Göreli ışık ve hacim elektron mikroskobu ile mitokondri ve endoplazmik reticulum görüntüleme

Bu hacimli elektron mikroskobu tekniği, 3 boyutlu bir yapının gözlemlemesi gereken biyolojik çalışmaların gerçeklemesi için kullanılır. Görüntü yeniden çekimlerden önce çubuk, saha görünümü ve örnek depolama alanı sunar. Fx2 Asan, hedef yapıların elektron testini artırmak için zayıflamayı katalize eden ve belirli bir ilgi hedefini bulmak için kullanılabilecek yol aşamalarını tasarlamıştır.

Bu parçacıklar membranöz organeller ve konak hücreler arasındaki etkileşimleri araştırmak için korbeli ışık ve 3-B elektron mikroskobu tekniğinin kullanımını birleştirir. Transfeksiyondan 16 ila 24 saat sonra, kültürü 30 ila 37 derece santigrat fiksasyon çözeltisi 250 mikrolitre ile nazikçe yıkayın. Yıkamayı 1,5 mililitre taze fiksasyon çözeltisi ile hızlı bir şekilde değiştirin ve kültürü 30 dakika boyunca buza yerleyin.

Kuluçka sonunda, üç on dakika yıkama başına buz gibi 0.1 molar sodyum cacodylate tampon bir mililitre yıkama hücreleri durular. Son yıkamadan sonra, buz üzerinde on dakikalık bir kuluçka için tabağa bir mililitre buz-soğuk 0 ila 4 derece 20 milimolar glisin çözeltisi ekleyin ve yıkama başına bir mililitre taze, soğuk 0,1 molar sodyum cacodylate tampon ile üç beş dakikalık yıkar. Ardından, hücreleri 500 mikrolitre taze hazırlanmış DAB çözeltisi ile etiketlayın.

Ve hücreleri yaklaşık 5-45 dakika boyunca buzüzerinde kuluçkaya yatırın. Ters ışık mikroskobu altında açık kahverengi bir leke görülebildiğinde, hücreleri bir mililitre taze, soğuk 0,1 molar sodyum kacodylate tamponuyla yıkama başına on dakika boyunca üç kez durulayın. Daha sonra, DAB boyamasını 100 kat daha yüksek bir büyütme veya daha yüksekte görselleştirmek ve ilgi alanının bulunduğu camın altını işaretlemek için faz kontrastı ters mikroskobu kullanın.

Elektron mikroskop bloğu örnek hazırlanması için, ilk sonra bir mililitre ile hücreleri düzeltmek 2% azaltılmış osmiyum tetroksit bir saat için dört santigrat derece. Fiksasyon sonunda, üç beş dakikalık yıkar ve yıkama başına taze distile su bir mililitre ile hücreleri durulayın. Hücreleri bir mililitre filtrelenmiş TCH çözeltisi ile 20 dakika tedavi etmeden önce.

Kuluçka sonunda, sadece gösterildiği gibi distile suda hücreleri üç kez yıkayın ve% 2 azaltılmış osmiyum tetroksit 30 dakikalık kuluçka ile hücreleri düzeltmek. İkinci fiksasyonun sonunda, hücreleri üç kez distile suile yıkayın ve bir mililitre sulu %1 uranyl asetat ile bir gecede ışıktan korunan 4 santigrat derecede kültürünü kapatın. Ertesi sabah, 60 derece santigrat bir mililitre ile boyama önce distile su ile hücreleri üç kez yıkayın 60 derece santigrat fırında 30 dakika walton kurşun aspartat çözeltisi ısıtılır.

Kuluçka sonunda, hücreleri üç kez distile suda yıkayın. Ve 20 dakikalık 2 mililitre etanol aliquots bir dereceli serisi kültür kuluçka. Son %100 etanol maruziyetinden sonra, hücreleri oda sıcaklığında düşük viskoziteli katıştırma karışımı ortamına üç ila bir etanolün mililitresinde 30 dakika kuluçkaya yatırın.

Kuluçka sonunda, oda sıcaklığında başka bir 30 dakika kuluçka için düşük viskoziteli gömme karışımı orta bir mililitre bir etanol ile orta değiştirin. Daha sonra, oda sıcaklığında ek bir 30 dakika için düşük viskoziteli gömme karışımı orta bir-üç etanol bir mililter ile orta değiştirin. Daha sonra, bir mililitre ile değiştirin 100% düşük viskoziteli gömme orta gecede, 60 santigrat derecede 24 saat boyunca% 100 düşük viskozite gömme karışımı örnek gömme ardından.

İletim elektron mikroskobu analizi için, ertesi gün, 90 nanometre kalınlığında kesitler elde etmek ve 200 kilovolt iletim elektron mikroskobu altında ızgara gözlemlemek için ultra mikrotom kullanın. Numune hazırlamaya başlamadan önce, 30 ila 60 saniye boyunca isopropanol nazik ajitasyon ile indium Kalay Oksit kaplı cam kapakları temizleyin. Ajitasyonun sonunda, fazla alkolü boşaltın ve kapakları tozsuz bir ortama yerleştirin.

Kapaklar kuruolduğunda, kapakları bir dakika boyunca kızdırmak için bir plazma kaplama kullanın. Daha sonra kapakları alt tabaka tutucuya takın ve substrat tutucuyu bıçaklı tekneye yerleştirin. Taramalı elektron mikroskobu için numune almak için, gömülü numune bloğunu ultramikrotomun numune tutucuya yerleştirin.

Ve tutucuyu kesme bloğuna ayarlayın. Bloğun yüzünün yamuk veya dikdörtgen bir şekil kazanması için hedef pozisyonun etrafındaki fazla reçiyiyi kesmek için bir jilet kullanın. Önde gelen ve sondaki kenarlar birbirine kesinlikle paralel olmalıdır.

Çok sayıda seri bölüm elde etmek kolay değildir. Ancak, öndeki kenarlara ve sondaki kenarlara tamamen paralel sahip olmak zorundasınız. Daha sonra, numune tutucuyu ultramikrotomun koluna takın.

Elmas bıçağı bıçak tutucuya yerleştirin ve bıçak teknesini filtrelenmiş distile suyla doldurun. Daha sonra, kapak kapaklarının kenarının bıçağa yakın olması için taşıyıcı konumunu ayarlamak için tutucunun sapını dikkatlice itin. Numuneyi aldıktan sonra, kesme işlemini durdurun, tüpün bağlama vidasını yavaşça açın ve su teknesini boşaltın.

Şerit toplama işlemi tamamlandığında, sıkma cihazının sapıyla alt katmanı çıkarın ve şeridi kurulayın. İlgi proteinleri ifade eden genetik etiketli plazmidlerin kullanımı, etiketlenmiş proteinler için boyama sonra transfected hedef hücrelerin belirlenmesini sağlar. Correlative ışık elektron mikroskobu daha sonra daha fazla etiketli hücre kültürünü görselleştirmek için kullanılabilir.

Örneğin, SCO1-APEX2 tarafından üretilen koyu leke mitokondrinin matris uzayında değil, sadece mitokondri intermembran uzayında görülür. Hem SCO1-APEX2 hem de HRP-KDEL plazmidleri ile transfected hücreleri mitokondriyal intermembran uzayda ve endoplazmik retikulumda son derece yoğun bir elektron sinyali ifade eder. Ancak sadece SCO1-APEX2 ile transfected hücrelerde endoplazmik retikulum boyama gözlenmez.

Elektron mikroskobu tarayarak seri görüntüleme için, tüm dizi görüntüsünün genel bir özeti geniş bir alan üzerinde bir geri dağılım elektron dedektörü kullanılarak oluşturulur. Daha sonra, ilgi bölgesi ilk bölüme yerleştirilir ve diğer tüm bölümlere yayılır. Son olarak, beş hedef hücre içeren ilgi bölgesi beş nanometre görüntülenmiş piksel ile görüntülenir.

Büyütme Golgi aparatı, mitokondri ve enpolasmik retikulum gibi ayrıntılı hücre altı yapıları ortaya çıkarır. Seri görüntüleme, endoplazmik retikulum-mitokondri kontakları farklı z-düzlemlerde meydana geldiğini açıkça ortaya koymaktadır. Belirli bir kimlik değişikliğinin etkilerini araştırmak için korenik ışık ve elektron mikroskobu kullanarak belirli bir hedef yapının nasıl bulunabildiğini iyi anlamalısınız.

Hacim elektron mikroskobu ile birlikte bu boyama teknikleri özellikle eurovirüs hücresel etkileşimleri araştırmak için daha büyük ölçekli EM için kullanılabilir. Glutaraldehit unutmayın, ayrıca enteterocide ve TCH çok toksik, bu yüzden koruyucu giysiler giymek ve bu malzemeleri kullanırken bir duman başlık çalışmak için emin olun.