Name: Göreli ışık ve hacim elektron mikroskobu ile mitokondri ve endoplazmik reticulum görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Öğrenin, göreli ışık ve hacim elektron mikroskobu ile mitokondri ve endoplazmik retikulumun hücresel dağılımını nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem, genetik modifikasyon sonrası organel dinamiklerini detaylı şekilde görüntülemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma tarafından desteklenmektedir KBRI temel araştırma programı Kore beyin Araştırma Enstitüsü Bakanlığı Bilim ve BIT tarafından finanse (19-BR-01-08), ve Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) Grant Kore hükümeti tarafından finanse (MSIT) (No. 2019R1A2C1010634). SCO1-APEX2 ve HRP-KDEL plazmids, Hyun-Woo Rhee (Seul Ulusal Üniversitesi) tarafından temin edildi. TEM verileri KBRı 'deki Brain Research Core tesisleri 'nde elde edildi.

1. SCO1-APEX2 ve HRP-KDEL Plasmid vektör ile desenli ızgara kültürü çanak ve hücre transfeksiyon ile hücre kültürü
<ol><li>Tohum 1 x 105 HEK293T hücreleri, 35-mm cam ızgara-altta kültür yemekleri içine yerleştirerek% 5 Co2 ' de 37 °c ' de bulunan bir nemlendirici atmosferde, Dulbecco 'nun modifiye kartal Orta (dmem) ile% 10 fetal Sığır serum, 100 U/ml ile tamamlayıcı Penisilin ve 100 U/mL streptomisin.</li>
	<li>Hücrelerin tohumlama sonrası gün, onlar% 50-60% konfluency yetiştiği zaman, SCO1-APEX210 ve HRP-kdel12 Plasmid, üreticinin talimatlarına göre transfeksiyon reakajı kullanarak hücrelere tanıtmak (SCO1-APEX2 cDNA 0,5 μg + HRP-KDEL plazmid DNA 0,5 μg başına 3 μL transfeksiyon reaktesi).</li>
</ol>2. APEX2 ve HRP için desenli kültür yemekleri ve DAB boyama üzerinde büyüyen hücrelerin ışık mikroskopisi
<ol><li>Transfeksiyondan sonra 16-24 h 'de, tüm kültür medyasını çıkarın ve hemen 250 μL sıcak (30-37 °C) sabitleme çözeltisi (Tablo 1) yumuşak pipetleme ile ekleyin. Hemen sabitleme çözümünü çıkarın ve 1,5 mL taze sabitleme çözeltisi ile değiştirin. 60 dk için buzda inküye ve sonra 1 mL buz-soğuk 0,1 M sodyum cacodylate tampon (Tablo 1) her 10 dakika için üç kez yıkayın. DIKKAT: aldehit dumanları son derece zehirlidir. Tüm çalışmaları havalandırmalı bir duman kaputu altında gerçekleştirin.</li>
	<li>1 ml soğuk (0-4 °C) 20 mM gcine solüsyonu ekleyin ve 10 dakika boyunca buzun üzerinde 3 adet 5 dk, 1 mL soğuk 0,1 M sodyum cacodylate tamponunun ardından inküye yapın.</li>
	<li>Yeni bir 1x DAB çözümü hazırlayın (3,33 mL 0,3 M cacodylate çözeltisi + 10 μL, 30% H2O2 + 5,67 ml soğuk su + 1 ml 10X DAB çözeltisi).</li>
	<li>Taze hazırlanmış 1x DAB çözeltisi (adım 2,3) 500 μL ekleyin ve hafif kahverengi leke ters ışık mikroskobu altında görünür olana kadar yaklaşık 5-45 dakika boyunca buzun üzerinde inküye yapın (Şekil 1a).</li>
	<li>DAB çözümünü yavaşça çıkarın ve 1 mL soğuk 0,1 M sodyum cacodylate tamponu ile üç kez durulayın ve her biri 10 dk.</li>
	<li>100 x veya daha yüksek bir büyütmede DAB boyama görselleştirmek için faz kontrast ters mikroskop (veya parlak alan ışık mikroskop) kullanın. İlgi alanı (ROı) bulunduğu bölgenin (Şekil 1B, C) bulunduğu camın alt kısmına işaretlemek için bir işaret kalemi kullanın.</li>
</ol>3. EM bloğu için numune hazırlama
<ol><li>2.1-2.6 adımda açıklandığı gibi hücre kültürünü ve DAB boyama gerçekleştirin.</li>
	<li>1 mL% 2 azaltılmış OsO4 ' ü 4 °c ' de 1 h 'ye kadar olan örnekleri Post-Fix. DIKKAT: OsO4 dumanı son derece zehirlidir. Tüm çalışmaları havalandırmalı bir duman kaputu altında gerçekleştirin.</li>
	<li>3,2 adım sırasında yeni TCH çözümü (Tablo 1) hazırlayın ve 0,22-μm filtresine geçin. DIKKAT: TCH dumanları son derece zehirlidir. Tüm çalışmaları havalandırmalı bir duman kaputu altında gerçekleştirin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında (RT) her biri 5 dakika boyunca 1 mL distile su ile sabitleme ve durulama üç kez çıkarın.</li>
	<li>Hücreleri, RT 'de 20 dakika boyunca önceden hazırlanmış ve filtrelenmiş TCH çözeltisi 1 mL 'ye yerleştirin.</li>
	<li>Hücreleri üç kez 1 mL distile su ile 5 dakika boyunca RT 'de durulayın.</li>
	<li>Hücre, RT 'de 30 dakika boyunca damıtılmış suda% 2 osmiyum tetrokid 1 mL 'ye ikinci kez maruz bırakmayın.</li>
	<li>Her RT 'de 5 dakika boyunca 1 mL distile su ile sabitleme ve durulama üç kez çıkarın. 1% 1 mL uranyl asetat (sulu) ekleyin ve gece 4 °C ' de karanlıkta bırakın.</li>
	<li>Hücreleri üç kez 1 mL distile suda 5 dakika boyunca RT 'de yıkayın.</li>
	<li>60 °C ' de 30 dakika boyunca sıcak Walton 'ın kurşun aspartat çözeltisi (Tablo 1) bir fırında.</li>
	<li>Ön ısıtılmış kurşun aspartat çözeltisi 1 mL ekleyerek Walton 'un kurşun aspartat solüsyonu ile hücreleri leke ve daha sonra 60 °C ' de 30 dakika için bir fırında yerleştirin.</li>
	<li>Hücreleri üç kez 1 mL distile su ile 5 dakika boyunca RT 'de durulayın.</li>
	<li>2-ml etanol plakaya (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%,% 100) dereceli bir dizi içinde inküat RT 'de 20 dk.</li>
	<li>Etanol ve 1 mL 3:1 etanol: düşük viskozite gömme karışımı orta RT olarak 30 dakika boyunca inkük.</li>
	<li>Orta çıkarın ve 1 mL 1:1 etanol ekleyin: düşük viskozite gömme karışımı orta. RT 'de 30 dakika boyunca inküye yapın.</li>
	<li>Orta çıkarın ve 1 mL 1:3 etanol ekleyin: düşük viskozite gömme karışımı orta. RT 'de 30 dakika boyunca inküye yapın.</li>
	<li>Orta kaldırın ve 1 mL 100% düşük viskozite gömme ortam ekleyin ve bir gecede inküye.</li>
	<li>Numuneyi 100% düşük viskoziteli gömme karışımıyla katıştırın ve 60 °C ' de 24 saat boyunca inküye yapın.</li>
	<li>90-nm kalın bölümleri ultrayicrotome kullanarak hazırlayın.</li>
	<li>200 kV 'de TEM altında ızgaraya uyun.</li>
</ol>4. SEM görüntüleme için ındum-kalay-oksit kaplı coverfon seri sekleme ve montaj
<ol><li>
Substrat hazırlama
	<ol>
<li>30-60 s için izopropanol içinde nazik ajitasyon ile temiz indium-kalay-oksit (ITO) kaplı cam Cover, (22 mm x 22 mm).</li>
		<li>Kapağı çıkarın, aşırı isopropanol boşaltın ve kuru kadar tozsuz bir ortamda bırakın.</li>
		<li>1 dakika boyunca bir plazma kaplayıcı kullanarak Ito-kaplamalı cam coverl 'i kızdırma deşarj ile tedavi edin. Not: plazma aktivasyonu, substrat yüzeyinde hidrofilik bir özellik oluşturmaktadır. Bu bölüm substrat bağlı olduğunda bölümlerde kırışıklık oluşumu önlemek için substrat su çok ince bir film oluşturur.</li>
		<li>ITO-kaplamalı cam kaplamaları, substrat tutucusuna yerleştirin ve bıçak teknesine yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Numune bloğunun ve seri bölümleme, kırpma
	<ol>
<li>Örnek bloğu ultrayicrotome örnek tutucusuna yerleştirin ve kırpma bloğuna ayarlayın.</li>
		<li>Hedef pozisyondaki tüm aşırı reçineyi kırpmak için bir jilet kullanın (adım 2,6, Şekil 1D-Golarak tanımlanır). Blok yüzün şekli yamuk veya dikdörtgen olmalıdır. Önde gelen kenar ve sondaki kenar kesinlikle paralel olmalıdır (Şekil 1h, ı).</li>
		<li>Örnek tutucuyu ultraticrotomenin kolunun üzerine takın ve elmas bıçağı bıçak tutucusuna yerleştirin. ITO cam kaplamaları şerit taşıyıcısına takın ve taşıyıcıyı kolu (Şekil 1J) ile kelepçeler. Şerit taşıyıcıyı bıçak teknesine ayarlayın ve bıçak teknesini filtrelenmiş damıtılmış suyla doldurun (Şekil 1K).</li>
		<li>ITO camının kenarını bıçağa yakın bir şekilde ayarlamak için tutucunun kolunu dikkatlice itmek suretiyle taşıyıcı pozisyonunu bıçağın kaydırağı ile ayarlayın (Şekil 1L).</li>
		<li>Bölümü kestikten sonra, kesit sürecini durdurun ve tüpün sıkma vidasını yavaşça açın ve su teknesini (saniyede bir damla su debisi) boşaltın.</li>
		<li>Şerit toplama sürecini tamamladıktan sonra, sıkıştırma cihazının kolu ile substrat çıkarın ve şeridini kurutun (Şekil 1m).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. SEM ve SEM görüntü yığını hizalama görüntüleme
<ol><li>Ito kaplı lamel magazini yapışkan karbon bant ile alüminyum tutucular monte edin. Cam yüzeyini ve yüzeyi yapışkan karbon bant ile mühürleyin ve sonra 10 Nm kalınlığında karbon katmanıyla kat (Şekil 1N).</li>
	<li>5 kV 'lik düşük ivme voltajında bir alan emisyonu SEM 'de Ito kaplı lamel magazini ve verimli bses koleksiyonu için uygun bir çalışma mesafesi gözleyin.</li>
	<li>Seri görüntüleri görüntü J yazılımı (Fiji)13 sanal yığın seçeneğini kullanarak alın. Yeni bir TrakEM14açın ve trakem içine görüntü yığını alın. Sağ fare düğmesini tıklatın ve Hizalama menüsünü seçin.</li>
	<li>Ardından görüntü aralığını seçin (ilk görüntüden son görüntüye). Otomatik hizalamayı tamamlayın, hizalanmış veri kümesini kaydedin ve seçili görüntü aralığından (ilk görüntüden son görüntüye) düz bir görüntü derlemek için Dışa Aktar 'ı seçin. Son olarak, düz görüntü verilerini görüntü J ana menüsünde AVI formatında kaydedin. Not: ek film 1 ve ek film 2 , sırasıyla SEM Image yığınını ve kırpılmış görüntü yığınını göster.</li>
</ol>6. seri görüntülerden mitokondri ve ER segmentasyon
<ol><li>IMOD15 yazılım ve açık görüntü dosyalarında 3dmod başlatın.</li>
	<li>ZaP penceresinde, orta fare düğmesini kullanarak mitokondri ve ER kontur çizin.</li>
	<li>Bölümlere ayrılmış birimi görselleştirmek için model görünümü penceresini açın (ek film 3).</li>
</ol>

<ol><li>Krols, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-associated+membranes+as+hubs+for+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-associated membranes as hubs for neurodegeneration.</a> Acta Neuropathologica. 131 (4), 505-523 (2016).</li>
<li>Svendsen, E. J., Pedersen, R., Moen, A., Bjork, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+perspectives+on+restraint+during+medical+procedures+in+paediatric+care%3A+a+qualitative+interview+study+with+nurses+and+physicians%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Qualitative+Studies+on+Health+and+Well-being%22%5BJournal%5D)">Exploring perspectives on restraint during medical procedures in paediatric care: a qualitative interview study with nurses and physicians.</a> International Journal of Qualitative Studies on Health and Well-being. 12 (1), 1363623(2017).</li>
<li>Shim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li>
<li>Csordas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+features+and+significance+of+the+physical+linkage+between+ER+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria.</a> The Journal of Cell Biology. 174 (7), 915-921 (2006).</li>
<li>Kremer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+3D+SEM+in+a+broad+biological+context%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Developing 3D SEM in a broad biological context.</a> Journal of Microscopy. 259 (2), 80-96 (2015).</li>
<li>Titze, B., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+scanning+electron+microscopy+for+imaging+biological+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure.</a> Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).</li>
<li>Burel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+targeted+3D+EM+and+correlative+microscopy+method+using+SEM+array+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography.</a> Development. 145 (12), (2018).</li>
<li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+tomography%3A+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li>
<li>Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+staining+method+%28OTO%29+for+enhancing+contrast+of+lipid--containing+membranes+and+droplets+in+osmium+tetroxide--fixed+tissue+with+osmiophilic+thiocarbohydrazide%28TCH%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid--containing membranes and droplets in osmium tetroxide--fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH).</a> The Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).</li>
<li>Lee, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APEX+Fingerprinting+Reveals+the+Subcellular+Localization+of+Proteins+of+Interest%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">APEX Fingerprinting Reveals the Subcellular Localization of Proteins of Interest.</a> Cell Reports. 15 (8), 1837-1847 (2016).</li>
<li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li>
<li>Schikorski, T., Young, S. M., Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horseradish+peroxidase+cDNA+as+a+marker+for+electron+microscopy+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Horseradish peroxidase cDNA as a marker for electron microscopy in neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 165 (2), 210-215 (2007).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLOS ONE. 7 (6), 38011(2012).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li>
<li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+tag+for+correlated+light+and+electron+microscopy+of+intact+cells%2C+tissues%2C+and+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms.</a> PLOS Biology. 9 (4), 1001041(2011).</li>
<li>Kijanka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+immuno-gold+labeling+protocol+for+nanobody-based+detection+of+HER2+in+breast+cancer+cells+using+immuno-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel immuno-gold labeling protocol for nanobody-based detection of HER2 in breast cancer cells using immuno-electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 199 (1), 1-11 (2017).</li>
<li>Ariotti, N., Hall, T. E., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light+and+electron+microscopic+detection+of+GFP-labeled+proteins+using+modular+APEX%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Correlative light and electron microscopic detection of GFP-labeled proteins using modular APEX.</a> Methods in Cell Biology. 140, 105-121 (2017).</li>
<li>Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-volume+en-bloc+staining+for+electron+microscopy-based+connectomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics.</a> Nature Communications. 6, 7923(2015).</li>
<li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genetically+Encoded+Tag+for+Correlated+Light+and+Electron+Microscopy+of+Intact+Cells%2C+Tissues%2C+and+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms.</a> PLOS Biology. 9 (4), 1001041(2011).</li>
<li>Horstmann, H., Vasileva, M., Kuner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photooxidation-Guided+Ultrastructural+Identification+and+Analysis+of+Cells+in+Neuronal+Tissue+Labeled+with+Green+Fluorescent+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Photooxidation-Guided Ultrastructural Identification and Analysis of Cells in Neuronal Tissue Labeled with Green Fluorescent Protein.</a> PLOS ONE. 8 (5), 64764(2013).</li>
<li>Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+using+the+genetically+encoded+APEX2+tag+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells.</a> Nature Protocols. 12 (9), 1792-1816 (2017).</li>
<li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li>
<li>Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+target+protein+localization+in+3D+using+the+combination+of+FIB-SEM+and+APEX2%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Biophysics+Reports%22%5BJournal%5D)">Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

EM kullanarak bir nanometre çözünürlükte belirli proteinlerin hücresel lokalizasyonu belirlenmesi proteinlerin hücresel işlevlerini anlamak için çok önemlidir. Genellikle, EM aracılığıyla bir hedef protein lokalizasyonu incelemek için iki teknikleri vardır. Bir immünogold tekniği, hangi EM 1960 beri kullanılan ve diğer bir teknik son zamanlarda geliştirilen genetik kodlu Etiketler16kullanarak olduğunu. Geleneksel immünogold teknikleri, etiketli protein yerini göstermek için antikor-konjuçe altın p...

Mitokondri ve endoplazmik retikulum (er) membran bağlı hücresel organellerdir. Onların bağlantı fonksiyonları için gerekli olan ve proteinleri ağ ile ilgili1tanımlanmıştır. Mitokondri ve ER arasındaki mesafe yaklaşık 100 Nm ışık mikroskobu kullanarak bildirilmiştir2; Ancak, son süper çözünürlüklü microskopi3 ve elektron mikroskobu (EM)4 çalışmalar yaklaşık 10-25 Nm, önemli ölçüde daha küçük olduğunu ortaya koydu. Süper çözünürlüklü mikroskopide elde edilen çözünürlük EM 'den daha düşüktür ve özel etiketleme gereklidir. EM, mitokondri ve ER arasındaki bağlantıların yapısal çalışmaları için yeterince yüksek çözünürlüklü kontrast elde etmek için uygun bir tekniktir. Ancak, ince bölümler geleneksel iletim elektron mikroskobu (TEM) için yaklaşık 60 Nm veya daha ince olması gerektiğinden, sınırlı z ekseni bilgileri dezavantajı. Yeterli EM z ekseni görüntüleme için üç boyutlu elektron mikroskobu (3DEM)5kullanılabilir. Ancak, bu tüm hücrelerin ince seri bölümlerin yüzlerce hazırlanması içerir, bu çok zor bir iştir sadece birkaç yetenekli teknolojistler hakim var. Bu ince bölümler, kırılgan formvar film kaplı tek delikli TEM ızgaraları üzerinde toplanır. Film bir gird üzerinde kırarsa, seri görüntüleme ve hacim yeniden yapılanma mümkün değildir. Seri blok-yüz tarama elektron mikroskobu (SBEM) bir elmas bıçak (dik-SBEM) ya da bir odaklı iyon ışın (FıB-SEM) ile Tarama elektron mikroskop (SEM) vakum odası içinde yıkıcı en bloğun bölünmesi kullanan 3DEM için popüler bir tekniktir 6. ancak, bu teknikler tüm tesislerinde mevcut olmadığından, biz dizi tomografi7 seri kesme ve SEM kullanarak öneririz. Dizi tomografi, bir ultralotome kullanılarak kesilmiş seri bölümler bir Tem ızgara yerine bir cam lamel magazini aktarılır ve ışık mikroskobu ve SEM8aracılığıyla görselleştirildi. Backscatter Electron (BSE) görüntülemenin sinyalini geliştirmek için, osmiofilik thiocarbohidazid (TCH)9ile sabit hücreler olan bir en bloklu em boyama protokolüne (OSO4) Çift boyama sonrası katıştırma.
Ayrıca, mitokondriyal Marker SCO1 (sitokrom c oksidaz montaj protein 1) – askorbat peroksidaz 2 (APEX2)10 moleküler etiket em düzeyinde mitokondri görselleştirmek için kullanıldı. APEX2 yaklaşık 28 kDa ve soya askorbat peroksitase11türetilmiştir. Özel proteinlerin EM seviyesinde ayrıntılı yerini, yeşil floresan protein etiketli proteinin ışık mikroskobu içinde kullanıldığı şekilde göstermek için geliştirilmiştir. APEX2, kofaktör hidrojen peroksit (H2O2) varlığında etiketin yerinde çözünebilir bir osmiophic polimer içine 3, 3 '-diaminobenzidine (DAB) dönüştürür. APEX2, tüm hücrenin derinliği boyunca bir protein lokalizasyonu ile EM 'de geleneksel antikor etiketleme alternatifi olarak kullanılabilir. Başka bir deyişle, APEX2-etiketlenmiş protein, Ultra-kriyobölümlemeden sonra immünogeski etiketleme ve geçirgen olmadan spesifik osmikasyon11 ile görselleştirilebilir. Horserpu peroksidaz (HRP) Ayrıca, OsO4ile tedavi EDILDIKTEN sonra em kontrast sağlayan, lokalize bir çökelme Içine DAB H2O2bağımlı polimerizasyonu katalizleyen hassas bir etikettir. ER hedef peptid serisi HRP-KDEL (LYS-ASP-Glu-Leu)12 tüm hücre içinde er görselleştirmek için uygulandı. Genetik etiketlerin kullanılması ve en az osmiyum ve TCH (rOTO yöntemi) ile aynı anda osmikasyon etkisini kullanarak blok boyama ile ilgili protokollerimizi değerlendirmek için, membranı kontrast ile ve rOTO en bloğunda her genetik etiketin kullanmadan karşılaştırdık. Dizi tomografi ve DAB boyama ile APEX ve HRP ile 3DEM, sırasıyla, diğer amaçlar için kullanılmıştır, çünkü biz 3DEM için dizi tomografi ve mitokondri ve ER etiketleme için DAB boyama kombine var bizim protokol benzersizdir. Özellikle, biz hücrelerde genetik modifikasyon etkisini araştırırken destekli aynı bölümde APEX Tagged genleri ile ve olmadan beş hücre gösterdi.

<table><tbody><tr><td>Gluteraldehit</td><td>EMS</td><td>16200</td><td>Sadece çeker ocakta kullanım</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>EMS</td><td>19210</td><td>Sadece çeker ocakta kullanın</td></tr><tr><td>Sodyum kakodilat</td><td>EMS</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>Osmiyum tetroksit %4 sulu çözelti</td><td>EMS</td><td>16320</td><td>Sadece çeker ocakta kullanın</td></tr><tr><td>Epon 812</td><td>EMS</td><td>14120</td><td>EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0.8 ml</td></tr><tr><td>Ultra mikrotom Leica ARTOS 3D</td><td>Leica</td><td>ARTOS 3D</td><td></td></tr><tr><td>Uranil asetat</td><td>EMS</td><td>22400</td><td>Tehlikeli kimyasal</td></tr><tr><td>Kurşun sitrat</td><td>EMS</td><td>17900</td><td></td></tr><tr><td>35mm Izgaralı lamel çanak</td><td>Mattek</td><td>P35G-1.5-14-CGRD</td><td></td></tr><tr><td>Kızdırma boşaltıcı</td><td>Pelco</td><td>easiGlow</td><td></td></tr><tr><td>Formvar karbon kaplı Bakır Izgara</td><td>Ted Pella</td><td>01805-F</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>SIGMA</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>SIGMA</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>3,3 & prime; -diaminobenzamidin (DAB)</td> <td>SIGMA</td><td>D8001</td><td>Tehlikeli kimyasal</td></tr><tr><td>% 30 Hidrojen peroksit çözeltisi</td><td>Merck</td><td>107210</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum hekzasiyanoferrat(II) trihidrat</td><td>SIGMA</td><td>P3289</td><td></td></tr><tr><td>0.22 um şırınga filtresi</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>Tiyokarbonildihidrazid</td><td>SIGMA</td><td>223220</td><td>Sadece davlumbazda kullanın</td></tr><tr><td>Potasyum hidroksit</td><td>Fluka</td><td>10193426</td><td></td></tr><tr><td>L-aspartik asit</td><td>SIGMA</td><td>A9256</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyon elektron mikroskobu</td><td>FEI</td><td>Tecnai G2</td><td></td></tr><tr><td>İndiyum kalay oksit (ITO) kaplı cam lameller</td><td>SPI</td><td>06489-AB</td><td>kırılgan cam</td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Fisher Biyoreaktifler</td><td>BP2618-1</td><td></td></tr><tr><td>Elmas bıçak</td><td>Leica</td><td>AT-4</td><td></td></tr><tr><td>Inveted ışık mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>ECLipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Taramalı elektron mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>Auriga</td><td></td></tr></tbody></table>

göreli ışık ve hacim elektron mikroskobu ile mitokondri ve endoplazmik reticulum görüntüleme

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Mitokondri ve endoplazmik retikulum (er) gibi hücresel organeller, çeşitli fonksiyonları gerçekleştirmek için bir ağ oluşturur. Bu son derece kavisli yapılar, hücresel koşullara bağlı olarak dinamik bir ağ oluşturmak için çeşitli şekillerde katlanmış. Mitokondri ve ER arasında bu ağın görselleştirme süper çözünürlüklü floresan görüntüleme ve ışık mikroskobu kullanılarak denenmiştir; Ancak, sınırlı çözünürlük mitokondri ve ER arasındaki membranları ayrıntılı olarak gözlemlemek için yeterli değildir. Şanzıman Elektron Mikroskopisi, hücresel organizerin gözlem için iyi membran kontrast ve nanometre ölçekli çözünürlük sağlar; Ancak, son derece eğri organelleri üç boyutlu (3B) yapısını değerlendirirken son derece zaman alıcı. Bu nedenle, mitokondri ve er 'in bağıntılı ışık-elektron mikroskobu (Clem) ve hacim elektron mikroskopi teknikleri ile gelişmiş askorbat peroksidaz 2 ve horserpu peroksidaz boyama kullanılarak morfolojisini gözlemledik. 3B yapıyı gözlemlemek için en blok boyama yöntemi, ultra ince seri sekleme (dizi tomografi) ve hacim elektron mikroskobu uygulandı. Bu protokolde, mitokondri ve ER 'in ayrıntılı yapısal çalışmalarını gerçekleştirmek için CLEM ve 3D elektron mikroskobu kombinasyonunu öneriyoruz.

Şekil 1 , bu protokol için zamanlama ve iş akışını açıklar. Protokol 7 gün gerektirir; Ancak, SEM görüntüleme için harcanan zamana bağlı olarak, bu artabilir. Hücre transfeksiyon için, hücrelerin konflukans tüm ızgara plaka alt kapak değil olarak kontrol edilmelidir (Şekil 1a). Yüksek hücreli yoğunluk, ışık mikroskobu ve EM gözlem sırasında ilgi hücresinin tanımlanmasını engelleyebilir. Biz APEX2 ve HRP verimli kültür çanak sayısız kültürlü hücreler arasında transfekte hücreleri seçmek i...

Genetik modifikasyondan sonra tüm hücrelerde mitokondri ve endoplazmik retiplinin dağılımını incelemek için bir protokol sunuyoruz, askorbat peroksidaz 2 ve horserpu peroksidaz boyama da dahil olmak üzere bağıntılı ışık ve hacim Elektron Mikroskopisi kullanılarak aynı bölümde hedef geni olan ve olmayan hücrelerin seri bölümlemesi ve elektron mikroskobu ile seri görüntüleme.

Göreli ışık ve hacim elektron mikroskobu ile mitokondri ve endoplazmik reticulum görüntüleme

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Bu hacimli elektron mikroskobu tekniği, 3 boyutlu bir yapının gözlemlemesi gereken biyolojik çalışmaların gerçeklemesi için kullanılır. Görüntü yeniden çekimlerden önce çubuk, saha görünümü ve örnek depolama alanı sunar. Fx2 Asan, hedef yapıların elektron testini artırmak için zayıflamayı katalize eden ve belirli bir ilgi hedefini bulmak için kullanılabilecek yol aşamalarını tasarlamıştır.Bu parçacıklar membranöz organeller ve konak hücreler arasındaki etkileşimleri araştırmak için korbeli ışık ve 3-B elektron mikroskobu tekniğinin kullanımını birleştirir. Transfeksiyondan 16 ila 24 saat sonra, kültürü 30 ila 37 derece santigrat fiksasyon çözeltisi 250 mikrolitre ile nazikçe yıkayın. Yıkamayı 1,5 mililitre taze fiksasyon çözeltisi ile hızlı bir şekilde değiştirin ve kültürü 30 dakika boyunca buza yerleyin.Kuluçka sonunda, üç on dakika yıkama başına buz gibi 0.1 molar sodyum cacodylate tampon bir mililitre yıkama hücreleri durular. Son yıkamadan sonra, buz üzerinde on dakikalık bir kuluçka için tabağa bir mililitre buz-soğuk 0 ila 4 derece 20 milimolar glisin çözeltisi ekleyin ve yıkama başına bir mililitre taze, soğuk 0,1 molar sodyum cacodylate tampon ile üç beş dakikalık yıkar. Ardından, hücreleri 500 mikrolitre taze hazırlanmış DAB çözeltisi ile etiketlayın.Ve hücreleri yaklaşık 5-45 dakika boyunca buzüzerinde kuluçkaya yatırın. Ters ışık mikroskobu altında açık kahverengi bir leke görülebildiğinde, hücreleri bir mililitre taze, soğuk 0,1 molar sodyum kacodylate tamponuyla yıkama başına on dakika boyunca üç kez durulayın. Daha sonra, DAB boyamasını 100 kat daha yüksek bir büyütme veya daha yüksekte görselleştirmek ve ilgi alanının bulunduğu camın altını işaretlemek için faz kontrastı ters mikroskobu kullanın.Elektron mikroskop bloğu örnek hazırlanması için, ilk sonra bir mililitre ile hücreleri düzeltmek 2% azaltılmış osmiyum tetroksit bir saat için dört santigrat derece. Fiksasyon sonunda, üç beş dakikalık yıkar ve yıkama başına taze distile su bir mililitre ile hücreleri durulayın. Hücreleri bir mililitre filtrelenmiş TCH çözeltisi ile 20 dakika tedavi etmeden önce.Kuluçka sonunda, sadece gösterildiği gibi distile suda hücreleri üç kez yıkayın ve% 2 azaltılmış osmiyum tetroksit 30 dakikalık kuluçka ile hücreleri düzeltmek. İkinci fiksasyonun sonunda, hücreleri üç kez distile suile yıkayın ve bir mililitre sulu %1 uranyl asetat ile bir gecede ışıktan korunan 4 santigrat derecede kültürünü kapatın. Ertesi sabah, 60 derece santigrat bir mililitre ile boyama önce distile su ile hücreleri üç kez yıkayın 60 derece santigrat fırında 30 dakika walton kurşun aspartat çözeltisi ısıtılır.Kuluçka sonunda, hücreleri üç kez distile suda yıkayın. Ve 20 dakikalık 2 mililitre etanol aliquots bir dereceli serisi kültür kuluçka. Son %100 etanol maruziyetinden sonra, hücreleri oda sıcaklığında düşük viskoziteli katıştırma karışımı ortamına üç ila bir etanolün mililitresinde 30 dakika kuluçkaya yatırın.Kuluçka sonunda, oda sıcaklığında başka bir 30 dakika kuluçka için düşük viskoziteli gömme karışımı orta bir mililitre bir etanol ile orta değiştirin. Daha sonra, oda sıcaklığında ek bir 30 dakika için düşük viskoziteli gömme karışımı orta bir-üç etanol bir mililter ile orta değiştirin. Daha sonra, bir mililitre ile değiştirin 100% düşük viskoziteli gömme orta gecede, 60 santigrat derecede 24 saat boyunca% 100 düşük viskozite gömme karışımı örnek gömme ardından.İletim elektron mikroskobu analizi için, ertesi gün, 90 nanometre kalınlığında kesitler elde etmek ve 200 kilovolt iletim elektron mikroskobu altında ızgara gözlemlemek için ultra mikrotom kullanın. Numune hazırlamaya başlamadan önce, 30 ila 60 saniye boyunca isopropanol nazik ajitasyon ile indium Kalay Oksit kaplı cam kapakları temizleyin. Ajitasyonun sonunda, fazla alkolü boşaltın ve kapakları tozsuz bir ortama yerleştirin.Kapaklar kuruolduğunda, kapakları bir dakika boyunca kızdırmak için bir plazma kaplama kullanın. Daha sonra kapakları alt tabaka tutucuya takın ve substrat tutucuyu bıçaklı tekneye yerleştirin. Taramalı elektron mikroskobu için numune almak için, gömülü numune bloğunu ultramikrotomun numune tutucuya yerleştirin.Ve tutucuyu kesme bloğuna ayarlayın. Bloğun yüzünün yamuk veya dikdörtgen bir şekil kazanması için hedef pozisyonun etrafındaki fazla reçiyiyi kesmek için bir jilet kullanın. Önde gelen ve sondaki kenarlar birbirine kesinlikle paralel olmalıdır.Çok sayıda seri bölüm elde etmek kolay değildir. Ancak, öndeki kenarlara ve sondaki kenarlara tamamen paralel sahip olmak zorundasınız. Daha sonra, numune tutucuyu ultramikrotomun koluna takın.Elmas bıçağı bıçak tutucuya yerleştirin ve bıçak teknesini filtrelenmiş distile suyla doldurun. Daha sonra, kapak kapaklarının kenarının bıçağa yakın olması için taşıyıcı konumunu ayarlamak için tutucunun sapını dikkatlice itin. Numuneyi aldıktan sonra, kesme işlemini durdurun, tüpün bağlama vidasını yavaşça açın ve su teknesini boşaltın.Şerit toplama işlemi tamamlandığında, sıkma cihazının sapıyla alt katmanı çıkarın ve şeridi kurulayın. İlgi proteinleri ifade eden genetik etiketli plazmidlerin kullanımı, etiketlenmiş proteinler için boyama sonra transfected hedef hücrelerin belirlenmesini sağlar. Correlative ışık elektron mikroskobu daha sonra daha fazla etiketli hücre kültürünü görselleştirmek için kullanılabilir.Örneğin, SCO1-APEX2 tarafından üretilen koyu leke mitokondrinin matris uzayında değil, sadece mitokondri intermembran uzayında görülür. Hem SCO1-APEX2 hem de HRP-KDEL plazmidleri ile transfected hücreleri mitokondriyal intermembran uzayda ve endoplazmik retikulumda son derece yoğun bir elektron sinyali ifade eder. Ancak sadece SCO1-APEX2 ile transfected hücrelerde endoplazmik retikulum boyama gözlenmez.Elektron mikroskobu tarayarak seri görüntüleme için, tüm dizi görüntüsünün genel bir özeti geniş bir alan üzerinde bir geri dağılım elektron dedektörü kullanılarak oluşturulur. Daha sonra, ilgi bölgesi ilk bölüme yerleştirilir ve diğer tüm bölümlere yayılır. Son olarak, beş hedef hücre içeren ilgi bölgesi beş nanometre görüntülenmiş piksel ile görüntülenir.Büyütme Golgi aparatı, mitokondri ve enpolasmik retikulum gibi ayrıntılı hücre altı yapıları ortaya çıkarır. Seri görüntüleme, endoplazmik retikulum-mitokondri kontakları farklı z-düzlemlerde meydana geldiğini açıkça ortaya koymaktadır. Belirli bir kimlik değişikliğinin etkilerini araştırmak için korenik ışık ve elektron mikroskobu kullanarak belirli bir hedef yapının nasıl bulunabildiğini iyi anlamalısınız.Hacim elektron mikroskobu ile birlikte bu boyama teknikleri özellikle eurovirüs hücresel etkileşimleri araştırmak için daha büyük ölçekli EM için kullanılabilir. Glutaraldehit unutmayın, ayrıca enteterocide ve TCH çok toksik, bu yüzden koruyucu giysiler giymek ve bu malzemeleri kullanırken bir duman başlık çalışmak için emin olun.

mitochondria-endoplasmic-reticulum-imaging-correlative-light-volume

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

CLEM tekniği enjekte edilen moleküller tarafından etkilenen membranlar, organeller ve hücre içi yapıların ultrastrüktürel morfolojisini analiz etmek için adapte edilmiştir. Bu yöntem çok nanometre çözünürlükte milimetre izin mikromanipülasyon / mikroenjeksiyon güçlü teknikleri, konfokal floresan mikroskopi ve elektron mikroskopi birleştirir. Bu teknik, uygulamaların geniş bir çeşitliliği için müsait.

Bir Aracı Olarak Korelatif Işık ve Elektron Mikroskobu (CLEM) microinjected Moleküller ve Ökaryotik Alt hücresel Hedefler Visualize&#39;a

Biz yüksek hızlı 3D canlı hücre floresan ışık mikroskobu ve yüksek çözünürlüklü kriyo-elektron tomografi birleştiren bir karşılıklı mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır. Biz burada görüntüleme, dinamik ana HeLa hücreleri ile etkileşime küçük bir HIV-1 parçacıkların bağıntılı yöntemin özelliği göstermektedir.

Dinamik Etkileşimler 3D Yapısal Analiz için karşılıklı Mikroskopi

Biz canlı hücre konfokal görüntüleme vasıtasıyla, endoplazmik retikulum (ER) içerisinde yerleşik transfekte floresan protein dağılımı ve hareketliliği incelemek için kullanılan görüntüleme yaklaşımı tarif eder. Biz de ultrastruktural bu subselüler bölmesinin mimarisi üzerine kendi ifade etkisini analiz.

Kültür Hücrelerinin retikulum Subdomain&#39;ler Görselleştirme

Kuantum nokta (QD) nanopartiküllerinin epoksi gömülü insan patoloji dokusunun korelasyon immünositokimyasal çalışmaları için kullanılabileceği bir yöntem tanımlanmıştır. Geniş alan floresan ışık mikroskobu ve transmisyon elektron mikroskobu ile görselleştirilen ticari antikor fragmanı konjuge QD'ler kullanıyoruz.

Kuantum Nokta Nanopartiküller kullanma Korelatif Işık- ve Elektron Mikroskobu

Burada, sabit hücrelerde endoplazmik retikulum ve mitokondri arasındaki endojen etkileşimleri görselleştirmek ve yüksek hassasiyet ile ölçmek için bir prosedür açıklanmaktadır. Protokol, bir mitokondri ilişkili zar arayüzünde inositol 1,4,5-trifosfat reseptörü / glukoz-regüle proteini 75 / voltaj bağımlı anyon kanalı / siklofilin D kompleksi hedefleyen in situ yakınlık ligasyonu deneyinde optimize özellikleri.

Endoplazmik retikulum ve mitokondri Etkileşimleri Çalışma ile<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity ligasyon Testi Sabit Hücrelerde

Karaciğerden hepatositlerdeki organeller veya diğer dokulardaki hücreler arasındaki membran temas bölgelerinin üç boyutlu ayrıntılarını elde etmek için basit ve kapsamlı bir protokoldür.

Hepatositlerde Organeller Arası Temas Bölgelerinin Seri Kesitli Elektron Mikroskobu Kullanılarak Üç Boyutlu Karakterizasyonu

Burada, hücresel üst yapı ile ilgili olarak nadir proteinlerin lokalizasyonunu araştırmak için bir araç olarak endojen, floresan etiketlemeye dayalı optimize edilmiş kesit korelasyonlu ışık-elektron mikroskobu için bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşımın gücü, Bafilomisin tedavisi olmadan aç bırakılmış hücrelerde endojen LC3'ün ultrastrüktürel lokalizasyonu ile gösterilmiştir.

Kesit Üzerinde Korbağül Işık-Elektron Mikroskobu ile Endojen LC3'ün Ultrastrüktürel Lokalizasyonu

Bu protokol, yüksek doğruluk, yüksek çözünürlük ve yüksek verim ile 3D görüntüleme elde etmek için mitokondriyal cristae'nin nasıl yeniden yapılandırılacağını açıklar.

Pankreas Kanseri Hücrelerinde Mitokondriyal Ultrastrüktürel Değişikliklerin Görselleştirilmesi için Üç Boyutlu Bir Teknik

mScarlet adı verilen bir floresan proteini kullanarak Epon gömme sonrası bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, floresan ve üst yapıyı aynı anda koruyabilir. Bu teknik, çok çeşitli biyolojik uygulamalara uygundur.

Epon Post Gömme Korbağıntılı Işık ve Elektron Mikroskobu

Bu protokol, retinal fotoreseptör terminallerinin yapısal özelliklerine odaklanarak, hacim elektron mikroskobu için retina örneklerinin hazırlanması için ayrıntılı adımları açıklar.

Hacim elektron mikroskobu için retina örneklerinin hazırlanması

Bu protokol, sırasıyla mEosEM ve APEX2 ile etiketlenmiş mitokondri ve lizozomların etkileşimini görselleştirmek için bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu kullanmak için bir mekanizmayı açıklar.

Mitokondri ve Lizozomlar Arasındaki Etkileşimlerin Görselleştirilmesi için Çift Renkli İlişkili Işık ve Elektron Mikroskobu

Öğrenin, göreli ışık ve hacim elektron mikroskobu ile mitokondri ve endoplazmik retikulumun hücresel dağılımını nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem, genetik modifikasyon sonrası organel dinamiklerini detaylı şekilde görüntülemenizi sağlar.

Göreli ışık ve hacim elektron mikroskobu ile mitokondri ve endoplazmik reticulum görüntüleme

Daha fazla video keşfet