Name: Dokosahexaenoic, eicosapentaenoic ve Arachidonik asitlerin Epoxilenmiş metabolitlerinin enzimatik sentezini (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Öğrenin DHA, EPA ve AA için enantiyomerik saf epoksi yağ asitlerinin enzimatik sentezi. Bu hızlı, uygun maliyetli yöntem, biyolojik mekanizmaları araştıran araştırmacılara ölçeklenebilir üretim sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, R00 ES024806 (Ulusal Sağlık Enstitüleri), DMS-1761320 (Ulusal Bilim Vakfı) ve Michigan State University 'den başlangıç fonları tarafından finanse edilmektedir. Yazarlar, enzimatik reaksiyon optimizasyonu ve Dr. Tony Schilmiller (MSU Kütle Spektrometrisi ve Metabolomics tesisi) ile ilgili yardım için Dr. Jun Yang 'a (Davis 'de California Üniversitesi) ve Lalitha Karchalla 'ya (Michigan Devlet Üniversitesi) teşekkür etmek istiyor HRMS veri edinme ile ilgili yardım için.

DIKKAT: listelenen kimyasalları kullanmadan önce lütfen tüm ilgili malzeme güvenlik veri sayfalarına (MSDS) danışın.
1. vahşi tip BM3 ifadesi
<ol><li>PBS-bm3 transfekte DH5α E. coli (Dr. F. Ann Walker 'dan cömert bir bağış) içinde 5 ml steril lb suyu ile 0,5 mg ampisilin 20 ml kültür tüpüne eklendi.</li>
	<li>200 rpm 'de 24 saat için 37 °C ' de bir shaker içinde hücre kültürünü inkük. Gece marş kültürü (5 mL) ekleyin ve 100 bir FERNBACH veya Erlenmeyer Flask steril LB suyu 1 L ampisilin mg. 37 °C ' de 200 rpm 'de 6 saat, sonra da 30 °C ' de, 200 rpm 'de 18 saat sallayın.</li>
	<li>1.000 x g'de 10 dakika boyunca 4 °c ' de hücre kültürünü toplayın ve santrifüjün. Süpernatant atın ve hücre Pelet at-78 °c enzim arıtma kadar saklayın. Not: süpernatant ya kimyasal olarak çamaşır suyu ile tedavi ile sterilize veya bir otoklav kullanarak sterilize ve sonra drenaj aşağı dökmüş olabilir.</li>
</ol>2. BM3 arıtma.
<ol><li>
Hücre liziz
	<ol>
<li>Ice-Cold (4 °c) çözünme tampon (10 mm Tris, 0,01 mm phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF;), 0,01 mm EDTA; pH 7,8) 40 ml içinde buz ve pelletini üzerinde hücre Pelet çözüyor. DIKKAT: PMSF temas ederek zehirlidir.</li>
		<li>Buzda ise, hücreleri 1 dakika boyunca ultrasonik Homogenizer (çıkış güç ayarı 10, Duty 100%) ile sonikat, sonra da hücreleri Lyse için buzda 1 dakika mola. Bu prosedürü 6 kez tekrarlayın. Hücre lysate 4 °c ' de 30 dakika 11.000 x g 'de Pelet hücre kalıntısıiçin Santrifüjü.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Benzeşim Kromatografi
	<ol>
<li>4 °C ' de yüksek tampon A (10 mM Tris, pH 7,8) 5 sütun hacmi (CV) ile yıkayarak güçlü bir aniyon değişimi Kromatografi sütunu (bkz. malzeme tablosu; çap: 2,8 cm x 6 cm, sütun hacmi: 37 ml) hazırlayın.</li>
		<li>Hücre endoglikozidazları dengelenmiş sütuna ekleyin ve soğuk tampon 3 CV ile sütun yıkayın A. soğuk tampon B (10 mm Tris, 600 mm NaCl, 6 CV) ile sütunu yıkayarak bm3 elute.</li>
		<li>Kırmızımsı-kahverengi akıtıcı fraksiyonu toplayın. Protein hemen kullanılırsa, sıvı nitrojen ile gliserol ve flaş dondurulması eşit hacimli ile karıştırın. Dondurulmuş solüsyonu-78 °C ' de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. BM3 tarafından DHA epoxidation
<ol><li>0,308 g (0,940 mmol) DHA ' nın 18,8 mL 'de dimethylsulfoxıde (DMSO) ile 2 L 'ye tepki tamponunu (0,12 M potasyum fosfat, 5 mM MgCl2, pH 7,4) ile birlikte, çözülmüş bm3 enziminin 20 Nm 'sini ekleyerek reaksiyonu hazırlayın. Enzim konsantrasyonu karbon monoksit/dithionite spektral assay yöntemi19tarafından belirlenebilir.</li>
	<li>Çözelti karıştırırken, tepki arabelleğinde çözülmüş NADPH 1 eşdeğeri (Nikotinamid adenin dinükleotid fosfat azaltılmış, tetrasodyum tuz, 0,808 g, 0,940 mmol) ekleyerek reaksiyona başlayın. Bir şırınga ve iğne bağlı bir hava dolu balon ile reaksiyon karışımı aracılığıyla hava kabarcıklanma iken 30 dakika için reaksiyon karıştırın.</li>
	<li>Bir spektrofotometre kullanarak ( malzeme tablosunabakın), NADPH tükenirse belirlemek için 340 Nm de reaksiyon karışımı emici kontrol edin. NADPH tüketimini gösteren kalan emici yoksa, reaksiyon tamamlanır. Not: genellikle, reaksiyon 30 dakika sonra tamamlanır.</li>
	<li>Çözüm pH 'Sı 4 ' e ulaşıncaya kadar, 1 M oksulik asit, dropwise ile yavaşça reaksiyon karışımından giderin.</li>
</ol>4. EDPs ekstraksiyonu
<ol><li>3 kez dietil eter (susuz, peroksit içermeyen) 2 L ile sönüklenmiş tampon çözeltisi ayıklayın. Eter tabakasını (6 L) toplayın ve susuz magnezyum sülfat (MgSO4) ile kuru.</li>
	<li>MgSO4 ' ü çözümden filtreleyin ve ham EDP kalıntılarını vermek için bir döner buharlaştırıcı üzerinde kurutulmuş eter katmanını konsantre olun.</li>
	<li>Kalıntıyı flaş sütun Kromatografi ile arındırın (40 g silika kartuşu yeterlidir). Hekzanlar içinde% 10 etil asetat (EtOAc) başlayın ve 22 dk üzerinde hekzanlar% 60 EtOAc kadar rampa. Not: üç büyük zirveler elde edilir ve toplanan, 1 sırasına göre el. tepki vermez DHA; 2. EDP isomers karışımı; ve 3. di-Epoxide (normal aşırı oksidasyon ürünleri (bkz. Şekil 1)).</li>
	<li>Kesirleri birleştirin ve döner buharlaştırıcı üzerine konsantre olun. Bu örnekteki 0,074 g, (% 24) tepki vermez DHA, 0,151 g (47%) EDP ısomers ve 0,076 g, (% 22) di-Epoxide elde edildi.</li>
</ol>5. EDPS esterleşme, 16 (s), 17 (r)-ve 19 (s), 20 (r)-EDP, ve esterlerin sabunlaşma ayrılması
DIKKAT: Trimethylsilyldiazomethane (TMS-diazomethane) hem temas hem de inhalasyon ile çok zehirlidir. Uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla sadece bir duman kaputu içinde kullanın.
<ol><li>Epoksitler seyreltmeli (0,151 g, 0,435 mmol) argon altında 2 ml susuz metanol (MeOH) ve 3 ml susuz Toluen ile yuvarlak dipli bir Flask veya küçük şişede, bir karıştırın-Bar ekleyin ve TMS-diazomethane (1,2 molar eşdeğerleri veya 0,26 ml, hexanes içinde 2 M çözeltisi) ekleyin.</li>
	<li>10 dakika bekleyin ve soluk sarı renk kalana kadar ek TMS-diazomethane (0,050 mL) ekleyin.</li>
	<li>30 dakika sonra, dikkatle döner buharlaştırıcı kullanarak karışımı konsantre ve flaş sütun Kromatografi ile kalıntı arındırmak. Elute ile 4% EtOAc hekzanlar (kullanarak bir 40 g silika jel sütun veya kartuş) için 22 dakika. Bu örnekte, 19, 20-EDP metil ester (0,116 g, 74%) ve 16, 17-EDP metil ester (0,029 g,% 19), net yağlar (toplam verim, 93%) olarak elde edildi.</li>
	<li>Saflaştırılmış EDP metil ester regioisomers içeren kesirler toplayın. 19 (lar), 20 (r)-EDP ilk metil ester elutes, ardından 16 (s), 17 (r)-EDP metil ester.</li>
	<li>Herhangi bir karışık fraksiyonları kalırsa (her iki izomerleri içeren; ince katmanlı Kromatografi (TLC) 8:1 hexane/EtOAc tarafından değerlendirilebilir ve potasyum permanganat (KMnO4) ile lekelenmiş), daha önce olduğu gibi aynı solvent sistemi ile yeniden Kromatograf.</li>
	<li>Bireysel regioisomers içeren kesirler konsantre. Not: Bu noktada, kimlik ve saflık NMR (solvent olarak CDCl3 kullanarak; Şekil 2için göstergeye bakın) tarafından değerlendirilebilir.</li>
	<li>Bireysel EDP metil ester regioisomers kendi asit formları dönüştürmek için, THF içinde EDP Ester seyreltilebilir: su (yaklaşık 0,7 mL/0.1 mmol ester). 2 M sulu LiOH (3 molar eşdeğerleri) ekleyin ve gece karıştırın. Not: reaksiyon bütünlüğü TLC tarafından, 3:1 hexanes/EtOAc, KMnO4ile boyama kullanılarak değerlendirilebilir; ürün bir bekletme faktörü ~ 0,3 vardır.</li>
	<li>Karışım pH 3-4 ulaştığında kadar, formik asit ile yavaşça reaksiyon Quench. Su ve etil asetat ekleyin (1-2 mL/0.100 mmol ester) ve katmanları ayırın. EtOAc (3 x 5 mL) ile su katmanını ayıklayın, doymuş salamura (NaCl) çözeltisi ile yıkayın ve EtOAc tabakasını susuz sodyum sülfat üzerine kurutun (na2so4).</li>
	<li>Bir döner evaporatör kullanarak etil asetat çözeltisi konsantre, hekzanlar ekleyin (10 ml) ve tekrar konsantre. İki kez azeotropically kalan formik asit kaldırmak için tekrarlayın. Kalıntıyı flaş sütun Kromatografi ile temizler, 15 dakika üzerinde 10-30% EtOAc ile salınımlı.</li>
	<li>Konsantre istenilen kesirler ve kuru vakum içinde arıtılmış asit göze. Not: Bu aşamada, enantiomerik saflık (kiral HPLC tarafından, sütun ve koşullar için Şekil 3 - Şekil 4 için efsanelere bakın) değerlendirilebilir. Kimyasal saflık C18 (achiral) HPLC (bkz. malzeme tablosu ve referans 14) ile değerlendirilebilir.</li>
</ol>

<ol><li>Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+epoxyeicosatrienoic+acids+as+endothelium-derived+hyperpolarizing+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors.</a> Circulation Research. 78, 415-423 (1996).</li>
<li>Ulu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+omega-3+epoxide+of+docosahexaenoic+acid+lowers+blood+pressure+in+angiotensin-II-dependent+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">An omega-3 epoxide of docosahexaenoic acid lowers blood pressure in angiotensin-II-dependent hypertension.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64, 87-99 (2014).</li>
<li>Ye, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+p-450+epoxygenase+metabolites+of+docosahexaenoate+potently+dilate+coronary+arterioles+by+activating+large-conductance+calcium-activated+potassium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Cytochrome p-450 epoxygenase metabolites of docosahexaenoate potently dilate coronary arterioles by activating large-conductance calcium-activated potassium channels.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 303, 768-776 (2002).</li>
<li>Imig, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epoxyeicosatrienoic+acids%2C+hypertension%2C+and+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Epoxyeicosatrienoic acids, hypertension, and kidney injury.</a> Hypertension. 65, 476-682 (2015).</li>
<li>Capozzi, M. E., Hammer, S. S., McCollum, G. W., Penn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epoxygenated+fatty+acids+inhibit+retinal+vascular+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Epoxygenated fatty acids inhibit retinal vascular inflammation.</a> Scientific Reports. 6, 39211(2016).</li>
<li>Zou, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereospecific+effects+of+epoxyeicosatrienoic+acids+on+renal+vascular+tone+and+K%28%2B%29-channel+activity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Stereospecific effects of epoxyeicosatrienoic acids on renal vascular tone and K(+)-channel activity.</a> American Journal of Physiology. 270, F822-F832 (1996).</li>
<li>Lauterbach, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450-dependent+eicosapentaenoic+acid+metabolites+are+novel+BK+channel+activators%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450-dependent eicosapentaenoic acid metabolites are novel BK channel activators.</a> Hypertension. 39, 609-613 (2002).</li>
<li>Clarke, T. C., Black, T. I., Stussman, B. J., Barnes, P. M., Nahin, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClarke%2C+TC+%22Trends+in+the+use+of+complementary+health+approaches+among+adults%3A+United+States%2C+2002%E2%80%932012%22">Trends in the use of complementary health approaches among adults: United States, 2002–2012</a>. , National Center for Health Statistics. Hyattsville, MD. (2015).</li>
<li>Mozaffarian, D., Wu, J. H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omega-3+fatty+acids+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Omega-3 fatty acids and cardiovascular disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 58, 2047-2067 (2011).</li>
<li>Shearer, G., Harris, W., Pederson, T., Newman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+omega-3+oxylipins+in+human+plasma+in+response+to+treatment+with+omega-3+acid+ethyl+esters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Detection of omega-3 oxylipins in human plasma in response to treatment with omega-3 acid ethyl esters.</a> Journal of Lipid Research. 51, 2074-2081 (2010).</li>
<li>Ostermann, A. I., Schebb, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+omega-3+fatty+acid+supplementation+on+the+pattern+of+oxylipins%3A+a+short+review+about+the+modulation+of+hydroxy-%2C+dihydroxy-%2C+and+epoxy-fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Food+%26+Function%22%5BJournal%5D)">Effects of omega-3 fatty acid supplementation on the pattern of oxylipins: a short review about the modulation of hydroxy-, dihydroxy-, and epoxy-fatty acids.</a> Food & Function. 8, 2355-2367 (2017).</li>
<li>Khan, M. A., Wood, P. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKhan%2C+MA+%22Method+for+the+synthesis+of+DHA%22">Method for the synthesis of DHA</a>. , WO2012126088A1 (2012).</li>
<li>Nanba, Y., Shinohara, R., Morita, M., Kobayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereoselective+synthesis+of+17%2C18-epoxy+derivative+of+EPA+and+stereoisomers+of+isoleukotoxin+diol+by+ring-opening+of+TMS-substituted+epoxide+with+dimsyl+sodium%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+and+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Stereoselective synthesis of 17,18-epoxy derivative of EPA and stereoisomers of isoleukotoxin diol by ring-opening of TMS-substituted epoxide with dimsyl sodium.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 8614-8626 (2017).</li>
<li>Cinelli, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+synthesis+and+chemical+inversion+provide+both+enantiomers+of+bioactive+epoxydocosapentaenoic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Enzymatic synthesis and chemical inversion provide both enantiomers of bioactive epoxydocosapentaenoic acids.</a> Journal of Lipid Research. 59, 2237-2252 (2018).</li>
<li>Falck, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical%2C+enantiospecific+syntheses+of+14%2C15-EET+and+leukotoxin+B+%28vernolic+acid%29%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron+Letters%22%5BJournal%5D)">Practical, enantiospecific syntheses of 14,15-EET and leukotoxin B (vernolic acid).</a> Tetrahedron Letters. 41, 4131-4133 (2001).</li>
<li>Celik, A., Sperandio, D., Speight, R. E., Turner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enantioselective+epoxidation+of+linolenic+acid+catalyzed+by+cytochrome+P450BM3+from+Bacillus+megaterium%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+and+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Enantioselective epoxidation of linolenic acid catalyzed by cytochrome P450BM3 from Bacillus megaterium.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 3, 1688-2690 (2005).</li>
<li>Capdevila, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+highly+stereoselective+oxidation+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+cytochrome+P450BM-3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The highly stereoselective oxidation of polyunsaturated fatty acids by cytochrome P450BM-3.</a> Journal of Biological Chemistry. 271, 22663-22671 (1996).</li>
<li>Lucas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereoselective+epoxidation+of+the+last+double+bond+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+human+cytochromes+P450%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Stereoselective epoxidation of the last double bond of polyunsaturated fatty acids by human cytochromes P450.</a> Journal of Lipid Research. 51, 1125-1133 (2010).</li>
<li>Guengerich, F. P., Martin, M. V., Sohl, C. D., Cheng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cytochrome+P450+and+NADPH-cytochrome+P450+reductase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measurement of cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase.</a> Nature Protocols. 4, 1245-1251 (2009).</li>
<li>Cayman Chemical, 19,20-EpDPA. , 
 <a target="_blank" href="https://www.caymanchem.com/product/10175">https://www.caymanchem.com/product/10175</a> (2019).</li>
<li>Graham-Lorence, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+active+site+substitution%2C+F87V%2C+converts+cytochrome+P450+BM-3+into+a+regio-+and+stereoselective+%2814S%2C+15R%29-arachidonic+acid+epoxygenase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An active site substitution, F87V, converts cytochrome P450 BM-3 into a regio- and stereoselective (14S, 15R)-arachidonic acid epoxygenase.</a> Journal of Biological Chemistry. 272, 1127-1135 (1996).</li>
</ol>

Yazarlar, ifşa etmek için ilgi çatışması yok.

Burada DHA-19, 20 ve 16, 17-EDP iki en bol epoksi metabolitleri hazırlamak için operasyonel olarak basit ve maliyet-etkili bir yöntem sunuyoruz. Bu epoksi yağ asitleri, vahşi tip bm3 enzim kullanarak yüksek enantiomer ( S, R-isomers gibi) şeklinde hazırlanabilir. Sorun giderme için kullanılan çeşitli kritik noktaları ve AA ve EPA enantiomer epoksi metabolitleri hazırlamak için bizim yöntemin uzantısı, aşağıda açıklanmıştır.
BM3 depolama yönergeleri
<p class="jove_...

İnsan biyolojisinde çok doymamış yağ asitleri (özellikle Omega-3 ve Omega-6 çoklu doymamış yağ asitleri) oynamak rol ilgi son yıllarda büyüdü, araştırmacılar çekici faydaları geniş haber aldı ki onların metabolitleri Sergi. Özellikle, sitokrom P450 enzimlerin sınıfı tarafından üretilen epoksi yağ asidi metabolitleri odak büyük bir noktası olmuştur. Örneğin, birçok PUFA epoxides, epoxyeicosatrienoic asitler (Eets) dahil olmak üzere, epoxydocosapentaenoic asitler (EDPS) ve epoxyeicosatetraenoic asitler (eeqs), kan basıncı ve inflamasyon düzenlenmesi kritik bir rol oynar1,2 , 3 ' ü , 4 , 5. ilginçtir, AA ve EPA epoksitler spesifik enantiomerler ve regioisomers vazokonstriksiyon üzerinde değişen etkileri olduğu bilinmektedir6,7. Enantiomerler ve EETs ve EEQs regioisomers fizyolojik etkileri belgelenmiş iken, az benzer epoxydocosapentaenoic asitler (EDPs) etki DHA oluşan etkisi hakkında bilinmektedir. Balık yağı yaygın kullanımı8, EPA ve DHA hem de zengin olan, ayrıca EDPS ilgi karıştırmıştır9. Bu takviyeleri faydaları kısmen aşağı DHA metabolitleri nedeniyle olduğuna inanılmaktadır (16, 17-EDP ve 19, 20-EDP en bol olmak) çünkü EDPs in vivo seviyeleri diyet DHA miktarı ile çok iyi koordine10, 11' den itibaren.
Bu epoksi yağ asitlerinin metabolomics, kimyasal biyoloji ve diğer yöntemlerin mekanizmalarını ve hedeflerini incelemek, kısmen, çünkü Regio-ve stereo-izomerlerin karışımları olarak var oldukları ve saf miktarlarda elde etmenin bir yöntemi olan zorlu kanıtlanmıştır enantiomerler ve regioisomers gereklidir. Bu bileşikler kimyasal sentezleme için konvansiyonel araçlar etkisiz olduğunu kanıtladı. Epasetatasyon için meta-chloroperoxybenzoic asit gibi perokasitlerin kullanımı birçok dezavantajları vardır, özellikle de bireysel regioisomers ve enantiomers pahalı ve titizlikle arıtılması gerektiren epidrasyon seçicilik, eksikliği. DHA ve EPA metabolitleri toplam sentezi mümkündür, ama aynı zamanda yüksek maliyetler ve düşük verim gibi büyük ölçekli sentez için pratik yapmak dezavantajları muzdarip12,13. Enzim reaksiyonu Regio-ve stereoseçici14olduğu için, enzimatik sentezle verimli genel üretim elde edilebilir. Çalışmalar, AA ve EPA enzimatik epizemasyon (bm3 ile) hem regioseçici ve enantioseçici15,16,17,18, ama bu prosedür DHA ile test edilmedi, ya da büyük bir gösterir Ölçek. Yöntemimizin genel hedefi, bireysel enantiomerler olarak hızla önemli miktarlarda saf epoksi yağ asitleri üretmek için bu kemoenzimatik epizatasyonu ölçeklendirmek ve optimize etmek oldu. Burada sunulan yöntemi kullanarak, araştırmacılar EDPs ve diğer PUFA epoksi metabolitleri sentezi için basit ve uygun maliyetli bir stratejiye erişebilir.

<table><tbody><tr><td>Amonyum Bikarbonat</td><td>Sigma</td><td>9830</td><td>NA</td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>GoldBio</td><td>A30125</td><td>NA</td></tr><tr><td>Susuz magnezyum sülfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-3</td><td>NA</td></tr><tr><td>Susuz metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322515</td><td>NA</td></tr><tr><td>Susuz sodyum sülfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S421-500</td><td>NA</td></tr><tr><td>Susuz toluen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511</td><td>NA</td></tr><tr><td>Araşidonik Asit (AA)</td> <td>Nu-Chek Prep</td><td>U-71A</td><td>Havaya duyarlı.</td></tr><tr><td>Dietil Eter</td><td>Sigma</td><td>296082</td><td>NA</td></tr><tr><td>DMSO (moleküler biyoloji sınıfı)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>NA</td></tr><tr><td>Dokosaheksaenoik Asit (DHA)</td> <td>Nu-Chek Hazırlık</td><td>U-84A</td><td>Havaya duyarlı.</td></tr><tr><td>EDTA (etilendiamintetraasetik asit)</td><td>İnvitrojen</td><td>15576028</td><td>NA</td></tr><tr><td>Eikosapentaenoik Asit (EPA)</td><td>Nu-Chek Hazırlığı</td><td>&nbsp; U-99A</td><td>Havaya duyarlı.</td></tr><tr><td>Etil asetat</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>34858</td><td>NA</td></tr><tr><td>Flash sütun kartuşları 25, 40, 4, 12 g boyutları</td><td>Fisher Scientific</td><td>145170203, 145154064, 5170200</td><td>Alternatif olarak, geleneksel kolon kromatografisi kullanılabilir</td></tr><tr><td>Formik asit (HPLC Sınıfı)</td><td>JT Baker</td><td>0128-01</td><td>NA</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma</td><td>G7757</td><td>NA</td></tr><tr><td>Hekzanlar</td><td>VWR</td><td>BDH24575</td><td>NA</td></tr><tr><td>LB Suyu</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>NA</td></tr><tr><td>Lityum hidroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>442410</td><td>NA</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>2444-01</td><td>NA</td></tr><tr><td>Metanol (HPLC sınıfı)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-41-R</td><td>NA</td></tr><tr><td>NADPH Tetrasodyum Tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>481973</td><td>Havaya duyarlı.</td></tr><tr><td>Oksalik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>194131</td><td>NA</td></tr><tr><td>pBS-BM3 transfekte DH5 ve alfa; E. coli</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>NA PMSF (fenilmetansülfonil florür)</td> <td>Sigma</td><td>P7626</td><td>Toksik!</td></tr><tr><td>TLC boyama için</td> <td>Potasyum Permanganat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223468</td>.</tr><tr><td>Potasyum fosfat dibazik</td><td>Sigma</td><td>795496</td><td>NA</td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik</td><td>Sigma</td><td>795488</td><td>NA</td></tr><tr><td>Q Sefaroz Hızlı Akış reçinesi (GE Healthcare yaşam bilimleri)</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-0515-01</td><td>Sodyum Klorür enziminin anyon değişimi saflaştırılması için</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>71376</td><td>NA</td></tr><tr><td>Tetrahidrofuran, susuz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>186562</td><td>NA</td></tr><tr><td>TMS-Diazometan (hekzanlarda 2.0 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>362832</td><td>Çok toksiktir.</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>GoldBio</td><td>T-400</td><td>NA</td></tr><tr><td><güçlü>Ayrıca gerekli: < / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Otomatik flaş arıtma sistemi (bir Buchi Reveleris X2 kullandık);</td><td>Buchi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18 HPLC kolonu (Zorbax Eclipse XDB-C18)</td><td></td>10.000 x g kapasiteli Agilent <td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td> Kiral HPLC Kolonu (Lux selüloz-3), 250 x 4.6 mm, 5 &<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> M, 1000 &aring;)</td><td>Phenomenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Genel kimya malzemeleri: 2 L'lik bir ayırma hunisi, 1000-2000 L kapasiteli beherler ve Erlenmeyer şişeleri, 20 mL'lik şişeler, HPLC şişeleri, küçük yuvarlak tabanlı şişeler ve karıştırma çubukları.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC (Shimadzu Prominence LC-20AT analitik pompa ve SPD-20A UV-vis dedektörü</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 Spektrofotometre kullanıyoruz ve nbsp;</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NMR</td><td>NMR: Agilent DD2 spektrometresi (500 MHz)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Döner buharlaştırıcı</td><td>Buchi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonic dismembrator veya ultrasonik homojenizatör</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dokosahexaenoic, eicosapentaenoic ve arachidonik asitlerin epoxilenmiş metabolitlerinin enzimatik sentezini

Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids

Çeşitli çoklu doymamış yağ asitleri (PUFAs), epoksi yağ asitleri olarak adlandırılan, epifon metabolitleri, insan fizyolojisinde rolleri geniş bir yelpazede vardır. Bu metabolitler enzimlerin sitokrom P450 sınıfı ile Endogenously üretilmektedir. Onların farklı ve güçlü biyolojik etkileri nedeniyle, bu metabolitleri okumaya önemli ilgi vardır. Epoksi yağ asitleri ilk olarak önemli miktarlarda elde edilmelidir ve yüksek saflık ile vücutta bu metabolitlerin benzersiz rolleri belirlenmesi, zor bir iştir. Doğal kaynaklardan bileşikler elde genellikle emek yoğun, ve çözünür epokid Hidrolazlar (sEH) hızla metabolitleri hidrolize. Öte yandan, bu metabolitleri kimyasal reaksiyonlar yoluyla elde etmek, saf regioisomers ve enantiomers, düşük verim ve geniş (ve pahalı) arıtma alma zorluk nedeniyle çok verimsizdir. Burada, bir verimli enzimatik sentezi mevcut 19 (s), 20 (r)-ve 16 (s), 17 (r)-epoxydocosapentaenoic asitler (EDPS) DHA ile epizidasyon yoluyla bm3, bir bakteriyel CYP450 enzim orijinal Bacillus gelen izole megateryum (Bu kolayca Escherichia coliifade edilir). Karakteristik ve saflık belirlenmesi nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMR), yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) ve kütle spektrometresi (MS) ile gerçekleştirilir. Bu prosedür, PUFA epoksi metabolitlerinin enzimatik sentezi yararları gösterir ve diğer yağ asitleri, arachidonik asit (AA) ve eicosapentaenoik asit (EPA) dahil olmak üzere, epoksitizi için uygulanabilir asitler (EETs) ve epoxyeicosatetraenoic asitler (EEQs), sırasıyla.

Flaşlı kolon kromatogram (aşağıda açıklandığı gibi otomatik bir flaş arıtma sistemi kullanılarak gerçekleştirilir) enzimatik epoksifiden ham karışımın arıtılması üzerine elde edilen Şekil 1' de gösterilir. Esterleşme ve regioisomerlerin ayrılması sonrasında, Pure 16 (s), 17 (r)-EDP ve 19 (s), 20 (r)-EDP metil esterleri elde edildi. Genellikle, bunlar yaklaşık 1:4 için 1:5 oranı, 19 (S), 20 (R)-EDP olan ana...

Biz bir yöntem büyük ölçekli enzimatik sentez ve spesifik enantiomerler ve arachidonik asit (AA), dokosahexaenoik asit (DHA) ve eicosapentaenoik asit (EPA) epoksitler regioisomers arıtma için yararlı bir bakteriyel sitokrom kullanımı ile P450 enzim (BM3).

Dokosahexaenoic, eicosapentaenoic ve Arachidonik asitlerin Epoxilenmiş metabolitlerinin enzimatik sentezini

The epoxidized metabolites of various polyunsaturated fatty acids (PUFAs), termed epoxy fatty acids, have a wide range of roles in human physiology. These ...

Yani protokolümüz enantiopure epoksi yağ asitleri hazırlamamıza izin verir ve bu yöntem bu metabolitlerin vücutta ki mekanizmaları üzerinde araştırma nın ilerlemesine yardımcı olabilir. Tarihsel olarak, saf epoksi yağ asitleri elde etmek çok zordur. Yani protokolümüz basit, hızlı, uygun maliyetli ve bu metabolitlerin önemli miktarda hazırlanmasını sağlıyor.Evet, DHA için bir protokol geliştirdik, ama aynı zamanda EPA ve araşidonik asit için de çok iyi çalışıyor. Bazı reaktifler, özellikle DHA ve NADPH gibi hava duyarlı olduğundan, hızlı çalışın ve kurulum basit böylece önceden her şeyi eşleştirmek için emin olun. Ayrıca, tehlikelere dikkat edin.Protokolümüz hem enzimoloji hem de organik kimya tekniklerini kullansın. Görselleştirme, bu alanlardaki özel tekniklere aşina olmayan okuyuculara ve görüntüleyenlere yardımcı olmak için çok önemlidir. Aşılamak için, steril bir döngü veya pipet pBS-BM3 transfected DH5-alfa E.coli gliserol stok batırılmış kullanın steril LB suyu beş mililitre içine 0.5 ampisilin miligram ile takviye.Hücre kültürünü 37 derecede 200 rpm'de 24 saat boyunca bir çalkalayıcıyla kuluçkaya yatırın. Sonra, bir Erlenmeyer şişesinde steril LB suyu bir litre beş mililitre başlangıç kültürü ve ampisilin 100 miligram ekleyin. 200 rpm altı saat boyunca 37 derece santigrat çalkalayın, sonra 200 rpm 18 saat için 30 derece santigrat.Bundan sonra, santrifüj tüpler ilerler ve 1,000 kez g 10 dakika boyunca dört santigrat derece hücre kültürünü santrifüj. Supernatant'ı başka bir şişeye dökün. Çamaşır suyu ile dekontamine veya otoklav kullanarak, ve enzim saflaştırma kadar eksi 78 santigrat derece hücre pelet saklayın.Hücre lisisini gerçekleştirmek için, önce hücre peletini buz üzerinde eritin ve Tris, PMSF ve EDTA içeren 40 mililitre buz gibi solubilizasyon tamponu yla yeniden askıya alın. Buz üzerinde yken, ultrasonik homogenizer ile bir dakika boyunca hücreleri sonicate, bir çıkış gücü ayarı ile 10 ve görev 100, hücreleri lyse için buz üzerinde bir dakikalık mola takip. Bu yordamı altı kez tekrarlayın.Hücre enkazını peletlemek için hücreyi 11,000 kez g'de 30 dakika boyunca 4 derecede nisbeten santrifüj edin. Afiyet kromatografisi gerçekleştirmek için, bir sürgülü kapı ile soğuk bir odada veya buzdolabında, dört derece santigrat, ilk pH 7.8 tampon A beş sütun hacimleri ile reçine yıkayarak güçlü bir aniyon değişimi kromatografi sütun hazırlamak. Daha sonra, hücre lysatt dengeli sütuna ekleyin ve soğuk tampon A.Then üç sütun hacimleri ile sütun yıkayın, 10-milimolar Tris ve 600 milimolar sodyum klorür soğuk tampon B altı sütun hacimleri ile sütun yıkayarak BM3 eute.Kırmızımsı-kahverengi eluent fraksiyonu toplamak. Protein hemen kullanılıyorsa, eşit hacimli gliserol ile karıştırırımlayın ve sıvı nitrojenle flash- dondurun. Dondurulmuş çözeltiyi eksi 78 derecede saklayın.DHA epoksidasyon gerçekleştirmek için, ilk çözülmüş BM3 enziminin konsantrasyonunu belirlemek, karbon monoksit dithionite spektral tsay yöntemine göre. Daha sonra, manyetik bir karıştırma plakası üzerinde karıştırılan iki litre reaksiyon tamponu içeren bir kabın içinde, DMSO 18,8 mililitre seyreltilmiş DHA 0.94 milimol ekleyin ve BM3 enzimi 20 nanomolar seyreltilmiş. Çözelti kıpırdanırken, NADPH 0.94 milimol içeren reaksiyon tampon 8.7 mililitre ekleyerek epoksidasyon reaksiyonu başlar.Kabın içine bantlanmış bir şırınga ve iğneye bağlı hava dolu bir balonla reaksiyon karışımına hava köpürterken reaksiyonu 30 dakika karıştırın. Bundan sonra, reaksiyon karışımının bir mikrolitresini çizin ve 340 nanometrede emiciliği ölçmek için nanodrop spektrofotometreye koyun. Suyu boş olarak kullanın.NADPH'nin tüketildiğini gösteren kalan bir emicilik yoksa, reaksiyon tamamlanır. Çözeltinin pH'ı yaklaşık dörde ulaşana kadar, tek molar oksalik asit damlacıklarını yavaş yavaş ekleyerek reaksiyon karışımını söndürün. Şimdi, iki litre susuz, peroksitiçermeyen dietil eter ile söndürülen tampon çözeltisini ayıklayın.Katmanları sallamak ve ayırmak için ayırıcı bir huni kullanın ve eterbir Erlenmeyer şişesiiçine toplamak. İki kez daha tekrarlayın ve eter kurutmak için yaklaşık 50 gram susuz magnezyum sülfat ekleyin. Vakum filtresi hunisi üzerine, magnezyum sülfat filtrelemek için kurutulmuş eter dökün ve filtrelenmiş eter tabakasını döner evaporatörden yuvarlak bir alt şişeye aktarın.Dönüş hızını orta hıza ayarlayın ve ham EDP kalıntısı elde etmek için sıvıyı yoğunlaşmış olmak için vakumu başlatın. Otomatik flaş arıtma makinesi kullanarak flaş sütun kromatografisi gerçekleştirmek için kalıntıyı 40 gramlık bir silika kartuşu içine yükleyin. Heksanlarda %10 etil asetatla başlayın ve 22 dakika boyunca heksanlarda %60'a kadar etil asetat yapın.Kesirler otomatik olarak tüpler de toplanır. Daha sonra, bir yuvarlak alt şişe içine her tepeden kesirleri birleştirmek, döner buharlaştırıcı koymak ve buharlaşma başlar. Üç fraksiyonları elde edilir, DHA, EDP izomerleri, ve diepoxide.Epoksit elde 0.151 gram esterify için, yuvarlak bir alt şişe veya küçük şişe, iki mililitre susuz metanol ve susuz toluen üç mililitre ekleyin ve bir karıştırma çubuğu ekleyin. Bir kauçuk septum ve bir iğne ile argon dolu bir balon ile şişe bağlayın ve karıştırırken bir şırınga ile iki molar TMS-diazomethane 0.26 mililitre ekleyin. 10 dakika bekleyin ve soluk sarı bir renk görünene kadar 05 mililitre TMS-diazometan ekleyin.30 dakika sonra, karışımı döner evaporatör kullanarak dikkatlice konsantre edin ve kalıntıyı arındırmak için flaş kromatografi makinesinde 40 gramlık silika jel kolon kartuşu kullanın. 22 dakika boyunca heksanlarda %4 etil asetat izokratik konsantrasyonu ile elute. Saflaştırılmış 19S içeren kesirleri toplamak, 20R-EDP metil ester ilk eluates, 16S, 17R-EDP metil ester takip.Şimdi, kesirleri sekize bir heksandan etil-asetat karışımında ince tabaka kromatografi ile değerlendirin. Her iki izomeri içeren karışık fraksiyonları kontrol etmek için potasyum permanganat ile leke. Bir döner evaporatör üzerinde her tepeye karşılık gelen kesirler konsantre ve daha sonra elde edp esterleri miktarını belirlemek için bir denge tartmak.Karışık kesirler kalırsa, bunları daha önce kullanılan çözücü sistemle yeniden kromatograf. Bir döner evaporatör üzerinde bireysel regioisomer içeren her fraksiyonu konsantre. Tek tek EDP metil ester regioisomerleri asit formlarına dönüştürmek için, EDP esterini küçük bir şişede 0,1 milimol başına yaklaşık 0,7 mililitre THF ile seyreltin ve 0,175 mililitre su.Bir buz banyosunda şişeyi sıfır dereceye kadar soğutun, lityum hidroksit çözeltisinin üç eşdeğerini ekleyin ve oda sıcaklığına ısınırken bir gecede argon altında bir karıştırma plakası üzerinde karıştırın. Sabah, karışımın pH üç ila dört ulaşana kadar, yavaş yavaş formik asit ekleyerek reaksiyon söndürmek. Sonra, su ve katmanları ayırmak için etil asetat iki mililitre ekleyin.10 mililitre etil asetat ile su tabakasını üç kez ayıklayın, 20 mililitre doymuş salamura çözeltisi ile yıkayın ve etil asetat tabakasını kurutmak için çözeltiye birkaç gram susuz sodyum sülfat ekleyin. Etil asetat çözeltisini döner evaporatör kullanarak yoğunlaştırın, 10 mililitre heksan ekleyin ve tekrar konsantre olun. Azeotropically formik asit kalıntı kaldırmak için iki kez tekrarlayın.15 dakika içinde % 10-30 etil asetat ile eluting, flaş sütun kromatografisi ile kalıntı arındırın. Döner evaporatör istenilen kesirleri konsantre ve saflaştırılmış asit göze vacuo kuru. Ham karışımın enzimatik epoksidasyondan arındırılması ndan elde edilen flaş sütun kromatogramı burada gösterilmiştir.Üç büyük zirveleri elde edildi, sırayla eluting, ilk, tepkisiz DHA, ikinci, EDP izomerleri karışımı, ve, üçüncü, diepoxide, normal aşırı oksidasyon ürünleri olan. Rejiyoizomerlerin esterleşmesi ve ayrılmasından sonra proton NMR spektrumları yüksek saflıkta 16S, 17R-EDP ve 19S, 20R-EDP metil esterleri elde edildiğini göstermektedir. Chiral HPLC, EDP'lerin asit formlarının enantiomerik saflığını doğruladı.Kontaminasyonu önlemek için et suyunuzu steril tuttuğunızdan ve aşılama yaparken emin olun. Epoksidasyon diğer yağ asitleri için kullanılabilir. Biz de araşidonik ve eikosapentaenoik asitler le denedik ve bu enantiopure epoksitlerin iyi verimleri elde ettik, yani 14, 15-EET ve 17, 18-EEQ.Yani araştırmacıların epoksi yağ asitlerine erişmelerine izin veren bir protokol bu bileşiklerin biyolojik işlevleri üzerinde araştırmalara yardımcı olabilir, bu da ilaç yol açarken onların kullanımına yol açabilir. Tehlikeli kimyasallar temas ve teneffüs ile çok toksik olan Temas ve TMS-diazomethane, tehlikeli PMSF vardır. Yani ikincisi bir duman başlık ve uygun kişisel koruyucu ekipman ile kullanılmalıdır.

enzymatic-synthesis-epoxidized-metabolites-docosahexaenoic

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Bu protokol, hücrelerden serbest ve esterlenmiş biyoaktif yağ asitlerinin ekstraksiyonunu ve analizini gösterecektir. Yağ asitleri, kararlı izotop seyreltme, kiral sıvı kromatografisi, elektron yakalama, atmosferik kimyasal iyonizasyon, çoklu reaksiyon izleme, kütle spektrometresi (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS) kullanılarak doğru bir şekilde ölçülür.

Hücresel Lipid Ekstraksiyon Hedefli Kararlı İzotop Seyreltme Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Analizi

oksidatif dönüşümler için bir kofaktör - Biz hidrojen peroksidin ışık katalize nesil için bir protokol açıklar.

Işık odaklı enzimatik dekarboksilasyonu

Kiral amino alkoller çok yönlü kullanım için iskele organik sentezinde moleküllerdir. L-lizin başlayarak, biz sentez amino alkoller-diastereoselective C-H oksidasyon karboksilik asit yan tarafından karşılık gelen hidroksil amino asitin bölünme ardından dioxygenase tarafından katalize birleştiren bir enzimatik cascade tepki bir dekarboksilaz.

Enzimatik Cascade reaksiyonlardan L-lizin Amino kiral alkoller sentezi için

Bu protokol için biz BAKLA, bir phenyoxadiazolyl metil sulfone tabanlı reaktif yükler site seçici bağlantı için biomolecules, özellikle antikorlar thiols sentezi anlatacağız. Buna ek olarak, biz malzemelerin ve BAKLA taşıyan bifonksiyonel şelatör ve onun konjugasyon bir modeli antikor için anlatacağız.

Sentez ve Site seçici olarak oluşturulması için Thiol reaktif reaktif Bioconjugation Immunoconjugates modifiye

Bu çalışma, C. elegansendokannabinoid 2-arachidonoylglycerol (2-AG) tespit etmek ve ölçmek için sağlam ve basit bir yöntem açıklar. 2-AG'nin izotopik seyreltme ve sıvı kromatografi-elektrosprey iyonizasyon-tandem kütle spektrometresi (LC-ESI-MS/MS) ile ölçülmesi için hazırlanmış ve kullanılan analitik bir deuterated standarttır.

Caenorhabditis elegans 2-Arachidonoylglycerol Quantification için Bir Deuterated Standart Sentezi

Burada, in vivo kahverengi yağ dokusunda toplam yağ asidi de novo lipogenezinin analizi için döteryum oksit ve gaz kromatografisi kütle spektrometrisi (GCMS) kullanan ucuz bir kantitatif yöntem sunuyoruz.

Kahverengi Yağ Dokusunda De Novo Yağ Asidi Sentezinin Döteryum Oksit Kullanılarak Kantitatif Tayini

Göre çapraz-konjuge haç florofor 1,4-distyryl-2 ,5-bis (arylethynyl) benzen ve niteliksel olarak farklı bir benzobisoxazole çekirdekleri Lewis asidik ve Lewis baz analitler tanımlamak için kullanılabilir. Bu yöntem analit Ayrıca üzerine görülmektedir haç emisyon renklerdeki farklılıklar dayanır. Yapısal olarak yakından ilişkili türleri birbirlerinden ayırt edilebilir.

Karboksilik Asitler, Boronik Asitler ve Aminler nitel Kimlik haç fluorophores kullanarak

Kasıtlı olarak tasarlanmış metal-organik çerçeve maddelerin sentezi, aktivasyon ve karakterizasyonu bina blokları uyumsuz veya istenmeyen polimorflan termodinamik istenen formlar üzerinde tercih edilir, özellikle de zordur. Biz süperkritik CO 2 kurutma yoluyla kılcal ve aktivasyon çözücü-destekli bağlayıcı değişimi, toz X-ışını kırınımı uygulamaları, bu zorlukların bazılarını ele nasıl açıklar.

Fonksiyonlu Sentezi ve Karakterizasyonu Metal-organik Altyapıları

Nano boyutlu monosodyum titanatın yüzey aktif madde aracılı sol-jel sentezi, karşılık gelen peroksit modifiye edilmiş malzemenin hazırlanması ile birlikte açıklanmaktadır. Au(III) ile bir iyon değişim reaksiyonu da sunulmaktadır.

Nanoboyutlu Monosodyum Titanate Sentezi ve Reaksiyon Kimya

Supramoleküler kısımlarla kaplanmış kolloidlerin sentezi ve karakterizasyonu için bir protokol açıklanmıştır. Bu supramoleküler kolloidler, yüzeye sabitlenmiş moleküller arasındaki hidrojen bağlarının UV ışığı ile aktivasyonu üzerine kendi kendine birleşir.

Supramoleküler Kolloidlerin Sentezi ve Karakterizasyonu

Öğrenin DHA, EPA ve AA için enantiyomerik saf epoksi yağ asitlerinin enzimatik sentezi. Bu hızlı, uygun maliyetli yöntem, biyolojik mekanizmaları araştıran araştırmacılara ölçeklenebilir üretim sağlar.

Dokosahexaenoic, eicosapentaenoic ve Arachidonik asitlerin Epoxilenmiş metabolitlerinin enzimatik sentezini

Daha fazla video keşfet