Iyi tanımlanmış kayma stres altında tek hücreli Iyon akımları elektrofizyolojik kayıtlar

Bu protokolün amacı, kayma stresi ile mekanik duyarlı iyon kanallarının gerçek zamanlı aktivasyonunu araştırırken kullanılmak üzere değiştirilmiş bir paralel plaka akış odasını tarif etmektir.

Modifiye paralel plaka akış odasının kullanımı, araştırmacıların mechanosensitive iyon kanallarının işitme gerilimine işlevsel yanıtıyla ilgili anahtar soruları yanıtlamalarına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, gerçek zamanlı araştırmanın, kolayca monte edilebilen, yeniden kullanılabilir paralel plaka akış odasında aktif iyon kanallarının akmasını sağlamasıdır. İşleme başlamak için, C parçasının dikdörtgen uzayının kenarlarına ince bir silikon elastomer çözeltisi uygulayın ve dikdörtgen kapak camı, D parçasını doğrudan elastomer çözeltisinin üzerine yerleştirin.

Daha sonra, dikdörtgen kapak camı, Parça F, parça E altına yapıştırma prosedürü tekrarlayın ve silikon elastomer çözeltisi oda sıcaklığında bir gecede tedavi sağlar. Şimdi, mpp akış odasını sırayla her parçayı bir öncekinin üstüne yerleştirerek birleştirin, alt oda, E parçası, sonra C parçası, B parçası, ardından a parçası üstte. Daha sonra, köşelerde her parçanın vida deliklerini hizalayın ve MPP akış odasına akış uygulanırken sızıntıların oluşmasını önlemek için parçaları sıkıca vidalayın.

Altı kuyulu bir tabakta, her kuyuya 4-5, 12 milimetrelik kapak lı cam daireler yerleştirin. Hücreleri %10 ile %30 arasında bir araya kaydedin, öyle ki elektrofizyolojik kayıtlar için tek hücrelere erişilebilebilir. Daha sonra, endothelial hücreler düz olacak ve 24 saatten fazla subfluency tohumlu zaman yama zor olacak gibi, en az iki saat için standart kültür koşulları altında hücreleri kuluçka.

Daha sonra, altı kuyulu bir tabaktan yapışmış hücreleri içeren bir kapak camı çıkarın ve PBS'de hızlı bir şekilde durulayın. Daha sonra, hücrelerle birlikte kapak camı, iki mililitre elektrofizyolojik BAF çözeltisi içeren 35 milimetrelik Petri kabına aktarın. Hemen mpp akış odasına hücreleri ile kapak cam aktarın.

Kapak cam daire dikdörtgen kapak cam, parça D, MPP akış odasının C parçası yapıştırılır aktarın. Kapak cam çemberini ve hücreleri tamamen batırmak için BAF çözeltisini ekleyin. Daha sonra, kapak cam çemberini D parçasına yerleştirin, öyle ki hücreler b.Kapak cam çemberinin akış uygulaması ile kapak cam çemberinin konumunun bozulmasını önlemek için solüsyon cam yapışmayoluyla D parçasına yapışmasını sağlayın.

Daha sonra, parçaları uygun sırada birbirine vidalayarak MPP akış odasını monte edin. Odayı mikroskop aşamasına aktarın ve hemen hazneyi BAF çözeltisi ile perfitle edin. Daha sonra, deney için karanlık kenarlıklı ve bariz çekirdeği olan sağlıklı bir hücre tanımlayın.

Blubbing gibi görünen hücrelerden veya diğer hücrelerle temas eden hücrelerden kaçının. Kesme stresini kontrol etmek için, 30 mililitrelik bir şırınga silindirini mikrodelik boru ile donatılmış üç yönlü Luer kilidine bağlayarak bir yerçekimi perfüzyon sistemi kurun. Daha sonra, mezun silindiri çift taraflı bant kullanarak elektrofizyoloji teçhizatını çevreleyen Faraday kafesine takın.

Tüpü MPP haznesine takmadan önce şırıngayı ve tüpü BAF çözeltisi ile önceden doldurun. Daha sonra, boruyu MPP akış odası giriş deliğine yerleştirin A.Pre-dolgu mpp akış odasını vakum haznesinde çıkarılacak şekilde solüsyonla doldurun. Odaya akışı durdurun ve üst işareti mezun silindir yeniden doldurun.

Çözümün belirli bir şırınga silindiri yüksekliğinde hazneden akmasını sağlayarak bir kronometre kullanarak akış hızını manuel olarak hesaplayın. Bu denklemi kullanarak akışı değiştirmek ve paralel bir odadaki kesme gerilimini hesaplamak için şırıngayı yükseltin veya düşürün. İstenilen kesme gerilimi bulunana kadar bu işlemi tekrarlayın.

Daha sonra, elektrofizyoloji teçhizatMikroskop aşamasına bağlı hücreleri içeren bir monte oda aktarın. Ve baf çözeltisi ile önceden doldurulmuş boruyu A.Then parçasının deliğine yerleştirin, odayı doldurun ve hücreleri aynı anda 10 mililitre BAF çözeltisi ile yıkayın. İstenilen yama yapılandırması başarıyla elde edildikten sonra, kanal akımlarının oda sıcaklığında statik bir banyoda stabilize olmasını bekleyin.

Akımlar stabilize olur olmaz, kesme geriliminin bir sonraki adımından önce artan akımın stabilize olmasını sağlayan, adım adım şeklinde kesme uygulayın. Mechanosensitive kanal akımlarının statik banyoda gözlenen temel akımlara dönmesini sağlayarak, bölmeye akışı durdurarak hücrelere yakalama maruziyetini kaldırın. Burada gösterilen belirgin doğrusal dışa sızıntı akımı ile birincil fare mezenterik endotel hücresinden Kir akımı temsili bir ham kaydıdır.

Yama 400 milisaniyenin üzerinde negatif 140 ila pozitif 40 milivolt luk bir rampa uygulandı. Sızıntı akımı gerçek Kir kanal aktivitesinin analizini engeller. Sızıntı akımını çıkarmak için, önce sızıntı akımının doğrusal eğim iletkenliğini hesaplayın.

Ham veri üzerinde sızıntı akımı arsa için tüm ham iz karşılık gelen gerilimler tarafından çoklu G eğimi. Çizgi tam olarak dışa doğrusal sızıntı bindirmegerekir. Daha sonra, doğrusal dışa doğrusal akım picofarad başına yaklaşık sıfır picoamperes ve gerçek Kir akımı analiz edilebilir böylece tüm iz çizilmiş sızıntı akımı çıkarın.

Bu prosedürü denerken hatırlanması gereken en önemli şey, hücrelerin deneyler için erişilebilir olması için kapak camı odanın düzgün bir şekilde yerle bir etmektir. Buna ek olarak, kapak fişinin D parçasına yeterince yapıştığından, sıvı akışının hücreleri içeren kapak camı bozmayan bir şekilde yapıştırılmasından emin olun.