gereksinimini ortadan kaldırarak proteomik analiz verimliliğini artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmada bilim kakenhi Grant numarası 17K09869 (AM), bilim KAKENHI Grant numarası 15K09418 (TM), tanıtımı için Japonya Derneği tanıtımı için Japonya toplum tarafından kısmen destekleniyordu Kanehara Ichiro tıp bilimi Vakfı bir araştırma hibe ve Suzuken Memorial Vakfı (tüm TM) bir araştırma hibe.

1. immünopaperasyonu
Not: aşağıdaki bölümlerde açıklandığı gibi, sodyum olmayan dodecil sülfat (SDS) liziz tamponu ve sitrat elüsyonu kullandık. Ancak, alternatif olarak ev içi immünopresipitasyon tekniğinin kullanımı da LC-MS/MS örnekleri hazırlamak için uygulanabilir.
<ol><li>Bir epitopu etiketi tek başına veya bir füzyon proteini kodlama vektörler ile kültürsüz hücreler transfect. Temsili veri edinme için, J774 hücrelerini (1 x 106) vektörler ile yeşil floresan proteini (Gfp) tek başına veya Gfp-Fused Capn6 (calpain-6 gen) cationıc lipozomları kullanarak aktarabilir.</li>
	<li>Manyetik boncuklar için antikor Konjugat.<ol>
<li>Bu amaçla, 500 μL sitrat fosfat tamponunun (24,5 mM sitrik asit, 51,7 mM ditemel sodyum fosfat; pH 5,0) bir 1,5 mL test tüpünde manyetik boncuk (25 μL/reaksiyon) ile Anti-GFP antikor (2 μL/reaksiyon) karıştırın.</li>
		<li>1 saat oda sıcaklığında 50 RPM 'de karışımı döndürün. Sonra, IgG-konjugasyonlu boncukları üç kez sitrat fosfat tampon ile yıkayın 0,1% Polyoxyethylene (20) Sorbitan monolaurate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uygun bir liziz tamponu kullanarak nakil hücreleri Lyse. Temsilci veri edinme için, 400 μL lizis tampon (50 mm Tris-HCL) içinde buz üzerinde 30 dk nakli hücreler Lyse; pH 7,5, 120 mm NaCl, 0,5% Poly (oxyethelene) octylphenyl eter) içeren 40 μmol/L fenilmetilsülfonil fluorid, 50 μg/ml leupeptin, 50 μg/ mL Aprotinin, 200 μmol/L sodyum ortoovanadat, ve 1 mM etilen glikol tetraasetik asit (EGTA) içinde 1,5 mL test tüpleri 24 saat transfeksiyondan sonra.</li>
	<li>5 dakika 15.000 x g santrifügleme ile lysate temizleyin ve supernatant toplamak.</li>
	<li>Lysate precleer. 1,5 mL-test tüpünde etiketli olmayan manyetik boncuk (25 μL/reaksiyon) ekleyin. 500 μL sitrat fosfat tampon ile boncukları üç kez yıkayın. Son yıkama sitrat fosfat tampon kaldırıldıktan sonra, manyetik boncuk üzerinde hücre lysate ekleyin. 50 RPM 'de Rotator kullanarak karışımı, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca döndürün.</li>
	<li>Manyetik ayırıcı için 5 dakika boyunca test tüpünü manyetik stand üzerine yerleştirin ve hücre lysate 'i toplayın. Üretici tarafından belirlenmiş manyetik stand kullanımı tavsiye edilir.</li>
	<li>Hedef proteinleri konjugasyonlu boncuklarla bağlar. Immunoglobulin (Ig) G-konjuge boncukları manyetik ayırma için 5 dakika boyunca manyetik stand üzerine yerleştirin, sitrat tamponunu atın ve sonra hücre lysate 'yi Ayrı boncuklarla ekleyin.</li>
	<li>1 saat oda sıcaklığında 50 RPM 'de karışımı döndürün.</li>
	<li>Hedef proteinleri serbest hedef olmayan proteinlerden ayırın. 500 μL kullanarak boncukları üç kez yıkayın 0,1% Polyoxyethylene içeren sitrat fosfat tampon (20) Sorbitan monolaurat. Son yıkamadan sonra, 30 μL sitrat tamponu (pH 2 – 3) ekleyin ve hedef proteinlere elute etmek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inküye yapın. Not: immünopresipitasyon kurtarma yetersiz ise, flag veya It gibi alternatif epitopu etiketleri kullanımı, verimliliği artırabilir. Elüsyonun verimliliği yetersiz ise, SDS tabanlı bir çözüm gibi diğer eluants kullanımı verimliliği artırabilir.</li>
</ol>2. proteinler üzerinde membran sindirim
Not: eksojen proteinlerle kontaminasyonu önlemek için protein içermeyen malzeme ve ekipmanların kullanılması gereklidir. Ayrıca, operatörün insan proteinlerinin kontaminasyonunu önlemek için cerrahi maske ve eldiven takması önerilir.
<ol><li>PVDF membranlarını, metanol ile silinmiş ve kullanmadan hemen önce kurutulmuş cerrahi makas kullanarak 3 mm x 3 mm 'lik parçalara ayırın.</li>
	<li>Temiz alüminyum folyo üzerinde PVDF membran parçaları üzerinde 2 – 5 μL etanol ekleyin.</li>
	<li>Tamamen kurumadan önce, hidrofilik PVDF membranlarına (numune başına 2 – 5 μL, 4 – 6 adet) eluant ekleyin ve membran yüzeyi mat olana kadar membranları hava kurutun. Kurutulmuş membranlar 4 °C ' de saklanabilir.</li>
	<li>Tüm membranları 1,5 mL plastik tüplere aktarın, membranları hidrofilik yapmak için 20 – 30 μL etanol ekleyin ve sonra bir pipet kullanarak etanol çıkarın.</li>
	<li>Membran tamamen kurmadan önce, 200 μL ditiyotreitol (DTT) tabanlı reaksiyon çözeltisi (80 mm NH4HCO3, 10 mm DTT ve% 20 acetonitrile) ekleyin ve 1 h için 56 °c ' de inküye yapın.</li>
	<li>Reaksiyon solüsyonu 300 μL iodoacetamid çözeltisi ile değiştirin (80 mM NH4HCO3, 55 mm iodoacetamid, ve 20% Asetonitril), ve karanlıkta oda sıcaklığında 45 dk için inküye.</li>
	<li>Membranları iki kez 1 ml distile su ile yıkayın ve bir kez 1 ml% 2 Asetonitril Vortex karıştırma tarafından > 10 s.</li>
	<li>Liyofilize MS-Grade tripsin (malzeme tablosu) doğrudan reaksiyon çözeltisi (30 mm NH4HCO3 içeren% 70 acetonitrile) çözülür. 1 μg tripsin (malzeme tablosu) (30 mm NH4hco3 içeren 70% acetonitrile) Içeren reaksiyon çözeltisi 100 μl ekleyin ve bir gecede 37 °c ' de inküye yapın.</li>
	<li>Triptik kazılar içeren reaksiyon çözümünü bir pipet kullanarak temiz 1,5 mL test tüpüne aktarın.</li>
	<li>Membran için 100 μL yıkama çözeltisi (70% Asetonitril/1% trifluoroasetik asit) ekleyin ve 2 h için 60 °C ' de kulkarın. yıkama çözümünü toplayın ve reaksiyon çözeltisi ile karıştırın. Membran için başka bir 100 μL yıkama solüsyonu ekleyin ve 10 dakika boyunca sonlayın. Sonra yıkama solüsyonu toplayın ve reaksiyon çözeltisi ile karıştırın.</li>
	<li>Laboratuvar filmi bir parça ile test tüpü kapak ve bir iğne ile küçük delikler bir çift olun. Solüsyonu vakum konsantratörü ile kurutun.</li>
	<li>10 μL% 0,2 formik asit içinde kalıntı çözülür. Santrifüjden sonra (12.000 × g, oda sıcaklığında 3 dk), süpernatant 'ı örnek bir tüpün içine aktarın. Not: Bu bölümün kritik adımları yıkıyor. On-membran protein sindirimi sırasında, azaltma ve damıtılmış su ile alkilasyon sonra immobilize proteinlerin içeren membranların yıkama, takip 2% Asetonitril, daha fazla için 10 sn, her biri için, reaktiflerin kaldırılması için önemlidir.</li>
</ol>3. LC – elektrosprey iyonizasyon (ESı)-MS/MS Analizi
<ol><li>Bir IR-MS/MS cihazı (malzeme tablosu) bir nano-LC HPLC sistemi (malzeme tablosu) ile birlikte etkinleştirin. Ön sütun (malzeme tablosu) ve analitik sütun (malzeme tablosu) bağlayın.</li>
	<li>Analiz öncesinde, standart peptidler sağlayan 0,2% formik asit içinde çözünmüş Sığır serum albümin triptik yemleri kullanarak kütle spektrometresi kalibre.</li>
	<li>Pozitif iyon modunu ve 400 – 1250 m/z kütle aralığını kullanarak numuneleri analiz edin; sonra 10 MS/MS spektrum (100 ms her) 100 – 1600 m/z Kütle aralığı ve% 2 – 80% Asetonitril ve 0,2% formik asit için 80 dk için bir akış hızında 300 nL/dak.</li>
	<li>İlgili proteinleri tanımlamak için protein tanımlaması (malzeme tablosu) yazılımını kullanarak çıkış verilerini analiz edin. Bir aday protein pozitif tanımlanması için, en az bir yüksek sadakat peptit parçası tespiti (> 95% sadakat) gereklidir.</li>
	<li>Aynı şekilde Gfp ifade endoglikozidazları (tek başına bir Gfp etiketi ifade vektör transfeksiyon) aday proteinleri listesinden çöktürülmüş proteinleri atlayın. Not: birkaç proteinler veritabanı analizinde tanımlanırsa, MS/MS edinme koşullarının değiştirilmesi (örn., 100 ms 'den her 50 MS 'ye kadar olan süreyi değiştirmek), tanımlanan proteinlerin sayısını artırabilir.</li>
</ol>

<ol><li>Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-translational+protein+folding%3A+progress+and+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Co-translational protein folding: progress and methods.</a> Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).</li>
<li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+protein+catabolism+in+atherosclerotic+vascular+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79(2017).</li>
<li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+calpain+proteolytic+systems+underlies+degenerative+vascular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Atherosclerosis+and+Thrombosis%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders.</a> Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).</li>
<li>Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CWC22+connects+pre-mRNA+splicing+and+exon+junction+complex+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly.</a> Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).</li>
<li>Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interaction+detection+via+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).</li>
<li>Obama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+modified+apolipoprotein+B-100+structures+formed+in+oxidized+low-density+lipoprotein+using+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS.</a> Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).</li>
<li>Matsudaira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+from+picomole+quantities+of+proteins+electroblotted+onto+polyvinylidene+difluoride+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).</li>
<li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+method+for+N-terminal+sequencing+of+proteins+by+MALDI+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).</li>
<li>Iwamatsu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-carboxymethylation+of+proteins+transferred+onto+polyvinylidene+difluoride+membranes+followed+by+in+situ+protease+digestion+and+amino+acid+microsequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing.</a> Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).</li>
<li>Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+specific+trypsin+digestion+of+microgram+to+nanogram+quantities+of+proteins+in+organic-aqueous+solvent+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems.</a> Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).</li>
<li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+calpain+proteolytic+systems+in+macrophage+cholesterol+handling%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).</li>
<li>Miyazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calpain-6+confers+atherogenicity+to+macrophages+by+dysregulating+pre-mRNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).</li>
<li>Tonami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calpain-6%2C+a+microtubule-stabilizing+protein%2C+regulates+Rac1+activity+and+cell+motility+through+interaction+with+GEF-H1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).</li>
<li>Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+elongation%2C+co-translational+folding+and+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein elongation, co-translational folding and targeting.</a> Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).</li>
<li>Bunai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+acrylamide+gel+separated+proteins+immobilized+on+polyvinylidene+difluoride+membranes+following+proteolytic+digestion+in+the+presence+of+80%25+acetonitrile%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile.</a> Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Daha önce bir on-membran sindirim tekniği6Ile önceden LC-MS/MS kullanarak okside düşük yoğunluklu lipoprotein apolipoprotein B-100 oksidatif modifikasyonları bir analiz tarif ettik. Bu çalışmada, bu tekniği immünopresipitasyon ile birleştirdik ve birkaç calpain-6-ilişkili protein tespit ettik. Bu roman tekniği, aday ilişkili proteinler için tarama uygun bir yöntem temsil eder. Kalpain-6, protein-protein etkileşimi12,13ile hücresel fonksiyo...

Proteinler yaşayan organizmalarda kurucu roller oynamakla birlikte, hücre içi ortamlarda sürekli sentezlenmiş, işlenir ve bozulur. Ayrıca, hücre içi proteinler sıklıkla fiziksel ve biyokimyasal olarak etkileşime girebilir, bu da1,2,3' ün fonksiyonunu etkiler. Örneğin, spliceosome ile ilişkili protein homolog CWC22 ökaryotik çeviri başlatma faktörü 4A3 (eIF4A3) ile doğrudan bağlama, eXoN Junction Complex4' ün montajı için gereklidir. Bu ile tutarlı, CWC22 için benzeşimi bulunmayan bir eIF4A3 mutant eXoN kavşak karmaşık güdümlü mRNA yapıştırma4kolaylaştırmak için başarısız olur. Böylece, protein etkileşimlerinin incelenmesi, fizyolojik düzenlemenin yanı sıra hücresel fonksiyonların kesin anlayışı için çok önemlidir.
Kütle spektrometresi (MS) ' deki son gelişmeler protein-protein etkileşimlerinin kapsamlı analizine uygulanmıştır. Örneğin, endojen proteinlerin Co-yağış veya exogenously ilişkili proteinleri ile etiketlenmiş proteinleri tanıttı, MS Analizi tarafından izlenen, yeni protein etkileşimleri belirlenmesi sağlar5. Ancak, MS/MS analizinin büyük bir darboğaz protein numunelerinin triptik diyetleri kötü kurtarma olduğunu. Hücre Lysates üzerinde proteomik analizler yapmak için, in-jel ve on-membran sindirim teknikleri genellikle MS/MS örnekleri hazırlamak için kullanılmaktadır. Daha önce bir on-membran sindirim tekniği ile bir in-jel sindirim prosedürü karşılaştırdık6, ve ikinci daha iyi sıra kapsamı ile ilişkili olduğunu gösterdi. Polyvinylidene difluorid (PVDF) membran bu amaçla uygun olabilir, çünkü mekanik olarak sağlam ve yüksek konsantrasyonlarda organik çözücüler için dayanıklı7,8, immobilize enzimatik sindirim izin % 80 Asetonitril9varlığında proteinler. Ayrıca, bir membran üzerinde immobilizasyon hedef proteinlerde Konformasyonel değişiklikleri neden olabilir, triptic sindirim verimliliği iyileştirmeler yol10. Buna göre, bu yazıda, bir on-membran sindirim tekniği kullanılarak protein etkileşimlerinin ımantioprecipitation-LC/MS/MS analizinin kullanımını tarif ettik. Bu basit yöntem, uzman olmayan laboratuvarlarda bile protein-protein etkileşimlerinin uygun analizini kolaylaştırır.

<table><tbody><tr><td>Asetonitril</td><td>Wako</td><td>014-00386</td><td></td></tr><tr><td>Sitrik asit</td><td>Wako</td><td>030-05525</td><td></td></tr><tr><td>DiNA</td><td>KYA Tech Co.</td><td></td><td>nanoflow yüksek performanslı sıvı kromatografisi</td></tr><tr><td>DiNa AI</td><td>KYA Tech Co.</td><td></td><td>otomatik örnekleyici ile donatılmış nanoflow yüksek performanslı sıvı kromatografisi</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Nacalai tesque</td><td>14112-94</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads protein G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>Formik asit</td><td>Wako</td><td>066-00461</td><td></td></tr><tr><td>HiQ Sil C18W-3</td><td>KYA Tech Co.</td><td>E03-100-100</td><td>0.10mmID * 100mmL</td></tr><tr><td>İyodoasetamid</td><td>Wako</td><td>095-02151</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>Yaşam Renkleri AV Monoklonal Antikor (JL-8)</td> <td>Clontech</td><td>632380</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>NH < alt > 4 HCO3</td><td>Wako</td><td>018-21742</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Sigma</td><td>N6507</td><td>poli (oksietelelen) oktilfenil eter (n = 9)</td></tr> <tr><td>peptit standardı</td><td>KYA Tech Co.</td><td>tBSA-04</td><td>sığır serum albümininin triptik sindirmeleri</td></tr><tr><td>PP flakon</td><td>KYA Tech Co.</td><td>03100S</td><td>plastik numune tüpü</td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü koktail</td><td>Sigma</td><td>P8465</td><td></td></tr><tr><td>ProteinPilot yazılımı</td><td>Protein tanımlaması için</td><td>Sciex</td><td>5034057</td> yazılımı</tr><tr><td>Sıralama Sınıfı Modifiye Tripsin</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>tripsin</td></tr><tr><td>Sodyum ortovanadat</td><td>Sigma</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik dihidrat</td><td>Sigma</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Wako</td><td>206-10731</td><td></td></tr><tr><td>tuzak sütunu</td><td>KYA Tech Co.</td><td>A03-05-001</td><td>0.5mmID * 1mmL</td></tr><tr><td>TripleTOF 5600 sistemi</td><td>Sciex</td><td>4466015</td><td>Hibrit dört kutuplu uçuş süresi tandem kütle spektrometresi</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Wako</td><td>207-06275</td><td></td></tr><tr><td>Ara-20</td><td>Wako</td><td>160-21211</td><td></td></tr></tbody></table>

bir on-membran sindirim tekniği kullanılarak protein-protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Çok sayıda hücre içi proteinler, hücre içi ve hücre dışı koşullara uygun olarak fiziksel olarak etkileşime girebilir. Nitekim, hücresel fonksiyonlar büyük ölçüde hücre içi protein-protein etkileşimleri bağlıdır. Bu nedenle, bu etkileşimler hakkında araştırma fizyolojik süreçlerin anlaşılması kolaylaştırılması için vazgeçilmez. İlişkili proteinlerin ortak yağış, ardından kütle spektrometresi (MS) analizi, yeni protein etkileşimlerini tanımlamanıza olanak sağlar. Bu çalışmada, protein-protein etkileşimlerinin analizinde membran sindirimi ile birlikte immünopetoziteksiyon-sıvı kromatografi (LC)-MS/MS analizinin yeni tekniğinin ayrıntılarını sağdık. Bu teknik, ham immünopantitants için uygundur ve proteomik analizlerin verimi artırabilir. Etiketlenmiş rekombinant proteinler belirli antikorlar kullanılarak çöktürülmüş; Sonraki, Poliviniliden difluorid membran parçaları üzerine şişkinlik immünoprecipitants redüktif alkilasyon maruz kalmıştır. Tripsinizasyon sonrasında, sindirilmiş protein kalıntıları LC-MS/MS kullanılarak incelenmiştir. bu tekniği kullanarak, birkaç aday ilişkili proteini tespit edebildik. Böylece, bu yöntem uygun ve yeni protein-protein etkileşimleri karakterizasyonu için yararlıdır.

Yukarıda açıklanan prosedür sayesinde, immünopmanitants LC-MS/MS (Şekil 1) kullanılarak analiz edildi. Exojen türev proteinlerin (diğer türler ve IgG 'Ler) dışlandıktan sonra, calpain-6 ' d a ilişkili immünopmasitantlar (Tablo 1) ve Gfp ile ilişkili immünopoitantlara 15 proteinler tespit edildi ( Tablo 2). Calpain-6 ve GFP ilişkili proteinlerin, 11 ' i her iki immünopabitantında da tespit edildi (Şekil 2<...

Burada, kütle spektrometresi için numunelerin hazırlanması için bir on-membran sindirim tekniği için bir protokol sunuyoruz. Bu teknik, protein-protein etkileşimlerinin uygun analizini kolaylaştırır.

Bir on-membran sindirim tekniği kullanılarak protein-protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Protein-protein etkileşiminin araştırılması, fizyolojik süreçlerin çeşitli alanlarda anlaşılması için vazgeçilmezdir. Bu videoda, araştırmacıların MS tarafından bağlayıcı proteinlerin kapsamlı bir analizini uygun bir şekilde yapmalarını sağlayan membran üzerinde sindirim tekniğini tanıtıyoruz. Bu tekniğin en büyük avantajı, proteinlerin poliakrilamid jel elektroforezile ayrılması gerekli olmadığı için ham immünopprecipitantlar için proteomik analizin kolaylığını artırabiliyor olmamızdır.Anti-GFP antikorlarını 500 mikrolitre sitrat fosfat tamponundaki boncuklarla karıştırarak antikorları manyetik boncuklara uygun hale getirmek için antikorları konjuge etmeye başlayın. Karışımı oda sıcaklığında bir saat boyunca 50 RPM'de döndürün. Ve sonra% 1 polisorbat 20 içeren sitrat fosfat tampon ile üç kez konjuge boncukyı yıkayın.Lyse transfected hücreleri el yazması yönlere göre. Çanak kazıyın ve 1.5 mililitrelik test tüpü içine lysate aktarın. Daha sonra 15, 000 x g'de beş dakika santrifüj ederek lysate'yi temizleyin ve supernatant'ı toplayın.500 mikrolitre sitrat fosfat tamponu ile üç kez yıkayarak etiketsiz manyetik boncuklar hazırlayın. Son yıkamadan sonra, tampon kaldırın ve boncuk hücre lysate ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 50 RPM'de döndürün.Manyetik stand üzerinde manyetik ayırma gerçekleştirin ve hücre lysate toplamak. Hedef proteinleri immünglobulin konjuge boncuklara bağlamak için boncukları beş dakika boyunca manyetik standa yerleştirin. Sitrat arabelleği atın ve boncuklar için hücre lysate ekleyin.Karışımı 50 RPM'de bir saat döndürün. Hedef proteinleri hedef olmayan serbest proteinlerden ayırmak için boncukları %1 polisorbat 20 içeren 500 mikrolitre sitrat fosfat tamponu ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, sitrat tampon 30 mikrolitre ekleyin ve boncuk hedef proteinleri temizlemek için oda sıcaklığında beş dakika oturup sağlar.Membranı hazırlamak için, PVDF membranları kullanılmadan hemen önce temizlenen cerrahi makaslar kullanarak 3 milimetrelik parçalara bölün. Alüminyum folyo üzerine membran parçaları yerleştirin ve her parça ya etanol iki ila beş mikrolitre ekleyin. Membranlar tamamen kurumadan önce, her parçaya elüent proteininin iki ila beş mikrolitresini ekleyin ve membran yüzeyi matlaşana kadar hava kurutun.Daha sonra membranları 1,5 mililitrelik tüplere aktarın ve onları dört santigrat derecede saklayın. Hemen kullanıyorsanız, onları hidrofilik yapacak etanol iki ila 30 mikrolitre ekleyin. Bir pipet ile etanol çıkarın, ancak membranlar kurumadan önce, tamamen her tüp için DTT tabanlı reaksiyon çözeltisi 200 mikrolitre ekleyin ve bir saat boyunca 56 derece santigrat onları kuluçka.Kuluçkadan sonra reaksiyon çözeltisini 300 mikrolitre iyodoasetamid çözeltisi ile değiştirin ve karanlıkta 45 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra membranları iki kez distile suyla ve bir kez de %2 asetonitile en az on saniye girdap ile yıkayın. Diaphanous ile ilgili asetonitril ile çalışmak son derece tehlikeli olabilir.Membran üzerinde sindirim işlemi yapılırken her zaman maske, gözlük ve eldiven takılmalıdır. El yazması talimatlara göre tripsin hazırlayın ve her membrana 100 mikrolitre tripsin reaksiyon çözeltisi ekleyin. Bir gecede 37 santigrat derecede sindirimi için kuluçkaya yatırın.Ertesi gün, reaksiyon çözeltisini temiz bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın ve membrana 100 mikrolitre yıkama çözeltisi ekleyin. Membranı 60 derecede iki saat kuluçkaya yatırın, ardından yıkama çözeltisini toplayın ve reaksiyon çözeltisi ile karıştırın. Membrana 100 mikrolitre daha yıkama solüsyonu ekleyin ve 10 dakika sonicate edin.Daha sonra yıkama çözeltisini toplayın ve reaksiyon çözeltisi ile karıştırın. Laboratuvar filmi bir parça ile test tüpü kapağı ve bir iğne ile filmde küçük delikler yapmak. Bir vakum konsantratörü kullanarak çözeltiyi kurutun ve kalıntıyı %2 formik asitin 10 mikrolitresinde çözün.Tüpü 12, 000 x g'de üç dakika santrifüj edin ve süpernatantı örnek bir tüpe aktarın. Nano LC/HPLC sistemine bağlı bir kütle spektrometresi kullanarak numuneyi analiz edin. Bu protokol kullanılarak Calpain-6 ilişkili immünopsipitantta 17, GFP ile ilişkili immünoppitetitantta 15 ve her ikisinde de 11 protein saptandı.Aday proteinin pozitif teşhisi için en az bir yüksek sadakat peptid parçasının saptanması gerektiğini belirtmek önemlidir. GFP ekspresyonu ile çökelen proteinlerin yanı sıra histones, ekzojen ve ribozomal proteinler listeden çıkarıldı. Membranların triptik sindirimden önce distile su ve %2 asetonitril ile yıkanması, proteinler üzerinde membran üstü sindirim işleminin en önemli adımıdır.Bu yöntemden sonra immünopreplit ve Batı leke analizi gibi diğer deneyler yaparak hedef proteinin birlikte çökeltmesini doğrulamak mümkündür. Bu basit yöntem araştırmacılar Uygun ve yüksek duyarlı analiz ile yeni protein-protein etkileşimleri keşfetmek için izin verir.

evaluation-proteinprotein-interactions-using-an-on-membrane-digestion

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu video kullanımı ile mikro-desenli yüzeyler, protein-protein etkileşimleri sonraki analizi ile deneyler gösterir. Bu yaklaşım, canlı hücreler protein etkileşimleri tespit etmek imkanı sunar ve kantitatif bilgileri ayıklamak imkanı ile yüksek verimlilik özellikleri bir araya getiriyor.

Mikro desenli Yüzeyler, protein-protein etkileşimleri-vivo Algılama

Test protein-protein etkileşim protein işlevsellik diseksiyon için vazgeçilmezdir. Burada, bir...

Protein Membran Kaplama Testi: Çözünür ve çözünmez Proteinler Arasında Etkileşim Test Protokolü In vitro</em

Tandem afinite saflaştırma proteinlerine bağlanma ortaklarının belirlenmesi için sağlam bir yaklaşımdır. Kavramı kanıtı olarak, bu metodoloji konak hücre faktörü için inisiyasyon dahil eş-tortu ile iyi karakterize çevirisi başlatma faktörü eIF4E uygulanmıştır. Bu yöntem, kolaylıkla bir hücre ya da viral proteini için uyarlanmıştır.

Tandem Affinity Arıtma kullanarak Protein etkileşim Ortaklar belirlenmesi

Kütle spektrometrisi (antipersonel mayınları) ile kombinasyon halinde etiketli proteinlerin saflaştırılması Affinity protein etkileşimi ağların sistematik eşleme için ve biyolojik süreçlerin mekanistik temeli araştırmak için güçlü bir yöntem. Burada, bakteri için geliştirilmiş optimize edilmiş sıralı peptid afinite (SPA) antipersonel mayınları prosedürü...

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Bu video, protein-protein etkileşim analizi için bir PVDF membranı üzerinde birlikte immünopresipite protein komplekslerini göstermektedir. Komplekslerden indirgenmiş proteinler, daha küçük peptitlerde tek tek proteinleri parçalamak için tripsin ile muamele edildi, daha sonra kalan peptitler PVDF zarından ekstrakte edildi. Kompleksteki her iki proteinden türetilen çekilen peptit daha sonra kurutuldu ve daha fazla analiz için düşük bir formik asit konsantrasyonunda yeniden süspanse edildi.

Etkileşim çalışmaları için birlikte immünopresipite edilmiş proteinleri hazırlamak için zar üzerinde protein sindirimi

Bir yaklaşım, biyokimyasal zar proteinlerinin in vivo protein-protein etkileşimleri (PPI) tanımlamak için tarif edilmektedir. Yöntem, protein çapraz-bağlama, afinite arıtma ve kütle spektrometrisi birleştirir, ve hemen hemen herhangi bir hücre tipi ya da organizma için uyarlanabilir. Bu yaklaşımla, geçici PPI bile tespiti mümkün olur.

Membran-OMURGA: Membran Proteinleri protein-protein etkileşimleri belirlemek için bir Biyokimyasal Aracı In Vivo

Burada, bir kriyojenik sıcaklıkta katı hal öğütme ile memeli hücrelerin bozulması Elde edilen hücre tozu, bir hücre, ekstrenin üretilmesi ve antikor-bağlı mikron çaplı paramanyetik taneler üzerine afinite yakalama ile ilgili protein kompleksleri izole etmek için protokoller tarif eder.

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Biz algılama deterjan-duyarlı sıralama reseptör, sortilin, GLUT4, glukoz taşıyıcı protein ilk luminal döngü için bağlama örnek olarak kullanarak zar proteinleri arasında bir köprü işlevi için bir iletişim kuralı tanımlamak.

Membran proteinlerinin Hofstede deterjan duyarlı tespiti

Protein-protein ve protein-metaboliti etkileşimler tüm hücresel fonksiyonları için önemlidir. Burada, biz seçim bir protein ile bu etkileşimlerin paralel analiz sağlayan bir protokol tanımlamak. Bizim iletişim kuralı bitki hücre kültürleri için optimize edildi ve benzeşme arıtma kütle spektrometresi tabanlı protein ve metaboliti algılama ile birleştirir.

2 in 1: tek adımlı benzeşme arıtma paralel analizi için Protein-Protein ve Protein-metaboliti kompleksleri

Burada, elektron mikroskopisi ile birlikte yerli hücreli membran nanopartikül sistemini kullanan membran proteinlerinin oligomerik durumunun belirlenmesi için bir protokol sunulmaktadır.

Membran Protein-Protein Etkileşim Analizi için Yerli Hücreli Membran Nanopartiküller Sistemi

Burada, kimyasal problar ve kütle spektrometrisi kullanarak doğal hücrelerden ve dokulardan hastalığa özgü protein-protein etkileşimlerinin yakalanmasını ve tanımlanmasını sağlamak için bir protokol sunuyoruz. Ortaya çıkan etkileşim veri kümeleri, dinamik ağ işlev bozukluklarını ve hastalıkla bağlantılı yol değişikliklerini ortaya çıkarmak için özel bir web tabanlı platform aracılığıyla analiz edilir.

Hastalıkta İşlevsel Olmayan Protein-Protein Etkileşimlerinin Haritalanması

Keşfedin, on-membran sindirim tekniğiyle protein-protein etkileşimlerini kütle spektrometrisi için hazırlama yöntemini. Bu yöntem, poliakrilamid jel elektroforezi gereksinimini ortadan kaldırarak proteomik analiz verimliliğini artırır.

Bir on-membran sindirim tekniği kullanılarak protein-protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet