Name: Mikroenjeksiyon kullanarak ınsan hela hücrelerinde Spliceosomal snRNA yerelleştirme Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-06T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Öğrenin, HeLa hücrelerinde mikroenjeksiyon kullanarak spliceosomal snRNA'ların Cajal cisimciklerine yerelleşme mekanizmalarını incelemeyi. Bu yöntem, RNA dizilerinin hücresel fonksiyonlardaki rolünü ortaya çıkarır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Çek Bilim Vakfı (18-10035S), Ulusal sürdürülebilirlik programı ı (LO1419), kurumsal destek (RVO68378050), Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (CZ. 02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775) ve hibe ajansı tarafından destekleniyordu. Charles Üniversitesi (GAUK 134516). Biz daha fazla ışık mikroskobu çekirdek tesisi kabul, ıMG CAS, Prag, Çek Cumhuriyeti (hibe tarafından desteklenen (Czech-Bioımaging-LM2015062).

1. mikroenjeksiyon için snRNAs hazırlanması
<ol><li>Aşağıdaki PCR kurulumunu kullanarak snRNA 'nın tam uzunluklu veya kesilmiş/mutasyona uğramış sürümünü içeren bir DNA şablonunu hazırlayın: 98 °C 60 s, 98 °C için 15 s, 68 °C 30 s, 72 °C için 1 dakika, 98 °C için 15 s 35x ve 72 °C 5 dk.</li>
	<li>İleriye dönük astar, ilk transkripsiyon nükperotid 'in sadece upstream olarak in vitro dökümü için bir organizatör dizisi içermelidir. U2 snRNA dizisini, T7 promotör ve ters astar içeren ileri astar kullanarak arttırın (Ayrıntılar için malzeme tablosuna bakın).</li>
	<li>Kısa RNA sentezi için bir kit kullanarak snRNA sentezini (bkz: Ayrıntılar için malzeme tablosu ) T7 RNA polimeraz içeren. 1 mM ATP Ekle, 1 mM CTP, 1 mM GTP, 0,8 mM UTP, 0,2 mM UTP-Alexa488, 1,8 mM trimethylguanosine Cap analog (m32, 2, 7g (5 ') PPP (5 ') G), 1 ml RNA inhibitörü ve NG reaksiyon500-700 una karşı karışımı ve 37 °c ' de bir gecede inkük.</li>
	<li>Reaksiyonda 1 μL (2U) DNase ekleyin ve 37 °C ' de 15 dk ek için Inküye yapın.</li>
	<li>Asitli fenol/kloroform ekstraksiyon ile snRNA izole. Üst su fazını çıkarın ve 3 M sodyum asetat (pH = 5,2), 3 μL glikojen daha iyi Pelet görselleştirme ve 2,5 hacimleri% 100 etanol orijinal hacminin 1/10 ekleyin. 1 saat-80 °C ' ye kadar inkük, 14.000 x g ve 4 °c ' de 10 dakika Santrifüjü.</li>
	<li>70% etanol ile Pelet yıkayın ve 12 μL nükleücretsiz su içinde çözülür. Her zamanki RNA verimi yaklaşık 600 ng/mL 'Dir. -80 °C ' de saklayın.</li>
	<li>Agaroz jel elektrophoreses ile in vitro transkripsiyonu snrnas bütünlüğünü izleyin.</li>
	<li>Mikroenjeksiyonu yapmadan önce, 10 μg/μL dextran-TRITC 70 kDa içeren suda son konsantrasyon 200 ng/mL 'ye seyreltin.</li>
</ol>2. hücreler
<ol><li>Kullanmadan önce, 1 M HCl ile coverfları tedavi 1 h, damıtılmış su iyice yıkayın ve 100% etanol içinde saklayın. Asidik tedavi sırasında veya enjeksiyon sonrası hücre peeling önlemek için hücreleri yapışma teşvik eder. Enjekte hücrelerin daha kolay tanımlanması için, bir ızgara ile bir lamel magazini kullanın.</li>
	<li>Tohum HeLa veya diğer yapışan hücreler 1 gün önce mikroenjeksiyon üzerinde 12 mm kapak (No. 1 veya No. 1,5) ulaşmak için 50% mikroenjeksiyon sırasında konfluency.</li>
</ol>3. enjeksiyon
Not: HeLa hücreleri Dulbecco modifiye kartal orta mikroenjekte edildi (D-MEM, 4,5 g/L D-glikoz fenol kırmızı ve antibiyotikler içeren). Enjeksiyon bir enjektör ve steril iğne ile donatılmış bir Mikromanipülatör kullanılarak yapılmıştır (Ayrıntılar için malzeme tablosuna bakın). Mikroskobik/Mikromanipülatör sistemi, mikroskop ve microinjector bireysel parçalarının dalgalanması önlemek için en az 4 h için 37 °C ' ye önceden ısıtıldı.
<ol><li>2 ml kültür ortamını içeren Petri tabağı (30 mm), ortadaki lamel magazini ile mikroskop sahibi haline koyun. Bir mikroyükleyici kullanarak iğne içine 3 μL snRNA karışımı yükleyin. Petri tabağı yüzeyine göre 45 ° ' de mikroenjektör tutucusuna iğne takın.</li>
	<li>İğne bulmak için, 10X uzun mesafe hedefi kullanın. İlk olarak, enjektör üzerinde hızı kaba ayarlayın ve kültür ortamına dokunur kadar iğne aşağı. Mikroskop dürbünlerini kullanarak, iğne kültür ortamına dokunan yer olan parlak noktayı bulun.</li>
	<li>İnce ve iğne ucu görülene kadar mikroskop bakarak iğne daha düşük hızını değiştirin. Görsel alan ortasında iğne hareket ve 40X uzun mesafe hedefe geçiş.</li>
	<li>Hedefi değiştirdikten sonra, hücreyi seçin ve iğne bu hücrenin üzerine taşıyın. Hücre teması için basınçları ve zamanı ayarlayın (bkz. Ipuçları ve tartışma sorunlarını giderme).</li>
	<li>İğneyi hücreye taşıyın ve ardından mikromanipülatörün alt sınırını ayarlayın. Hücre altında iğne taşımak için dikkatli olun.</li>
	<li>Alt sınırı ayarladıktan sonra, iğne hücrenin üzerine geri taşıyın ve enjektör joystick üzerinde enjeksiyon düğmesine basın. İğne, hücrenin içinde otomatik olarak sınırın ayarlanmış olduğu yere taşınır ve RNA karışımı enjekte eder.</li>
	<li>Bitirmek için, enjektör üzerinde düğme menüsünü itin ve tutucunun iğne çıkarın. Enjektörü ve mikromanipülatörü kapatmadan önce tüpü enjektörden çıkarın.</li>
</ol>4. hücre Fikreme ve boyama
<ol><li>Mikroenjeksiyonu yaptıktan sonra, hücreleri CO2 kuluçk içine dönün ve 37 °c ' de 1 saat boyunca Inküye yapın.</li>
	<li>İnkübasyon sonra, hücreleri üç kez fosfat tamponlu tuz çözeltisi ile durulayın (PBS) Oda sıcaklığında, düzeltmek 20 dakika ile 4% civarında formaldehite 0,1 M borular pH 6,9, ve yıkama üç kez oda sıcaklığı PBS ile. Yalnızca snRNA lokalizasyonu analiz edildiğinde, hücreleri su içinde kısaca durulayın ve DAPı ile bir montaj ortamına monte edin.</li>
	<li>Ek protein lokalizasyonu durumunda, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS 'de% 0,5 Triton-X100 ile hücreleri geçirgen. PBS ile üç durulama sonra, primer ve ikincil antikorlar ve PBS son yıkanır ve su kısa durulama sonra, DAPı ile bir montaj ortamı monte hücreleri inküstir.</li>
</ol>5. mikroskobik
<ol><li>Montajdan hemen sonra görüntülenmiş değilse, slaytları görüntüleme kadar 4 °C ' de saklayın.</li>
	<li>Bir daldırma objektif (60X veya 100x/1.4 NA) ile donatılmış bir High-End floresan mikroskobik sistemi kullanarak görüntüleri elde.</li>
	<li>Mikroenjeksiyonlu hücreler belirlendikten sonra, numune başına 200 Nm z basamakları ve matematiksel deconvolution ile 20 z-Bölüm yığını toplayın. Daha sonra maksimal projeksiyonlar veya bireysel z yığınları sunuldu.</li>
	<li>Floresan sinyalini ölçmek için, aytac immünostakresi ile tanımlanan bir Cajal vücudun etrafında ilgi alanı (YG) çizin. Coilin tanımlı YG 'de snRNA sinyalinin yoğunluğunu ölçün. Sonraki ROı içinde snRNA floresans yoğunluğu nükploplazm rasgele yerleştirilir ve Cajal vücutta RNA sinyalinin oranını hesaplamak ve nükostoplazm belirleyin.</li>
</ol>

<ol><li>Ishikawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+truncated+forms+of+U1+snRNA+reveals+a+novel+RNA+degradation+pathway+during+snRNP+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 42 (4), 2708-2724 (2014).</li>
<li>Stanek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cajal+bodies+and+snRNPs+-+friends+with+benefits%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Cajal bodies and snRNPs - friends with benefits.</a> RNA Biology. 14 (6), 671-679 (2017).</li>
<li>Stanek, D., Fox, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+bodies%3A+news+insights+into+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curentr+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nuclear bodies: news insights into structure and function.</a> Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).</li>
<li>Novotny, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SART3-Dependent+Accumulation+of+Incomplete+Spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies.</a> Cell Reports. 10, 429-440 (2015).</li>
<li>Roithova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sm-core+mediates+the+retention+of+partially-assembled+spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+bodies+until+their+full+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation.</a> Nucleic Acids Research. 46 (7), 3774-3790 (2018).</li>
<li>Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleo-cytoplasmic+transport+of+U+snRNPs%3A+definition+of+a+nuclear+location+signal+in+the+Sm+core+domain+that+binds+a+transport+receptor+independently+of+the+m3G+cap%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap.</a> EMBO Journal. 12 (2), 573-583 (1993).</li>
<li>Shukla, S., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+of+assembly-defective+U1+snRNAs+by+decapping+and+5%27-to-3%27+exonucleolytic+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5'-to-3' exonucleolytic digestion.</a> Proceeding of the National Academy of U S A. 111 (32), E3277-E3286 (2014).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+message+clear%3A+visualizing+mRNA+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Making the message clear: visualizing mRNA localization.</a> Trends in Cell Biology. 20 (7), 380-390 (2010).</li>
<li>Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+U4%2FU6+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle+association+in+Cajal+bodies+predicted+by+mathematical+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (12), 4972-4981 (2006).</li>
<li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

SnRNA lokalizasyonu için nükleer Cajal organları için önemli dizileri belirlemek için floresan etiketli snRNAs mikroenjeksiyon istihdam. Etiketli RNAs 'ların hızlı ve oldukça basit hazırlanması nedeniyle (PCR ile DNA şablonunun hazırlanması ve ardından in vitro transkripsiyon) yöntem, çeşitli dizilerin RNA lokalizasyonu için nasıl katkıda bulunduğunu etkili bir analiz sunar. Nispeten kısa sürede, U2 snRNA 'nın on farklı silme veya değiştirme işlemlerini analiz edebildik (referans5 ve veri gösteril...

RNA birleştirme, spliceosome denilen büyük bir Ribonükleoprotein kompleksi tarafından katalizlenmiş gen ifadesinde önemli adımlardan biridir. Toplam olarak, 150 ' den fazla protein ve 5 küçük nükleer RNAs (snRNAs) spliceosome içine birleştirme yolu farklı aşamalarında entegre edilmiştir. U1, U2, U4, U5 ve U6 snRNAs, büyük GU-AG intron 'larının takılmasını yapmaya katılıyor. Bu snRNAs, snRNA içeren önceden biçimlendirilmiş küçük nükleer Ribonükleoprotein parçacıkları (snRNPs), snRNA ile ilişkili yedi SM proteinleri (U6 snRNA ile ilişkilendirmek gibi-SM proteinleri) ve her snRNP için spesifik 1-12 proteinleri olan spliceosome 'a katılır.
SnRNPs montajı sitoplazmik ve nükleer aşamaları içerir. Yeni yazılmış snRNA, yedi SM proteininden toplanan bir yüzüğü satın aldığı sitoplazmada ihraç edilir. SM halkası daha sonra snRNA 'nın çekirdeğe yeniden ithalatı için bir sinyal olarak hizmet vermektedir. SM proteinleri ile ilişkilendirmek için başarısız arızalı snRNAs sitoplazmada korunur1. Yeni ithal snrnps ilk Cajal vücutta nerede onlar snrnp özgü proteinler karşılamak ve olgunlaşma bitirmek görünür (referans2,3' te gözden). Son olgunlaşma adımlarını inhibisyonu Cajal organları4,5olgunlaşmamış snrnps sekestrasyon sonuçları gösterdi. Biz son snRNP olgunlaşma snRNP özgü Protein ilavesi ve aktif snRNPs oluşumu izler kalite kontrol altında bir model önerdi. Ancak, hücrelerin doğru birleştirilen olgun ve anormal olgunlaşmamış parçacıklar arasında ayırt nasıl moleküler detayları zor kalır.
Nükleer Cajal vücutlarının hedefleme ve snRNAs birikimi için gerekli olan snRNA dizileri belirlemek için, floresan etiketli snRNAs mikroenjeksiyon istihdam etmeye karar verdik. Mikroenjeksiyon bir seçim yöntemidir, çünkü: 1) sentetik snRNAs 'ların, ekstra etiket dizisinin yerleştirilmesi için az alan olan kısa RNAs 'lar için özellikle önemli olan endojen meslektaşlarını ayırt etmek için ek bir sıralı etiket gerektirmediği; 2) biyogenesis için önemli olan dizileri analiz sağlar. Örneğin, SM dizisi SM Ring montajı için gereklidir ve çekirdek6' ya yeniden içe aktarabilir. SnRNAs hücrede ifade edildiğinde, SM dizisi bulunmayan snRNAs sitoplazmada bozulur ve çekirdeğin ve Cajal organları7' ye ulaşmaz. Ancak, SM dizisi olmadan snRNAs doğrudan çekirdeğin içine mikro enjekte edilebilir ve böylece Cajal vücut lokalizasyonu içinde SM dizisinin potansiyel bir rolü assayed.
Burada, snRNA dizilerini Cajal gövdesine5' e hedef almak için gerekli olan bir mikroenjeksiyon yöntemi hakkında ayrıntılı olarak tarif ediyoruz. Biz SM ve SMN bağlayıcı siteleri birlikte gerekli ve sadece snRNAs ama Cajal vücuda çeşitli kısa olmayan kodlama RNAs yerelleştirmek için yeterli olduğunu göstermiştir. Mikroenjeksiyon yanı sıra diğer kanıtlar dayalı, biz SM halka SM bağlayıcı site monte Cajal vücut yerelleştirme sinyali olduğunu önerdi.

<table><tbody><tr><td>ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP</td><td>ThermoFisher</td><td>C11403</td><td>Stok konsantrasyonu 1 mM</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Orta - yüksek glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td>4.5 g & frasl içeren; L D-glikoz, Fenol kırmızısı ve antibiyotikler</td></tr><tr><td>FemtoJet ekspres Enjektör</td><td>Eppendorf</td><td>5247000013</td><td></td></tr><tr><td>Femtotips II</td><td>Eppendorf</td><td>930000043</td><td>0.5 ve mikro mikroenjeksiyon iğnesi; m iç ve 0.7 & mikro; m dış çap</td></tr><tr>DAPI <td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td>ile<td>Fluoromont</td></tr><tr><td>G Glikojen</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9510</td><td>Stok konsantrasyonu 5 mg/mL</td></tr><tr><td>Izgaralı Cam Lameller</td><td>Ibidi</td><td>10817</td><td>Izgaralı lameller, onlarla doğrudan deneyim yok</td></tr><tr><td>InjectMan NI 2 Mikromanipülatör</td><td>Eppendorf</td><td>5181000017</td><td></td></tr><tr><td>m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimetillenmiş kapak analogu</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-853-1</td><td>Stok konsantrasyonu 40 mM</td></tr><tr><td>MEGAshortscript T7 Transkripsiyon Kiti</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Kapak Camları 12 mm, No. 1</td><td>Paul Marienfeld GmbH</td><td>111520</td><td>Rutin işler için</td></tr><tr><td>Mikroskop Kapak Camları 12 mm, No. 1.5</td><td>Paul Marienfeld GmbH</td><td>117520</td><td>Yüksek için Çözünürlük Görüntüler</td></tr><tr><td>Mikroskop DeltaVision</td><td>GE Sağlık Görüntü</td><td></td><td>elde etmek için</td></tr><tr><td>Mikroskop DMI6000</td><td>Leica</td><td></td><td>Mikroenjeksiyon için</td></tr><tr><td>Paraformaldehit %32 çözelti EM sınıfı</td><td>EMS</td><td>15714</td><td>BORULARDA nihai konsantrasyona kadar çözülür %4</td></tr> <tr><td>Fenol: Kloroform 5: 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1944</td><td></td></tr><tr><td>U2 amplifikasyonu için primerler: İleri: 5'-TAATACGACT CACTATAGGGATCGCTTCT CGGCCTTTTGG, Ters: 5&akut; TGGTG CACCGTTCCTGGAGGT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>T7 rpromoter dizisi italik</td></tr><tr><td>Phusion High Fidelity DNA polimeraz</td><td>BioLab</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Plus</td><td>Promega</td><td>N2615</td><td>Stok konsantrasyonu 40 mM</td></tr><tr><td>Tetrametilrodamin izotiyosiyanat Dekstran 65-85 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1162</td><td>Suda çözülmüş, stok konsantrasyonu 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Serva</td><td>37240</td><td>Suda çözünmüş, stok konsantrasyonu %10</td></tr></tbody></table>

mikroenjeksiyon kullanarak ınsan hela hücrelerinde spliceosomal snrna yerelleştirme analizi

Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

İntronları snrnas Biogenesis hem nükleer ve sitoplazmik aşamaları içeren karmaşık bir süreçtir ve son adım Cajal vücut denilen bir nükleer bölme oluşur. Ancak, snRNA lokalizasyonu bu subnuclear yapısına doğrudan dizileri yakın zamana kadar bilinmemektedir. Cajal vücutlarında snRNAs birikimi için önemli dizileri belirlemek için, floresan etiketli snRNAs 'ın Mikroenjeksiyonu ve ardından hücrelerin içindeki lokalizasyonu ile çalışmaktadır. İlk olarak, snRNA silme mutantlar hazırladık, in vitro transkripsiyon için sentezlenmiş DNA şablonları ve Alexa488 ile birleştiğinde UTP varlığı ile snRNAs transkripsiyonu. Etiketli snRNAs TRITC ile konjuli 70 kDa-dextran ile karıştırıldı ve Kernel veya insan HeLa hücrelerinin sitoplazması mikroenjekte edildi. Hücreler 1 h ve sabit ve Cajal vücut Marker aytac dolaylı immünofluorescence tarafından görselleştirilmiş iken, snrnas ve dextran, hangi nükleer veya sitoplazmik enjeksiyon bir marker olarak hizmet veren, doğrudan bir floresan mikroskop kullanılarak gözlenmiştir. Bu yöntem, çeşitli sıraları hücrelerin içinde RNA lokalizasyonu nasıl etkilediğini verimli ve hızlı test etmek için izin verir. Burada, snRNAs 'ın Cajal gövdesine verimli bir şekilde lokalizasyonu için SM-bağlayıcı dizisinin önemini gösteriyoruz.

SnRNA lokalizasyonunu ve Cajal vücut hedeflemede SM bağlama sitesinin rolünü izlemek için, T7 Organizatör içeren bir DNA şablonu ve SM bağlayıcı sitesini oluşturan yedi nükleotid (auuuuug) bulunmayan tam uzunlukta U2 snRNA veya U2 snRNA 'yı hazırladık. snRNAs in vitro transkripsiyonu, izole ve TRITC-bağlı dextran-70kDa ile karışık. İçinde vitro olarak transkripsiyonu snRNA içeren karışımı mikroenjekte ettik.
Daha önce SM bağlayıcı sitenin nükleer ithalat6için gerekli olduğunu göster...

İntronları snrnas Biogenesis çeşitli hücresel bölmeler içeren karmaşık bir süreçtir. Burada, hücrenin içindeki taşımalarını izlemek için floresan etiketli snRNAs 'ın Mikroenjeksiyonu çalışılmış.

Mikroenjeksiyon kullanarak ınsan hela hücrelerinde Spliceosomal snRNA yerelleştirme Analizi

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

Burada, kısa nükleer RNA'ların Cajal cisimleri adı verilen nükleer yapılara yerelleştirilmesi için gerekli olan RNA dizilerini tespit etmek için floresan etiketli RNA'ların mikroenjeksiyonunu uyguladık. Bu tekniğin iki büyük avantajı vardır. İlk olarak, etiketlenebilen ve izlenmesi zor olan kısa RNA'lar için uygulanabilir.Ve ikincisi, farklı dizilerin hızlı bir şekilde taranmasına ve RNA yerelleştirmedeki rollerinin test edilmesine olanak tanır. Bir gün önce mikroenjeksiyon, tohum HeLa veya diğer yapışık hücreler 12 milimetre kapakları üzerinde mikroenjeksiyon sırasında% 50 birleştiği zaman ulaşmak için. Başlamak için, bir Petri kabının ortasına hazırlanmış bir kapak yerleştirin, hücreleri ve kültür medya iki milimetre ekleyin.Ertesi gün, hücre dolu Petri kabını mikroskop aşamasına yerleştirin. Bir mikroloader kullanarak, snRNA karışımının üç mikrolitresini iğneye yükleyin ve iğneyi Petri kabının yüzeyine göre 45 derecelik bir açıyla mikroenjektörtutucuya takın. İğneyi bulmak için 10X uzun mesafe hedefi kullanın.İlk olarak, enjektörüzerinde hız kaba ayarlayın ve kültür ortamı dokunur kadar iğne indirin. Mikroskop dürbün kullanarak, iğne kültür ortamı dokunur yerdir parlak nokta bulmak. İğnenin ucu gözlemlenene kadar mikroskoba bakarken iğneyi ince ve daha da düşürmek için hızı değiştirin.İğneyi görme alanının ortasında hareket ettirin ve 40X uzun mesafe hedefine geçin. Bundan sonra, hücreseçin ve hücre üzerinde iğne hareket ettirin. Hücre teması için basıncı ve zamanı ayarlayın.İğneyi hücreye doğru hareket ettirin ve mikromanipülörün alt sınırını ayarlayın. Alt sınırın ayarlanması protokolün en kritik parçasıdır. Kapak yüzeyi mükemmel olmadığından ve her hücre farklı olduğundan enjeksiyon seansı sırasında alt sınırı birkaç kez ayarlamanız gerekir.Daha sonra iğneyi hücrenin üzerine geri taşıyın ve enjektörün joystick'indeki enjeksiyon düğmesine basın. İğne otomatik olarak hücre içinde rna karışımı enjekte etmek için sınır ayarlanır yere hareket edecektir. Bitirmek için enjektörün üzerindeki menü düğmesine basın ve iğneyi tutucudan çıkarın.Daha sonra enjektör ve mikromanipülörü kapatmadan önce tüpü enjektörden çıkartın. Mikroenjeksiyondan sonra hücreleri karbondioksit kuvöze döndürün ve bir saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra, oda sıcaklığında PBS ile hücreleri üç kez durulayın.PH 6.9'da 0.1 molar borularda %4 paraformaldehit ile hücreleri 20 dakika boyunca düzeltin. Daha sonra hücreleri oda sıcaklığında PBS ile üç kez yıkayın. Sadece snRNA lokalizasyonu analiz edilirse, hücreleri sudaki durulayın ve DAPI ile montaj ortamına monte edin.Ek protein lokalizasyonu durumunda, hücreyi PBS'de %0.5 Triton X-100 ile oda sıcaklığında beş dakika geçirin. Hücreleri PBS ile üç kez durulayın ve metin protokolünde belirtildiği gibi uygun birincil ve ikincil antikorlarla lekeleyin. Daha sonra PBS ile üç kez durulayın ve suda bir kez durulayın.Bundan sonra, DAPI ile bir montaj orta hücreleri monte. Görüntüye hazır olduğunuzda, görüntüleri elde etmek için daldırma hedefiyle donatılmış üst düzey bir floresan mikroskobik sistem kullanın. Mikro enjekte edilen hücreler tanımlandıktan sonra, numune başına 200 nanometre Z adımlı ve matematiksel dekonvolutiona tabi olan 20 Z kesitlerinden oluşan bir yığın toplayın.Floresan sinyali ölçmek için önce ImageJ'deki mikroskopi görüntüsünü açın ve kanalları pencerelere bölün. Pencereleri eşitleme penceresi aracıyla eşitleyin. Daha sonra, coilin immunostaining ile tanımlanan bir Cajal vücut etrafında ilgi bölge çizin.Bobin tanımlı Yatırım Getirisi'ndeki snRNA sinyalinin yoğunluğunu ölçün. Nkleoplazm'a rasgele yerleştirilen ROI'daki snRNA floresansının yoğunluğunu belirleyin. Ölçülen değerleri kaydedin ve Cajal gövdesi ve nükleoplazmdaki RNA sinyalinin oranını hesaplayın.Bu çalışmada floresan etiketli snRNA'lar hücre içindeki ulaşımlarını izlemek için mikro enjekte edilmiştir. SM sitesinin Cajal vücut birikimi için önemli olup olmadığını test etmek için, SM bölgesinden yoksun snRNA doğrudan çekirdeğe mikroenjekte edilir. Tam uzunlukta snRNA pozitif kontrol olarak hizmet etmek için mikroenjekte edilirken sitoplazma içine enjeksiyon bir kontrol olarak hizmet vermektedir.Kuluçkadan sonra mikroenjekte edilen hücreler sabitlenir ve Cajal cisim işaretbobini dolaylı immünoresans ile görselleşir. Tam uzunlukta snRNA cajal cisimlerde hem nükleer hem de sitoplazmik enjeksiyonlar sonra birikmiş. Buna karşılık, SM alanı olmayan snRNA bu bölmeye mikroenjeksiyon dan sonra sitoplazmada kalırken, SM sitesi olmadan snRNA'nın nükleer mikroenjeksiyonu, snRNA'nın çekirdekte kaldığı ancak Cajal cisimlerde birikmediği için SM bağlama dizisinin Cajal vücut lokalizasyonu için önemli olduğunu ortaya koymaktadır.Bazen sadece bir hücresel bölmeiçine mikroenjeksiyon başarısız olur ve kandırdı Dextran 70 kilodalton hem çekirdek hem de sitoplazmabulunabilir. Bu hücreler daha fazla analiz atılır. Floresan etiketli snRNA'lar enjeksiyondan önce negatif 80 santigrat derecede depolanmasına rağmen RNA bozulması meydana gelebilir.Sitoplazmaya enjekte edilen bozulmuş snRNA çekirdeğe taşınmaz ve sitoplazmada lokalize kalır. Bu tür snRNA atılmalıdır ve yeni snRNA sentezlenmelidir. İğneve kompanzasyon basınçlarını hücre tipinize doğru şekilde ayarlamak önemlidir.Ve daha önce de belirtildiği gibi, hücre enjeksiyonu için doğru alt sınırı ayarı iyi bir mikroenjeksiyon için gereklidir. RNA izolasyonu sırasında kullanılan fenol-kloroformun tehlikeli olduğunu ve mikroenjeksiyon iğnesinin keskin bir nesne olduğunu lütfen unutmayın. Bu malzemeleri kullanırken dikkatli olun.

analysis-spliceosomal-snrna-localization-human-hela-cells-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Pre-mRNA geçici doğası nedeniyle, izole etmek ve incelemek için zor...

İnsan pre-mRNA üzerinde Haritalama Ribonucleoproteins Hızlı Yüksek verim için Yöntemi (RNPs)

Burada floresan ile birleştiğinde mikroenjeksiyon güç kullanan bir...

Mikroenjeksiyon tarafından Memeli Hücreleri mRNA Nükleer İhracat Kinetik Analizi

RNA in situ hibridizasyon (ISH), hücre ve dokulardaki RNA'ların görselleştirilmesini sağlar. Burada, RNAscope ISH'nin immünohistokimya veya histolojik boyalarla kombinasyonunun, fare ve insan beyninin bölümlerinde aksonlara lokalize mRNA'ları tespit etmek için nasıl başarılı bir şekilde kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Yüksek Çözünürlük kullanma Beyin bölümlerde Axonally Lokalize mRNA&#39;larının Algılama<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme

Kısa antianlamlı oligonucleotides fare beyin bölümlerde alternatif pre-mRNA yapıştırma desenleri algılamak için kullandığı bir in situ hibridizasyon (ISH) protokolü tanımlanır.

Kantitatif analiz alternatif Pre-mRNA RNA In Situ hibridizasyon tahlil kullanarak fare beyin bölümlerde Uçbirleştirme

Burada, hassas ve belirli algılama dizileri gibi tek hücre düzeyinde tek nükleotid çözünürlük ile 50 nukleotid kısa sağlayan bir in situ hibridizasyon tahlil açıklayın. El ile veya otomatik olarak gerçekleştirilebilir, tahlil splice türevleri, kısa dizileri ve mutasyonlar doku çerçevede görselleştirme etkinleştirebilirsiniz.

Genetik varyantların, kısa hedefleri ve nokta mutasyonlar bir RNA In Situ hibridizasyon tahlil ile morfolojik doku bağlamda görüntülenmesi

Bu iletişim kuralı canlı hayvan veya gelişmiş lac önleyici ve/veya tet harekete geçirmek sistemleri kullanarak hücreleri içinde ilgi endojen bir gen transkripsiyonu koşullu olarak kontrol edilebilir bir modeli sistemi oluşturmak için gereken adımları açıklar.

Uzaktan kumandalı sistem in vivo uygulama için işleme endojen gen ekspresyonu

Tekrarlanarak mRNA'ların içinde bireysel yumurtalar, tek molekül RNA Floresans in situ olarak sayıları saymak için hibridizasyon (RNA-balık) yapışık olmayan hücreler için optimize edildi. Yumurtalar toplanmıştır, transkript belirli probları ile melezleşmiştir ve bir görüntü miktar yazılımı kullanarak sayılabilir.

Tek molekül floresan ın Situ hibridizasyon (SM-balık) kullanmak için fare yumurta miktarını ve Localize mRNA

Bu protokol, kemoterapötik tedaviden sonra alternatif birleştirme regülasyonunda karakteristik olmayan işleve sahip bir proteinin rolünü değerlendirmek için hızlı ve kullanışlı bir araç sunar.

mRNA Birleştirme Değişikliklerini incelemek için E1A Minigene Aracını Kullanma

Bu protokol, 5'-splice bölgesi mutasyonlarının birleştirme üzerindeki etkisini izlemek için bir minigene muhabiri testini açıklar ve mutasyona bağlı birleştirme inhibisyonunun kurtarılması için bastırıcı U1 snRNA geliştirir. Muhabir ve bastırıcı U1 snRNA yapıları HeLa hücrelerinde ifade edilir ve birleştirme astar uzantısı veya RT-PCR ile analiz edilir.

Birleştirme Verimliliğini İzlemek için Muhabir Tabanlı Hücresel Test

Bu protokol, fare üstün servikal ve yıldız gangliyonunun diseksiyonu, hücre ayrışması, kriyoprezervasyon, çekirdek izolasyonu ve hashtag barkodlaması dahil olmak üzere tek çekirdekli dizileme için ayrıntılı, düşük girişli numune hazırlığını açıklar.

Düşük Girişli Çekirdek İzolasyonu ve Tek Çekirdekli RNA Dizilimi için Fare Sempatik Ganglia'nın Barkodlu Antikorları ile Çoklama

Öğrenin, HeLa hücrelerinde mikroenjeksiyon kullanarak spliceosomal snRNA'ların Cajal cisimciklerine yerelleşme mekanizmalarını incelemeyi. Bu yöntem, RNA dizilerinin hücresel fonksiyonlardaki rolünü ortaya çıkarır.

Mikroenjeksiyon kullanarak ınsan hela hücrelerinde Spliceosomal snRNA yerelleştirme Analizi

Daha fazla video keşfet