Name: Teleost beyin ve hipofiz kan damarlarının bir dıı-fixative ile kardiyak perfüzyon kullanarak etiketleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-13T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Öğrenin, teleost balıkların beyin ve hipofiz kan damarlarını DiI içeren fiksatifle kardiyak perfüzyon kullanarak etiketleme yöntemini. Bu hızlı ve uyarlanabilir teknik, Oryzias latipes modelinde vasküler anatomiyi incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Shinji kanda 'ya Medaka 'da fikratif solüsyon, Bayan Lourdes Carreon G tan ve illüstrasyonlar için Bay Anthony Peltier ile kalp perfüzyon gösterimi için teşekkür ederiz. Bu çalışma NMBU ve Norveç Araştırma Konseyi tarafından finanse edildi, Grant numarası 248828 (Digital Life Norveç programı).

Tüm hayvan elleçleme, Norveç Yaşam Bilimleri Üniversitesi 'nde araştırma hayvanlarının bakımı ve refahı için tavsiyelerine göre ve yetkili müfettişlerin gözetiminde yapıldı.
1. enstrümanlar ve çözümlerin hazırlanması
<ol><li>Hazırlamak dıı stok solüsyonu çözünme 5 mg dıı kristal 1,5 mL plastik tüp ile 1 mL 96% EtOH. 30 s için Vortex ve alüminyum folyo kullanılarak kaplı tutun. Not: Dıı stok solüsyonu birkaç ay boyunca karanlıkta-20 °C ' de kullanılabilir.</li>
	<li>Balık tutucusu hazırlayın (Şekil 1a) 5 cm uzunluğunda, 3 cm genişliğinde ve 2 cm kalınlığında bir polistiren parçasını keserek ve 9 cm çapında plastik bir tabak yapıştırarak. Polistiren bir neşter bıçağı ile 3 cm tekne şeklinde bir delik olun.</li>
	<li>İğne ekstremite 30-50 cm uzunluğunda plastik kanül ekleyerek perfkullanma sistemi (Şekil 2) hazırlayın.</li>
	<li>Hazırlamak 40 mL taze 4% paraformaldehit çözeltisi (PFA) ile seyreltilerek 10 mL 16% PFA ile 30 mL fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) bir 50 mL plastik tüp.</li>
	<li>10 ml plastik tüpte 9 mL taze hazırlanmış 4% PFA olarak 1 mL dıı stok çözeltisi seyreltilerek 10 mL fixative/dıı çözeltisi hazırlayın. Kullanıma kadar karanlıkta tutun. Not: Çözülmüş olmayan dıı kristalleri stok çözüm tüpü tutulabilir, ve yeni etanol yeni dıı stok çözümü hazırlamak için eklenebilir (bkz. Adım 1,1).</li>
	<li>
Hazırlamak 50 mL tricaine (MS-222) stok.
	<ol>
<li>Çözülür 200 H2O, 48 ml 'de tricaine toz mg. 2 ml 1 M Tris tabanı (pH 9) ekleyin. 1 M HCl ile pH 7 ' ye ayarlayın ve-20 °C ' de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Küçük bir cam 50 mL temiz su içinde Tricaine stokta 5 mL seyreltmeli.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarını takiben bir pipet çektirme ile cam kapiller uzatarak 5 cm 'lik cam pipetleri (Şekil 2) hazırlayın.</li>
</ol>2. diseksiyon ve perfüzyon
Not: PFA toksik uçucu bir bileşiktir, bu nedenle diseksiyon ve perfüzyon bir kaput veya havalandırmalı bir odada yapılmalıdır, ve Kullanıcı bir gaz maskesi giymelidir.
<ol><li>Diseksiyon öncesinde küçük makas ve bir keskin ve bir güçlü forseps dahil diseksiyon araçlarını hazırlayın.</li>
	<li>50 mL tüp içine yerleştirerek ve yukarı çizim, PFA/dıı hazırlanmış çözeltisi ile şırınga doldurun. Sonra iğneleri şırınganın ekstremite kanül ile yerleştirin (Şekil 2).</li>
	<li>Farklı yönlere yerleştirilen bant birkaç parça kullanarak tezgah için şırınga Fix, mikroskopla konumunu ayarlamak ve diseksiyon için iyi bir pozisyon elde etmek ve şırınga piston basarak için koltuk (Şekil 1B). Not: Bu protokolde, dirsek şırınga pistonu aşağı basmak için kullanılır, ancak diğer olanaklar seçenekleri, örneğin, başka bir kişiden yardım kullanılabilir.</li>
	<li>Adım 1,7 hazırlanan çözüme balık yerleştirerek tricaine aşırı doz ile balık euthanize. 30 s bekleyin ve forseps ile kaudal Fin kaparak balık refleksleri test edin. Balık, uyaranlara yanıt vermemeye çalışırken kullanılabilir.</li>
	<li>Balık tutucusu ile karın yukarı dönük ve kafa ekstremite içine bir iğne pin ve kuyruk üzerinde başka bir yerde balık tutmak için balığı yerleştirin.</li>
	<li>Yatay cildin yüzeysel tabakası keserek makas ile ön karın açın.</li>
	<li>Forseps kullanarak, ventrikül ve bulbus arteriozus açık bir erişim sağlanıncaya kadar kalbin üstündeki cildi çıkarın (Şekil 3).</li>
	<li>Kapiller ekstremite bir cam pipet ekleyin ve Cam Pipet ucunun ucunu kırın. Not: Kırık ucu delik yeterince sıvı dışarı izin büyük olmalıdır, ama hala yeterince kolayca doku girmek için küçük. Cam Pipet kırık veya tıkanmış değilse yeniden kullanılabilir.</li>
	<li>Cam Pipet ventrikül yakın getirin ve sıvı dışarı zorlamak için dirsek ile şırınga pistonlu basınç ekleyin.</li>
	<li>Şırınga basınç eklerken kalp ventrikül cam pipet ile pin.</li>
	<li>Doğrudan sonra, kan dolaşımı bırakmak için forseps ile Sinüs Venozus Perforeli. Not: Kalp ventrikül, sabitleme nedeniyle daha kırılgan hale gelir. Ayrıca, kan fixative/dıı çözeltisi ile seyreltilmiş olarak daha az kırmızı olur.</li>
	<li>Ventrikül gelen, bulbus arteriosus girişini bulmak için cam pipet açısını ayarlayın. Şekil 2' de görüldüğü gibi, pipet açılışını bulbus arteriozus içine getirin ve şırıngaya daha fazla basınç ekleyin. Not: Bulbus arteriozus saydamdır ve doku elastiktir. Dıı/fixative ile kan değiştirirken, kalbin içindeki Cam Pipet daha görünür hale gelir ve basınç ekleyerek, bulbus arteriozus boyutu genişletmek gerekir. Bu adım yeterli basınç fixative/dıı çözeltisi ile tüm kanı değiştirmek için kullanılan ve tüm kan damarlarına ulaşıldı emin olmak için çok önemlidir. Sıklıkla başarılı olduğunda, PFA kas kasılmaları provoke eder ve balık hareket edecektir.</li>
	<li>30-60 için şırıngaya basınç eklemeye devam edin, hala bulbus arteriosus içinde cam pipet tutuyor.</li>
	<li>Cam Pipet ve iğneleri balıklardan çıkarın.</li>
	<li>Beyin ve hipofiz incelemek ve oda sıcaklığında karanlıkta 2 h için PBS içinde taze% 4 PFA dokuları inkük. Not: Daha önce beyin ve hipofiz diseksiyonu Fontaine et al.26 ve ager-Wick ve al.27tarafından iki farklı şekilde ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Sabitleme nedeniyle, doku oldukça zor hale gelir ve beyin ve hipofiz arasındaki kırılgan bağlantı kırık olabilir. Diseksiyon sonrası sabitleme işleme, 4 °C ' de bir gecede gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>Görüntüleme için hazırlanmadan önce 10 dakika boyunca PBS 'de dokusu iki kez durulayın. Not: Daha sonra doku, kaydırma ve kapak kayma arasında, konfeti görüntüleme için orta boşluklu ve montaj ortamına takılabilir (bkz. Şekil 4) veya Fontaine ve al.26 ' da ayrıntılı olarak açıklandığı gibi bir vibratomla kesilebilir bir stereomikoskop ile görüntüleme için slayt ve kapak slip (bkz. Şekil 4).</li>
</ol>

<ol><li>Nishida, N., Yano, H., Nishida, T., Kamura, T., Kojiro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular+Health+and+Risk+Management%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in cancer.</a> Vascular Health and Risk Management. 2 (3), 213-219 (2006).</li>
<li>Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+morphogenesis+and+the+formation+of+vascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Vascular morphogenesis and the formation of vascular networks.</a> Developmental Cell. 6 (4), 479-482 (2004).</li>
<li>Magistretti, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMagistretti%2C+PJ+%22Brain+energy+metabolism+in+Fundamental+neuroscience%22">Brain energy metabolism in Fundamental neuroscience</a>. Zigmond, M., et al. , Academic Press. 389-413 (1999).</li>
<li>Weltzien, F. A., Andersson, E., Andersen, O., Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain-pituitary-gonad+axis+in+male+teleosts%2C+with+special+emphasis+on+flatfish+%28Pleuronectiformes%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+-+Part+A%3A+Molecular+%26+Integrative+Physiology%22%5BJournal%5D)">The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes).</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular & Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).</li>
<li>Ooi, G. T., Tawadros, N., Escalona, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+cell+lines+and+their+endocrine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Pituitary cell lines and their endocrine applications.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 1-21 (2004).</li>
<li>Knigge, K. M., Scott, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+median+eminence%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the median eminence.</a> American Journal of Anatomy. 129 (2), 223-243 (1970).</li>
<li>Ball, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothalamic+control+of+the+pars+distalis+in+fishes%2C+amphibians%2C+and+reptiles%5BTitle%5D)+AND+%22General+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles.</a> General Comparative Endocrinology. 44 (2), 135-170 (1981).</li>
<li>Knowles, F., Vollrath, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+contacts+between+neurosecretory+fibres+and+pituicytes+in+the+pituitary+of+the+eel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synaptic contacts between neurosecretory fibres and pituicytes in the pituitary of the eel.</a> Nature. 206 (4989), 1168(1965).</li>
<li>Knowles, F., Vollrath, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosecretory+innervation+of+the+pituitary+of+the+eels+Anguilla+and+Conger+I.+The+structure+and+ultrastructure+of+the+neuro-intermediate+lobe+under+normal+and+experimental+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Neurosecretory innervation of the pituitary of the eels Anguilla and Conger I. The structure and ultrastructure of the neuro-intermediate lobe under normal and experimental conditions.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 250 (768), 311-327 (1966).</li>
<li>Golan, M., Zelinger, E., Zohar, Y., Levavi-Sivan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+GnRH-Gonadotrope-Vasculature+Reveals+a+Dual+Mode+of+Gonadotropin+Regulation+in+Fish%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Architecture of GnRH-Gonadotrope-Vasculature Reveals a Dual Mode of Gonadotropin Regulation in Fish.</a> Endocrinology. 156 (11), 4163-4173 (2015).</li>
<li>Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+anatomy+of+the+developing+zebrafish%3A+an+atlas+of+embryonic+and+early+larval+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development.</a> Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).</li>
<li>Cha, Y. R., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+experimental+analysis+of+blood+vessel+formation+using+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+C%3A+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Visualization and experimental analysis of blood vessel formation using transgenic zebrafish.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 81 (4), 286-296 (2007).</li>
<li>Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+blood+vessels+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging blood vessels in the zebrafish.</a> Methods Cell Biology. 100, 27-54 (2010).</li>
<li>Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+Diffusion+in+Phospholipid+Multibilayers+Measured+by+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Lateral Diffusion in Phospholipid Multibilayers Measured by Fluorescence Recovery after Photobleaching.</a> Biochemistry. 16 (17), 3936-3941 (1977).</li>
<li>Schlessinger, J., Axelrod, D., Koppel, D. E., Webb, W. W., Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+Transport+of+a+Lipid+Probe+and+Labeled+Proteins+on+a+Cell-Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lateral Transport of a Lipid Probe and Labeled Proteins on a Cell-Membrane.</a> Science. 195 (4275), 307-309 (1977).</li>
<li>Johnson, M., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+Diffusion+in+Plasma-Membrane+of+Mouse+Egg+Is+Restricted+after+Fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lateral Diffusion in Plasma-Membrane of Mouse Egg Is Restricted after Fertilization.</a> Nature. 272 (5652), 448-450 (1978).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbocyanine+Dye+Orientation+in+Red-Cell+Membrane+Studied+by+Microscopic+Fluorescence+Polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Carbocyanine Dye Orientation in Red-Cell Membrane Studied by Microscopic Fluorescence Polarization.</a> Biophysical Journal. 26 (3), 557-573 (1979).</li>
<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Carbocyanine+Dyes+Allow+Living+Neurons+of+Identified+Origin+to+Be+Studied+in+Long-Term+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Carbocyanine Dyes Allow Living Neurons of Identified Origin to Be Studied in Long-Term Cultures.</a> Journal of Cell Biology. 103 (1), 171-187 (1986).</li>
<li>Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+in+developing+visual+systems+with+a+new+method+of+staining+neurones+and+their+processes+in+fixed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue.</a> Development. 101 (4), 697-713 (1987).</li>
<li>Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+Fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde Fixation.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).</li>
<li>Puchtler, H., Meloan, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Chemistry+of+Formaldehyde+Fixation+and+Its+Effects+on+Immunohistochemical+Reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">On the Chemistry of Formaldehyde Fixation and Its Effects on Immunohistochemical Reactions.</a> Histochemistry. 82 (3), 201-204 (1985).</li>
<li>Hoetelmans, R. W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acetone%2C+methanol%2C+or+paraformaldehyde+on+cellular+structure%2C+visualized+by+reflection+contrast+microscopy+and+transmission+and+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Immunohistochemistry+%26+Molecular+Morphology%22%5BJournal%5D)">Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy.</a> Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).</li>
<li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+fixation+methods%3A+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Vibrational+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li>
<li>Li, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).</li>
<li>Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medaka--a+model+organism+from+the+far+East%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Genetic%22%5BJournal%5D)">Medaka--a model organism from the far East.</a> Nature Review Genetic. 3 (1), 53-64 (2002).</li>
<li>Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healthy+Brain-pituitary+Slices+for+Electrophysiological+Investigations+of+Pituitary+Cells+in+Teleost+Fish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish.</a> Journal of Visual Experiments. (138), 57790(2018).</li>
<li>Ager-Wick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+High-quality+Primary+Cell+Culture+from+Fish+Pituitaries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries.</a> Journal of Visual Experiments. (138), 58159(2018).</li>
<li>Hildahl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+tracing+of+luteinizing+hormone+beta-subunit+gene+expression+using+green+fluorescent+protein+transgenic+medaka+%28Oryzias+latipes%29+reveals+a+putative+novel+developmental+function%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Developmental tracing of luteinizing hormone beta-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function.</a> Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).</li>
<li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC Bioinformatics. 11, 274(2010).</li>
<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dil+and+diO%3A+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends Neurosciences. 12 (9), 333-335 (1989).</li>
<li>Fontaine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+Neurons+Controlling+Anterior+Pituitary+Functions%3A+Anatomy+and+Ontogenesis+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic Neurons Controlling Anterior Pituitary Functions: Anatomy and Ontogenesis in Zebrafish.</a> Endocrinology. 156 (8), 2934-2948 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar açıklamak için hiçbir şey var

Dıı ile kardiyak perfüzyon daha önce birkaç model türleri kan damarlarını etiket için kullanılan24, teleost balık dahil13.
Dıı doğrudan endotel hücre membranına damar içindeki perfüzyon ile teslim edildiği gibi, fixatif çözelti içinde dıı konsantrasyonu artırarak sinyal-gürültü oranını artırmak mümkündür. Buna ek olarak, fluorophore nispeten uzun ömürlü emisyon sağlayan minimal beyazlatma ile heyecanlı zaman yoğun boyama sağlar<sup cla...

Tüm organlar için gerekli besin, oksijen ve hormonal sinyaller sağlamak gibi kan damarlarının omurga vücudun önemli bir parçası oynamak. Ayrıca, kanser gelişimi1, onların katılımı keşif beri, onlar klinik araştırmalarda çok dikkat aldılar. Her ne kadar yayınlar bir dizi kan damarının büyümesi ve morfojenine izin veren mekanizmaları araştırmış olsa da, oluşumları için önemli olan çok sayıda gen tespit edilmiştir2, bir lot etkileşimi ile ilgili anlaşılabilir kalır hücreler, dokular ve dolaşım kanı arasında.
Beyin ve hipofiz kan damar görselleştirme önemlidir. Beynin nöronlar oksijen ve glukoz3yüksek bir tedarik gerektirir ve hipofiz beyinden sinyal almak ve farklı kendi hormonları göndermek için kan akışını kullanan sekiz önemli hormon üreten hücre tipleri içerir Periferik organlar4,5. Memelilerde ise, hipotalamus tabanında Portal sistemi Median Kardinal adlı, beyin ve hipofiz6bağlar, böyle bir açık kan Köprüsü teleost balık tarif edilmedi. Gerçekten de, teleosts, preoptico-hipotalamik nöronlar doğrudan hipofiz pars nervoza içine akons proje7 ve çoğunlukla farklı endokrin hücre türleri doğrudan invate8,9. Ancak, bazı bu nöronların sinir uçları ekstrasküler uzayda bulunan, kan kapillaries yakın çevresinde10. Bu nedenle, teleost balık ve memeliler arasındaki fark o kadar açık değildir, ve kan damar ve beyin ve hipofiz hücreleri arasındaki ilişki teleost balık daha fazla soruşturma gerektirir.
Zebrafish, birçok yönden, anatomik ve fonksiyonel olarak karşılaştırılabilir damar sistemi diğer omurgacı türler11vardır. Vasküler sistemin bileşenlerinin floresan muhabir proteinleri12ile etiketlendiği çeşitli transjenik hatların geliştirilmesi sayesinde kardiyovasküler araştırmalar için güçlü bir omurga modeli haline gelmiştir. Ancak, tam dolaşım sistemi anatomisi türler arasında, hatta aynı türe ait iki kişi arasında farklılık gösterebilir. Bu nedenle, kan damarlarının görselleştirme nakliyle araçları mevcut olmayan diğer teleost türler de yüksek ilgi olabilir.
Çeşitli teknikler hem memeliler ve teleosts kan damarlarında etiket açıklanmıştır. Bu, damar spesifik genler için situ hibridizasyon dahil, alkalin fosfataz boyama, mikroanjiyografi, ve boya enjeksiyonları (bir inceleme için bakınız13). Floresan lipophilik katyonik indocarbocyanine boya (diI) ilk olarak lipid bilayers korunur ve bunu üzerinden göç edebilir membran lipidler lateral hareketlilik çalışması için kullanılan14,15,16. Nitekim, dıı bir molekül iki hidrokarbon zincirleri ve chromophores oluşur. Hidrokarbon zincirleri ile temas hücrelerinde lipid fosfolipid hücre membranı entegre iken, chromophores yüzeyinde kalır17. Membranda, dıı molekülleri, DLI çözeltisi ile doğrudan temas etmeyen membran yapılarını lekeleymenize yardımcı olan lipid fosfolipid içinde lateral olarak diffdür. Kardiyak perfüzyon yoluyla bir dıı çözeltisi enjekte, bu nedenle kan damarlarının doğrudan etiketleme sağlayan bileşik ile temas tüm endotel hücreleri etiketleyecektir. Bugün dıı aynı zamanda tek molekül görüntüleme, kader haritalama ve nöronal izleme gibi diğer boyama amaçları için kullanılır. İlginçtir, çeşitli fluorophores var (emisyon farklı dalga boyları ile) Diğer Floresan etiketleri ile kombinasyon sağlayan, ve birleşme yanı sıra dıı lateral difüzyon hem canlı ve sabit dokularda oluşabilir18, 19 yaşında.
1893 yılında Ferdinand Blum tarafından keşfedilen formaldehit, doku fikyasyonu için tercih edilen kimyasal olarak günümüze kadar yaygın olarak kullanılmıştır20,21. Çoğu hücresel hedefler için geniş spesifisite gösterir ve hücresel yapısı22,23korur. Aynı zamanda en fluorophores floresan özelliklerini korur, ve böylece hedeflenen hücreler floresan muhabir proteinleri ifade etmek için transgenik hayvanları sabitmek için kullanılabilir.
Bu yazıda, küçük deneysel memelilerde24 kan damarları etiketlemek için geliştirilen bir önceki protokol balık kullanımına adapte edilmiştir. Tüm prosedür gerçekleştirmek için sadece birkaç saat sürer. Doğrudan beyin ve model balık Medaka hipofiz tüm kan damarlarını etiketlemek için balık kalbi dıı içeren formaldehit bir fixatif çözeltisi serpmek gösterilmiştir. Medaka Asya 'ya özgü küçük bir tatlı su balığı, öncelikle Japonya 'da bulundu. Bu bir araştırma modeli organizma ve moleküler ve genetik Araçlar25kullanılabilir bir paketi ile. Bu nedenle, bu türün yanı sıra diğerlerinin yanı sıra kan damarlarının tanımlanması, beyin ve hipofiz hücrelerinin tüm dokuda veya kalın doku dilimlerinde kan damarıyla nasıl etkileşime girmesine ilişkin anlayışımızı iyileştirmeye izin verecektir.

<table><tbody><tr><td>% 16 paraformaldehit</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>RT 15711</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Şırınga PP / PE iğnesiz</td><td>Sigma</td><td>Z116866-100EA</td><td>şırıngalar</td></tr><tr><td>BD Precisionglide şırınga iğneleri</td><td>Sigma</td><td>Z118044-100EA</td><td>iğneleri 18G (1.20 * 40)</td></tr> <tr><td>Borosilikat cam 10 cm OD 1.2 mm</td><td>sutter aleti</td><td>BF120-94-10</td><td>cam pipet</td></tr><tr><td>DiI (1,1&asal;-Dioktadesil-3,3,3&asal;,3&prime;-tetrametilindokarbosiyanin perklorat)</td><td>İnvitrojen</td><td>D-282</td><td></td></tr><tr><td>LDPE tüp OD 1.7 mm ve ID 1.1 mm</td><td>Portex</td><td>800/110/340/100</td><td>kanül</td></tr><tr><td>Fosfat Tampon Salin (PBS) çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>D8537-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Pipet çektirme</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Plastik Petri kapları</td><td>VWR</td><td>391-0442</td><td></td></tr><tr><td>Süper yapıştırıcı jel</td><td>loctite</td><td>c4356</td><td></td></tr><tr><td>Trikain (ms-222)</td> <td>sigma</td><td>E10521-50G</td><td></td></tr></tbody></table>

teleost beyin ve hipofiz kan damarlarının bir dıı-fixative ile kardiyak perfüzyon kullanarak etiketleme

Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

Kan damarlarında omurgada tüm dokularda inler, gerekli besin sağlayarak onların hayatta kalma sağlayan, oksijen, ve hormonal sinyaller. Kalkınma sırasında işleyişi başlatmak için ilk organlardan biridir. Kan damar oluşumu mekanizmaları yüksek bilimsel ve klinik ilgi konusu haline gelmiştir. Ancak yetişkinlerde, diğer dokularda lokalizasyonu nedeniyle en canlı hayvanlarda damarlarını görselleştirmek zordur. Bununla birlikte, kan damarlarının görselleştirme Endokrinoloji ve Nörobiyoloji gibi çeşitli çalışmalar için önemli kalır. Çeşitli transjenik çizgiler zebrafish geliştirilmiştir iken, doğrudan floresan proteinleri ifadesi ile görüntülenen kan damarları ile, bu tür araçlar diğer teleost türleri için mevcut. Kullanarak Medaka (Oryzias latipes) bir model olarak, mevcut protokol, beyin ve hipofiz kan damarları etiket ile fiksatif ile kalp aracılığıyla durumu ile hızlı ve doğrudan bir teknik sunar dıı. Bu protokol, beyin ve hipofiz hücrelerinin tüm dokuda veya kalın doku dilimlerinde kan damarıyla nasıl etkileşime girmesine ilişkin anlayışımızın iyileştirilmesi sağlar.

Bu protokol, Medaka beyin ve hipofiz kan damarlarında etiket için adım prosedür bir adım gösterir, ve aynı zamanda doku düzeltmek. , Kalp içine dıı içeren bir fikreatif çözelti kalp enjeksiyonu ile etiketleme sonra, kan damarlarında bir floresan stereomikoskop (Şekil 4) veya tüm doku üzerinde bir Konfokal mikroskop kullanarak dilim görülebilir (Şekil 5). Kalın doku dilimi veya tüm doku üzerinde ya da, kan damar mimarisi üç boyutta görülebilir. Doku dilimleri, sa...

Bu makalede, bir teleost balık kan damarlarında etiketleme için hızlı bir protokol açıklar dıı kalp perfüzyon tarafından fiktatif olarak seyreltilebilir, Medaka kullanarak (Oryzias latipes) bir model olarak ve beyin ve hipofiz doku odaklanmak.

Teleost beyin ve hipofiz kan damarlarının bir dıı-fixative ile kardiyak perfüzyon kullanarak etiketleme

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one ...

Bu işlemin genel amacı beyin ve teleost balık hipofiz kan damarları etiket etmektir, ve biz model tür medaka DiI içeren bir fiksatif ile kardiyak perfüzyon kullanın. Yani basit ve verimli olan bu teknik, teleost balıklarının beyindeki damar anatomisi ve hipofiz ile nöronlar veya endokrin hücreler ve kan damarları arasındaki ilişki ile ilgili önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olacaktır. Bu tekniğin bazı avantajları hızlı ve kolay basit hazırlık ve teleost balık türlerine adaptasyon içerir.Bir balık tutucu hazırlamak için, beş santimetre uzunluğunda, üç santimetre genişliğinde ve iki santimetre kalınlığında polistiren bir parça kesti ve dokuz santimetre çapında plastik çanak polistiren yapıştırın. Sonra polistiren üç santimetrelik tekne şeklinde delik yapmak için bir neşter kullanın. Perfüzyon sistemini hazırlamak için perfüzyon sistemi iğnesinin ekstremitesine 30 ila 50 santimetre uzunluğunda plastik kanül ekleyin.Beş santimetrelik cam pipetler hazırlamak için, üreticinin talimatlarına göre tek tek cam kılcal damarlar germek için bir pipet çekmece kullanın. Diseksiyona başlamadan önce, hazırlanan DiI fiksatif solüsyonla 10 mililitrelik bir şırınga yükleyin ve şırınganın ekstremitesinden bir kanül ile bir iğne yerleştirin. Daha sonra, şırıngayı tezgaha sabitlemek için farklı yönlere yerleştirilen birkaç bant parçası kullanın ve diseksiyonu zonksiyon için iyi bir pozisyon elde etmek ve şırınga pistonunu dirsekile bastırmak için mikroskobun ve koltuğun konumunu ayarlayın.Daha sonra, balık tutucu karın tarafına ötenazi yapılan bir balık yerleştirin ve baş ve kuyruk pimleri ile güvenli. Ön karın açmak için yatay cildin yüzeysel tabakası kesmek için makas kullanın, ve ventrikül ve bulbus arteriosus net bir erişim elde edilene kadar kalbin üstündeki deri kaldırmak için forseps kullanın. Kılcal damar ekstremite bir cam boru ekleyin ve pipet ucu kırmak.Cam boruyu ventriküle yaklaştırın ve kalp ventrikülü pipetle sabitlerken sıvıyı dışarı çıkarmak için şırınga pistonuna dirsek basıncı ekleyin. Sonra hemen dolaşımdan kan serbest bırakmak için forseps ile sinüs venöz delik. Ventrikül itibaren, bulbus arteriosus girişini bulmak için cam pipet açısını ayarlayın, ve bulbus arteriosus içinde açılan pipet hareket ettirin.Sonra bulbus arteriosus içinde pipet tutarken ek bir 30 ila 60 saniye için şırınga basınç ekleyin. Tüm kan damarlarının optimal etiketleme için dii-fiksatif çözüm ile tüm kan yerine yeterince uzun bulbus arteriosus içine perfüzyon için önemlidir. Perfüzyon yaklaşık 60 saniye sonra, daha fazla kan sızıntısı gözlendiğinde, balık cam pipet ve iğneler çıkarın ve karanlıkta oda sıcaklığında iki saat boyunca taze% 4 paraformaldehit içine beyin ve hipofiz hasat.Daha sonra numuneleri görüntülemeye hazırlamadan önce, taze PBS'de iki kez yıkama başına 10 dakika durulayın. Gösterildiği gibi DiI içeren bir fiksatif çözeltinin kardiyak enjeksiyonundan sonra, etiketli kan damarları floresan stereo mikroskopi ile doku dilimlerinde veya konfokal mikroskopi ile tüm dokuda gözlemlenebilir. Çözelti bulbus arteriosus yerine kalp ventrikül enjekte edilirse veya çözelti çok düşük bir basınç ve / veya çok kısa bir süre için enjekte edilirse, damarların yetersiz etiketleme gözlenecektir.Buna ek olarak, aynı görüntüleme parametreleri ile aynı doku görüntülenirken, etiketleme yoğunluğunda bir azalma birkaç gün sonra gözlenebilir, sinyal doku örneği içinde daha yayılır görünen ile. İlgi hücrelerinin floresan muhabiri proteinleri ifade ettiği transgenik çizgilerden elde edilen doku dilimleri, kan damarları ve diğer hücre tipleri arasındaki etkileşimlerin araştırılmasına olanak sağlayan standart immünoresans protokolleri kullanılarak belirli ilgi proteinleri için daha fazla etiketlenebilir. Bu bulbus arteriosus ulaşmak için önemlidir.Bu elde edildiğinde, şırınga piston basınç ekleyerek başarılı bir prosedür onaylayan bulbus bir genişleme neden olmalıdır. Bu teknik genel olarak teleost hipofiz endokrin hücreleri ve kan damarları arasındaki etkileşimi araştırmak için kullanılabilir, ama belki daha özel teleost ve memeliler portal sistemleri arasındaki olası farklılıkları veya benzerlikleri araştırmak için. Çünkü bu politik kullanım da gaz maskesi ve havalandırmalı oda kullanımı gibi toksik ve uçucu bileşikler insaları bu işlemler icra edilirken her zaman alınmalıdır.

labeling-blood-vessels-teleost-brain-pituitary-using-cardiac

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz, kemirgenler ve insan olmayan primatlardan farklı yaşlarda beyin dilimleri nöron gibi DII floresan boyalar, tanıtmak için, gen tabancasının kullanımını göstermektedir. Bu özel durumda, yetişkin farelerin (3-6 ay) ve yetişkin cynomologus maymunlar (9-15 yaşında) kullanın. Dr Lichtman laboratuvar tarafından açıklanan bu teknik,...

Kemirgen Nöronlar ve Sigara insan Primate Beyin Slices DiOLISTIC Etiketleme

Bu makale, embriyonik deri ve timüs kan damarlarının etiketlenmesine yönelik bir yöntem açıklanmaktadır.

Embriyonik Farelerde damarları Etiketleme Bir Yöntem

Sıçan kalp ile beyin mümkün olan en iyi koruma elde etmek için: Burada damar sistemi ile perfüze% 4 paraformaldehit kullanarak düşük maliyetli, hızlı, kontrollü ve düzgün fiksasyon prosedürü açıklar.

Kemirgenler için Tüm Hayvan Perfüzyon Fiksasyon

Nöral devreler topografik spesifik moleküler profilleri ile fonksiyonel bölme halinde düzenlenmiştir. Burada, çok yönlü bir wholemount immünohistokimyasal yaklaşımını kullanarak global beyin topoğrafya ortaya çıkarılması için pratik ve teknik adımları sağlar. Bu iyi anlaşılmış cytoarchitecture ve beyincik devre kullanarak yöntemin yardımcı göstermektedir.

Revealing Kompleksi Beyin Topografya Wholemount İmmünohistokimya

Kemirgen serebrovasküler anatomi Analiz deneysel inme araştırmalarında önemli bir rol oynar. Bu çerçevede, renkli lateks ile intravasküler perfüzyon birkaç yıldır standart bir araç olarak kabul edilmiştir. Ancak, bu tekniğin tekrarlanabilirliği zayıflatmak farklı teknik sınırlamaları, ifade eder. Burada, tekrarlanabilir bir şekilde beyin damarlarının görselleştirmek için basit bir yöntem tarif. Yüksek kontrast görselleştirme ile beyin damarlarının yeterli dolgu sol ventrikül miyokard sonuçları...

Karbon Siyah Mürekkep İntravasküler Perfüzyon Serebral Gemiler Güvenilir Görselleştirme verir

Bir lipofilik 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetrametilindokarbosiyanin perklorat (DiI) boyama tekniği kullanarak, Ambystoma mexicanum vasküler yapının kolay görselleştirilmesini sağlamak için vasküler perfüzyona uğrayabilir.

Vasküler Görselleştirme İçin Bir Yöntem Olarak DiI Perfüzyonu<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Burada bir fare beyin damar geçirgenliği tahlil mayi enjeksiyon kan - beyin bariyerini disfonksiyon hayvan modelleri için geçerlidir perfüzyon ardından floresan tarayıcıları kullanarak mevcut. Bir hemi-beyin geçirgenliği kantitatif değerlendirilmesi ve diğer izleme görselleştirme/immunostaining için kullanılır. Yordamı 5-6 h 10 fareler için alır.

Vivo kan - beyin bariyerini geçirgenliği tahlil Fluorescently kullanarak farelerde izleyiciler etiketli

Bu protokol, perfüzyon, beyin kesiti, serbest yüzen immünostaining, doku montajı ve görüntüleme dahil olmak üzere fare beyni histolojik çalışmaları için verimli ve tekrarlanabilir bir yaklaşımı açıklar.

Fare Beyinlerinin Serbest Yüzen İmmünasyon

İndüklenebilir bir transgenik soy izleme fare çizgisi kullanarak kök hücreleri ve soylarını bir florofor ile kalıcı olarak işaretleme yeteneği, in vivo aktivasyon, proliferasyon, göç ve / veya farklılaşmanın mekansal ve zamansal analizine izin verir. Soy izleme, soy bağlılığı, müdahaleye yanıt ve çok potansiyelli hakkında yeni bilgiler ortaya çıkarabilir.

Yetişkin Fare Beynindeki İndüklenebilir Floresan Etiketli Kök Hücrelerin Soy İzi

Ön araştırma, subaraknoid kanamanın (SAK) beyin perisit ölümüne neden olduğunu doğrulamaktadır. SAK sonrası perisit kontraktilitesinin değerlendirilmesi, canlı ve canlı olmayan beyin perisitleri arasında ayrım yapılmasını gerektirir. Bu nedenle, canlı ve canlı olmayan beyin perisitlerini beyin bölümlerinde aynı anda etiketlemek için bir prosedür geliştirilmiştir ve yüksek çözünürlüklü bir konfokal mikroskop kullanarak gözlemi kolaylaştırmıştır.

Subaraknoid Kanama Sonrası Beyin Dilimlerinde Vital ve Non-vital Beyin Perisitlerinin Görüntülenmesi

Vasküler demans ve Alzheimer hastalığı modellemesi için kullanılabilecek serebrovasküler disfonksiyonu araştırmak için bir model olarak farelerde kimyasal olarak indüklenen büyük kan damarı dilatasyonunu gösteriyoruz. Ayrıca, silikon kauçuk bileşiği enjekte ederek ve kan damarı boyutundaki değişiklikleri ölçmek için net bir görsel rehberlik sağlayarak damar sistemini görselleştirmeyi de gösteriyoruz.

Büyük Damar Aracılı Serebrovasküler Disfonksiyonu Modellemek için Farelerde Dolichoectaziyi İndüklemek İçin Görsel Bir Yaklaşım

Öğrenin, teleost balıkların beyin ve hipofiz kan damarlarını DiI içeren fiksatifle kardiyak perfüzyon kullanarak etiketleme yöntemini. Bu hızlı ve uyarlanabilir teknik, Oryzias latipes modelinde vasküler anatomiyi incelemek için kullanılır.

Teleost beyin ve hipofiz kan damarlarının bir dıı-fixative ile kardiyak perfüzyon kullanarak etiketleme

Daha fazla video keşfet