Vibrio fischeri Izolatlar arasında rekabetçi etkileşimleri ölçmek için kokuluçak assay

Protokolümüz, Vibrio fischeri bakterilerinin farklı suşları arasındaki rekabet mekanizmalarını belirlemek ve karakterize etmek için basit ama sağlam bir yaklaşım sağlar. Bu yöntem, farklı antibiyotik direnci genlerini kodlayan kararlı plazmidler ve karışık bir kültürde her bakterisi farklıseçip görsel ayrımcılığa olanak tanıyan floresan proteinler kullanır. Başlamak için, pirinç bir tane büyüklüğünde agar plaka hücreleri kazımak için steril bir kürdan kullanın.

LBS suyu bir mililitre içeren bir 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp hücreleri resuspend. Hücre kümelerini ayırmak için tüpün kenarına bastırın ve sonra pipetleri şiddetle yukarı ve aşağı doğru bastırın. Tüpü ve girdabı 1-2 saniye kapatın ve hücre kümeleri örnek görsel olarak düzgün olana kadar hala görünürse tekrarlayın.

Tüm numuneler için hücre kazıma girdap için bu hazırlık adımları tekrarlayın. Tüm numuneler için optik yoğunluğu 600 nanometre olarak ölçün ve kaydedin. Doğru bir OD ölçümü elde etmek için, lbs suyu kullanarak numuneleri 10 kata kadar seyreltin.

Daha sonra her numuneyi istenilen OD 600'e normalleştirin. Referans gerilimi ve rakip gerilimi bire bir oranında karıştırmak için, 1,5 mililitrelik centrifuge tüpüne ve girdabA 1-2 saniye boyunca od 1.0'a normalleştirilmiş her bir suştan 100 mikrolitre ekleyin. Bir kontrol olarak, referans türünü kendisinin ve girdabın farklı etiketli bir sürümüyle karıştırın.

Deneyin sonucunu önemli ölçüde değiştirebileceğinden doğru başlangıç oranını elde etmek çok önemlidir. Başarıyı sağlamak için, bu adım belirli bir bakteri türleri için optimizasyon gerektirebilir. Her biyolojik çoğaltma için bu adımı tekrarladıktan sonra, kontrol olarak farklı etiketlenmiş referans suşları ve farklı etiketli referans ve rakip suşları ile dört biyolojik çoğaltma ile dört biyolojik çoğaltmalar olmalıdır.

Kuluçka dan sonra floresan mikroskopisi için kullanılacak kültür lekeleri yapmak için, LBS agar içeren bir Petri plaka üzerine her kontrol ve deneysel karışımı 10 mikrolitre ekleyin. Lekeler tezgahta tamamen kuruduktan sonra, 24 derece santigrat derecede 24 saat boyunca plakaları kuluçkaya yatırın. Deney sonunda her bir suşu oluşturan koloni oluşturan birimleri ölçmek için kullanılacak kültür lekeleri yapmak için, her bir kontrol ve deneysel karışımları 10 mikrolitre eklemek 24 kuyu plakaları 24 kuyu plakaları içinde LBS agar bir mililitre içeren.

Lekeler tamamen kuruduktan sonra, plakaları 24 derecede beş saat kuluçkaya yatırın. Başlangıç coincubaation karışımları bir seri seyreltme gerçekleştirmek için, sekiz sütun ve 12 satır böylece 96 iyi plaka 90 derece döndürün. Her satırı zorlanma kimliği, çoğaltma numarası ve t sıfırile başlayan süre ile etiketlayın.

Etiket LBS agar plakaları her antibiyotik plaka için seçerek hangi zorlanma belirlemek için emin olun yaparken seyreltme serisi nokta için uygun antibiyotik ile takviye. Çok kanallı pipet ile, her kuyuya 180 mikrolitre LBS suyu ekleyin ve seyreltilmemiş coincubation karışımı için ilk sütunu boş bırakın. 200 mikrolitrelik tek kanallı pipet kullanarak, 100 mikrolitre coincubaation karışımını tüpten ilk sütunun ilk kuyuya aktarın, sonra ucu atın ve tüm coincubaation karışımları için tekrarlayın.

Çok kanallı pipetle, 20 mikrolitreyi birinci sütundan ikinci sütuna ve pipetleri yukarı ve aşağı karıştırmak için aktarın. Her seyreltme için yukarı ve aşağı boru lama sayısı ile tutarlı olarak her sütun için ipuçlarını atın ve tekrarlayın. Sonunda, her satır ilk karışımın 10 kat seri seyreltme içerecektir.

Bir seyreltme serisi ve referans zorlanma için seçer Kanamisin takviyeLBS agar plaka üzerine nokta her kuyudan beş mikrolitre aspire etmek için sekiz ipuçları ile donatılmış bir çok kanallı pipet kullanın. Kloramphenicol takviyeplaka üzerine rakip zorlanma tespit için seçmek için bu adımı tekrarlayın. Lekeler tamamen kuruduktan sonra, 24 santigrat derece kuvözde plakaları yerleştirin.

Coincubation noktalar ve 24 kuyu plakaları 24 santigrat derece beş saat kuluçka ya da sonra, her kuyu ya LBS suyu bir mililitre ekleyin. Tüm hücreler tüm çoğaltmalar arasında yeniden askıya alındığı canlılıkla tutarlı olana kadar yukarı ve aşağı borular oluşturarak yeniden askıya alın. Her coincubation nokta resuspended sonra, daha önce yapılan aynı şekilde seyreltme nokta için uygun antibiyotikler ile bir seri seyreltme ve LBS agar plakaları için 96 iyi plaka hazırlamak.

24 kuyu plakasında t son ölçümler için seri seyreltme tamamlamak için, başlangıç inoculum seri seyreltme için kullanılan adımları gerçekleştirmek ve daha önce yapılan LBS agar plakaları üzerinde her seyreltme nokta. Petri plakaları üzerindeki coincubation noktalarını görüntülemeye ve el yazmasında açıklandığı gibi veri analizine devam edin. Deneysel tedavide, deney başlangıcında ve sonunda kontrol tedavisiile uyumlu referans zorlanma ve rakip zorlanma 0,5 oranında mevcuttur.

Log RCI değerleri kontrol tedavisi için veya referans zorlanma rakip zorlanma bir ile kuluçkaya yattığında istatistiksel olarak sıfırdan farklı değildi. Bu veriler, referans ve rakip zorlanma arasında bir rekabet olmadığını göstermektedir. Buna karşılık, referans zorlanma rakip zorlanma iki ile kuluçkaya yattığında, referans zorlanma deney sonunda 0,01 daha az bir oranda başında 0,5 oranında netti.

Ayrıca, referans zorlanma rakip zorlanma iki ile kuluçkaya yatırıldığında günlük RCI değerleri sıfırdan önemli ölçüde daha büyüktü. Bu veriler birlikte, rakip zorlanma nın varlığında referans geriliminin oranının azaldığını göstermektedir. Referans zorlanma rakip zorlanma bir ile kuluçka yadadığında, her iki suş CTÜ beş saat boyunca arttı ve hiçbir rekabet meydana geldiğini düşündüren önemli ölçüde farklı değildi.

Ayrıca, yaklaşık %3200 iyileşme gözlendi ve bu durum kontrolden istatistiksel olarak farklı değildi. Ancak, referans zorlanma rakip zorlanma iki ile kuluçkaya yattığında, referans zorlanma CPU'lar beş saat içinde kontrol iki CPU zorlanma önemli ölçüde daha düşüktü. Ayrıca, yaklaşık% 4 iyileşme kontrol den önemli ölçüde daha düşük gözlendi.

Bu veriler, iki suş uncamanın hücrelerini öldürerek referans zorlanmasıyla yarıştığını gösteriyor. Bu yordamdaki en önemli adım, sonuçları önemli ölçüde etkileebileceğinden doğru başlangıç oranını elde etmektir.