Name: Fare kan trombosit arıtma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: Öğrenin fare kanından trombosit arıtma yöntemini, iohexol gradyan santrifüjasyonu ve akış sitometrisi analizi kullanarak. Bu protokol, trombosit biyolojisi ve aktivasyon çalışmaları için yüksek saflıkta örnekler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Cincinnati çocuk Araştırma Vakfı 'nın bir başlangıç finansmanı ve mına 'ya Cincinnati pilot translational Grant Üniversitesi tarafından destekleniyordu. Cincinnati çocuk hastanesi araştırma akışı sitometri Çekirdek Hizmetleri için teşekkür etmek istiyoruz.

Fare kan toplama uygun kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi onayı ile yapılmalıdır.
Not: Trombosit arıtma Protokolü Şekil 1' de bir akış diyagramında açıklanmıştır.
1. kan toplanması
<ol><li>Polipropilen tüpte bir anti-koagulant ve 0,4 mM GLY-Pro-arg-Pro (GPRP) olarak 25 μL 3,2% sodyum sitrat (pH 7,2) ekleyin.</li>
	<li>
C57BL/6 faresi ile Retro orbital kanama kullanarak yaklaşık 200 μL kan toplayın. Not: kan, Yaş veya cinsiyet ne olursa olsun fare gerinim herhangi bir türde toplanabilir.<ol>
<li>Fareyi anestezize etmek için her tür odada 2 mL ısofluran kullanın. Not: Anestezi derinliği, artan solunum belirtileri ile kontrol edilir ve hareket azalır. Fare, anestezi odasının hareketine veya ele alınması için yanıt vermemelidir. Fare hareket veya işleme yanıt ise, o zaman anestezi odasında tutmak için daha fazla zaman gerektirir.</li>
		<li>1.2.2 farenin sağ veya sol göz kapağı açın ve bir 7,5 cm (0,12 cm çap) kapiller tüp göz vasküler plekbe içine yerleştirin.</li>
		<li>Damarlarını kırmak ve kan akışını başlatmak için kapiller tüpüne basınç uygularken kapiller tüpünü bir buçuk dönüşte çevirin. Kapiller eylem ile doldurulacak toplama şişenin üzerinde baş aşağı hayvan tutun.</li>
		<li>Uygun kan hacmi toplanır sonra, kapiller tüp çıkarın ve gazlı bez ile göz kapağı üzerinde 30 s için hafif basınç uygulayarak göz kapatın. Kanama durdurulduktan sonra, fareyi kafesine dönün ve kanamayı izleyin.</li>
		<li>Eski orbital kanamadan sonra 1-2 gün travmaya göz atın. Prosedür ve ötenize bir sonucu olarak göz önemli travma belirtileri gösteren çalışmada herhangi bir fare çıkarın. Not: Fare, kan toplamadan önce en az iki hafta trombosit inhibe edebilir tedavi her türlü geçmesi gerekir. Kan örneği, fare kanama bir saat içinde trombosit arıtma için kullanılmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. trombosit arıtma
Not: Trombosit arıtma, bozulmalarını önlemek için oda sıcaklığında yapılmalıdır. Reaktiflerin ve araçların sıcaklığının 18 ila 22 °C arasında olduğundan emin olun. Trombosit bozulması önlemek için, hızlı pipetleme ve güçlü sallayarak prosedür sırasında kaçınılmalıdır.
<ol><li>Ekle 600 μL ıohexol degrade Orta (% 12 iohexol toz içinde 0,85% sodyum klorür, 5 mM Tricine, pH 7,2)11 içine bir 1,5 ml tüp.</li>
	<li>Kan ve iohexol orta karışmaz, böylece geniş bir pipet ucu ile degrade Orta üzerinde tüpün kenarına yavaşça aşağı yavaş kan örneği 200 μL ekleyin (Şekil 2a).</li>
	<li>Yavaş ivme ve yavaşlama ile sallanan kova rotor 20 °C 20 dk için 400 x g at tüp içeren örnek Santrifüjü.</li>
	<li>RBC ve WBC katmanlarını (Şekil 2B) rahatsız etmeden geniş bir pipet ucu kullanarak, trombosit açısından zengin tabakanın çoğunu ve trombosit yetersiz tabakasının küçük bir kısmını (Toplam 300 Ila 400 μL) toplayın. Trombosit örneğini yeni bir tüpe aktarın. Not: Trombosit sayısı kandaki daha az veya daha küçük bir kan hacmi kullanıldığında, trombosit açısından zengin tabaka ve trombosit-yoksul tabaka tek bir katman olarak görülebilir.</li>
	<li>Trombosit örneğine 1 mL PBS ekleyin, ters çevirerek karıştırın ve 800 x g 'lik bir sallanan kova rotorunda 20 °c ' de 10 dakika santrifüj yapın. Solüsyonu tamamen atın ve trombositlerin hafif pipetleme ile pelletini için 200 μL PBS ekleyin. Not: Gradyan orta ve Plazma proteinleri kaldırır ve trombositlerin Trombin gibi agonistleri duyarlılığı artırır Bu adım isteğe bağlıdır. Farklı santrifüjler farklı programlara sahip olduğundan, yavaş hızlanma/yavaşlama santrifüj kullanım kılavuzunu okuyarak tespit edilebilir.</li>
	<li>Bu numunenin 30 μL 'i trombositleri saymak için yeni bir tüpe aktarın. Kalan trombositler, trombosit aktivasyonu, toplama, granül salınımı vb. gibi biyokimyasal ve fizyolojik özetleri için kullanılabilir.</li>
	<li>RNA veya protein ekstraksiyon için, trombosit örneği 10 dakika için 800 x g 'de trombositler Pelet için santrifüjler. Süpernatant tamamen Pellet rahatsız etmeden atın. Trombositler Lyse RNA veya protein liziz tampon istenen hacmi ekleyin.</li>
</ol>3. trombosit sayma
<ol><li>Otomatik bir hücre analizörü kullanarak seyreltme ve arıtılmış trombositler (PBS ile 2 ila 5 kat seyreltilmiş) olmadan tüm kan hücrelerini saymak. Sayma için 30-50 μL örnekleri kullanın.</li>
	<li>Numunenin hacmine göre çarpılarak trombosit toplam sayısını hesaplayın.</li>
	<li>Arıtılmış trombositlerin verim/kurtarma yüzdesini hesaplayın.</li>
	<li>Saflaştırılmış trombosit örnekteki RBC ve WBC 'yi (50, PBS ile 100-katlamalı) hemokytometer ve mikroskop ile sayar.</li>
</ol>4. trombosit aktivasyonu
<ol><li>Bir tüpte, 100 μL 'ye kadar 1 ila 2.000.000 saflaştırılmış trombosit ekleyin (PBS,% 2 fetal sığır serumu, FBS).</li>
	<li>Birden fazla sayıda numune için, aşağıdaki 1 μL (0,5 mg/mL) ile antikorların bir Master karışımı yapmak: PE-Cy7 sıçan Anti-fare TER 119, PE sıçan Anti-fare CD45, FITC sıçan Anti-fare CD41, ve APC sıçan Anti-fare/insan CD62P (P-selectin) RBC algılamak için, WBC, trombosit, ve aktif trombosit, sırasıyla. Hücreleri boyama için tüplere ana karışımı ekleyin. Trombin eklemeyin.</li>
	<li>Başka bir tüpte, 100 μL boyama tamponu ve 0,4 mm gprp peptid gibi% 1 ' 2.000.000 e kadar saf trombosit ekleyin. Trombosit etkinleştirmek ve adım 4,2 aşağıdaki hücreleri leke Trombin ekleyin. Not: Trombosit aktivasyonu yoluyla toplu veya pıhtı oluşumunu önlemek için Trombin eklemeden önce numune için GPRP eklenmesi gerekir. Trombosit iyi aktivasyonu elde etmek için Trombin konsantrasyonu optimize edilmelidir. Trombosit aktivasyonu sonrasında, Akış sitometrisi ile numunelerin satın alınması sırasında olay sayımı azalır.</li>
	<li>Pozitif bir kontrol olarak, bir tüp ve 0,4 mM GPRP peptid 100 μL boyama tampon kadar tüm kan 1 μL ekleyin. Trombosit etkinleştirmek için Trombin ekleyin. Negatif kontrol olarak, 100 μL 'ye kadar tüm kan 1 μL 'i boyama tamponunu ekleyin. Negatif kontrol örneğinde Trombin eklemeyin. 4,2 adım aşağıdaki hücreleri leke.</li>
	<li>Akış sitometri izotip kontrolü için, etiket 5 tüpler ile lekelenmiş, PE-Cy7, PE, fitc, ve APC. Eklemek 100 μL boyama tampon, 1 μL kan, ve 1 μL ilgili antikor etiketli tüpler hücreleri leke.</li>
	<li>Karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika boyunca Lekelenmek için örnekleri inküye.</li>
	<li>Her tüp için 1 mL boyama tamponu ekleyerek örnekleri yıkayın. Oda sıcaklığında 5 dakika 800 x g Santrifüjü. Pellet dislodging olmadan dikkatle boyama tampon atın.</li>
	<li>Her tüp için 300 μL boyama tamponu ekleyin, hafif karıştırın ve bir FACS tüpüne aktarın. Bir akış cytometer ile analiz kadar karanlıkta lekeli örnekleri saklayın.</li>
</ol>5. trombositlerin akış Cytometri analizleri
<ol><li>
Yeni bir deneme oluşturun ve günlük ileri dağılım vs günlük yan dağılım nokta çizimleri oluşturmak ve Ter119 PE-Cy7 (RBC), CD45 PE (WBC), CD41 FITC (trombosit) ve CD62P APC (aktif trombositler) nüfusu için seçilen gating stratejisine göre kapılar atamak FACS DIVA yazılımında deney.
	<ol>
<li>Nüfus hiyerarşisi altında nüfus hiyerarşisini göster 'i seçerek popülasyon hiyerarşisini açın. gating stratejisini kontrol ederek ve kapıları düzgün şekilde yeniden adlandırarak nüfus hiyerarşisini düzenleyin.</li>
		<li>İstatistik görünümü Oluşturseçeneğini belirleyerek istatistik görünümünü açın. İstatistik görünümünü sağ tıklatarak ve Istatistik görünümünü düzenle'yi seçerek, istatistik görünümünü kullanıcı tercihlerine göre düzenleyin.</li>
		<li>Popülasyona karşılık gelen kutuya çift tıklayarak mizanpajın görsel yönünü geliştiren her kapı için bir renk seçin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cytometer penceresinde, Parametreler sekmesine tıklayın ve grafiklerde ilgi nüfusu görselleştirmek için parametreler için voltajları ayarlayın.</li>
	<li>Negatif nüfus pozitif nüfus ayırt edilebilir böylece her parametre için voltajları ayarlayın. Tazminat kontrolü için numuneleri kaydetmeden önce, tek lekeli pozitif kontrollerin ölçeklerde olduğunu kontrol edin (pozitif zirvelerin görünür olduğundan ve sağa çok uzak olmadığından emin olun). Not: Pozitif dorukların ölçeği kapalı ise, gerilimler pozitif nüfus görmek için ayarlanması gerekir.</li>
	<li>Tazminat kontrolleri için tek renkli lekeli hücreleri kaydedin (lekelenmiş, PE-Cy7, PE, FITC ve APC).</li>
	<li>Pozitif kontrol kapıları düzgün ayarlanmamış ise, voltajları değiştirerek bunları ayarlayın.</li>
	<li>Tazminatı hesapla &Gt; deneme &Gt; tazminat kurulumu'na gidin. Yalnızca elde edilen pencerede Uygula 'yı seçin.</li>
	<li>Çalışma sayfası penceresinin sol üst kısmındaki iki durumlu düğmeye tıklayarak genel çalışma sayfasına geçin.</li>
	<li>Pozitif kontrol örneği yükleyin ve tazminat ve kapıları ayarlamak için yeterli hücre elde.</li>
	<li>Örnek yeniden yükleyin ve her arsa flororokrom lekelenmiş antikor dayalı beklenen hücre popülasyon gösterir kontrol edin. Satın alma ve kayıt 100.000 tüm kan örnekleri için olaylar ve 10.000 saflaştırılmış trombosit için olaylar. Satın alma tamamlanıncaya kadar örnekleri birer birer yükleyin.</li>
	<li>Uygun grafiklerle ve kapılara sahip yazılım ile akış sitometri verilerini analiz edin (Şekil 3)</li>
</ol>

<ol><li>de Witt, S. M., Verdoold, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+platelet-based+control+of+coagulation%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Insights into platelet-based control of coagulation.</a> Thrombosis Research. 133, S139-S148 (2014).</li>
<li>Machlus, K. R., Thon, J. N., Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+the+developmental+dance+of+the+megakaryocyte%3A+a+review+of+the+cellular+and+molecular+processes+mediating+platelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Interpreting the developmental dance of the megakaryocyte: a review of the cellular and molecular processes mediating platelet formation.</a> British Journal of Haematology. 165 (2), 227-236 (2014).</li>
<li>Weyrich, A. S., Zimmerman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets%3A+signaling+cells+in+the+immune+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Platelets: signaling cells in the immune continuum.</a> Trends in Immunology. 25 (9), 489-495 (2004).</li>
<li>Nami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+platelets+and+PBMC%3A+New+evidence+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between platelets and PBMC: New evidence in wound healing.</a> Platelets. 27 (2), 143-148 (2016).</li>
<li>Mancuso, M. E., Santagostino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets%3A+much+more+than+bricks+in+a+breached+wall%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Platelets: much more than bricks in a breached wall.</a> British Journal of Haematology. 178 (2), 209-219 (2017).</li>
<li>Hampton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets%27+Role+in+Adaptive+Immunity+May+Contribute+to+Sepsis+and+Shock%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Platelets' Role in Adaptive Immunity May Contribute to Sepsis and Shock.</a> Journals of the American Medical Association. 319 (13), 1311-1312 (2018).</li>
<li>Sabrkhany, S., Griffioen, A. W., Oude Egbrink, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+blood+platelets+in+tumor+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Reviews+on+Cancer%22%5BJournal%5D)">The role of blood platelets in tumor angiogenesis.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1815 (2), 189-196 (2011).</li>
<li>Menter, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+%26%2334%3Bfirst+responders%26%2334%3B+in+wound+response%2C+cancer%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+and+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">Platelet &#34;first responders&#34; in wound response, cancer, and metastasis.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 36 (2), 199-213 (2017).</li>
<li>Fink, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+platelet-specific+mRNA+by+real-time+PCR+after+laser-assisted+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Characterization of platelet-specific mRNA by real-time PCR after laser-assisted microdissection.</a> Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 749-756 (2003).</li>
<li>Trichler, S. A., Bulla, S. C., Thomason, J., Lunsford, K. V., Bulla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-pure+platelet+isolation+from+canine+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Ultra-pure platelet isolation from canine whole blood.</a> BioMed Central Veterinary Research. 9, 144(2013).</li>
<li>Ford, T. C., Graham, J., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new%2C+rapid%2C+one-step+method+for+the+isolation+of+platelets+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">A new, rapid, one-step method for the isolation of platelets from human blood.</a> Clinica Chimica Acta. 192 (2), 115-119 (1990).</li>
<li>Noisakran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+bone+marrow+cells+by+dengue+virus+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematolology%22%5BJournal%5D)">Infection of bone marrow cells by dengue virus in vivo.</a> Experimental Hematolology. 40 (3), 250-259 (2012).</li>
<li>Rickwood, D., Ford, T., Graham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nycodenz%3A+a+new+nonionic+iodinated+gradient+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nycodenz: a new nonionic iodinated gradient medium.</a> Analytical Biochemistry. 123 (1), 23-31 (1982).</li>
<li>Graham, J. M., Ford, T., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+major+subcellular+organelles+from+mouse+liver+using+Nycodenz+gradients+without+the+use+of+an+ultracentrifuge%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of the major subcellular organelles from mouse liver using Nycodenz gradients without the use of an ultracentrifuge.</a> Analytical Biochemistry. 187 (2), 318-323 (1990).</li>
<li>Milligan, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lethal+model+of+disseminated+dengue+virus+type+1+infection+in+AG129+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">A lethal model of disseminated dengue virus type 1 infection in AG129 mice.</a> Journal of General Virology. 98 (10), 2507-2519 (2017).</li>
<li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+gene+rescue+of+a+Bernard-Soulier+mouse+model+to+study+platelet+glycoprotein+Ibbeta+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Lentiviral gene rescue of a Bernard-Soulier mouse model to study platelet glycoprotein Ibbeta function.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (7), 1470-1479 (2016).</li>
<li>Bergmeier, W., Boulaftali, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+method+to+study+platelet+function+in+mouse+models+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer method to study platelet function in mouse models of disease.</a> Thrombosis Research. 133, S3-S5 (2014).</li>
<li>Bakchoul, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+use+of+the+non-obese+diabetic%2Fsevere+combined+immunodeficiency+mouse+model+in+autoimmune+and+drug-induced+thrombocytopenia%3A+communication+from+the+SSC+of+the+ISTH%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the use of the non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency mouse model in autoimmune and drug-induced thrombocytopenia: communication from the SSC of the ISTH.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (5), 872-875 (2015).</li>
<li>Aurbach, K., Spindler, M., Haining, E. J., Bender, M., Pleines, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+collection%2C+platelet+isolation+and+measurement+of+platelet+count+and+size+in+mice-a+practical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Blood collection, platelet isolation and measurement of platelet count and size in mice-a practical guide.</a> Platelets. , 1-10 (2018).</li>
<li>Jirouskova, M., Shet, A. S., Johnson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+murine+platelet+structure%2C+function%2C+assays%2C+and+genetic+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">A guide to murine platelet structure, function, assays, and genetic alterations.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), 661-669 (2007).</li>
<li>Birschmann, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+functional+highly+purified+human+platelets+for+the+identification+of+new+proteins+of+the+IPP+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Use of functional highly purified human platelets for the identification of new proteins of the IPP signaling pathway.</a> Thrombosis Research. 122 (1), 59-68 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar hiç bir ilgi çatışması bildirmiyor.

Yaygın olarak, trombositler düşük hızlı santrifüjleme ile yalıtılır, bu da önemli sayıda kan hücresi içeren trombosit açısından zengin plazma verir, hücresel enkaz ve biyokimyasal ve fizyolojik tespit ve ihtiyaçlara engel olabilecek Plazma proteinleri daha fazla arıtma21. Bu nedenle, büyük kirleticiler olmadan saf trombosit verebilecek hızlı ve basit bir yöntem kullanmak önemlidir. Burada sunulan protokol, düşük hızlı santrifüjleme ile degrade bir ortam kullanarak fare kanından trombositlerin arıt...

Trombosit kan damarında hasar yanıt olarak kan pıhtılaşma bir başlatıcı olarak işlev kan bileşenidir. Onlar damar duvarı1takmak için yaralanma sitede toplamak. Trombosit, thrombopoetin etkisi altında kemik iliği megakaryanositlerden elde edilen Sitoplazmanın anucleate parçaları ve dolaşım2girin. Onlar metabolik olarak aktif olarak kabul edilir ve hücre içi sinyal şelaleler aktive ederek, trombosit yayma, toplama, ve hemostatik fiş oluşumu ile sonuçlanması ile hücreli dışı çevre algılama yeteneğine1,3. Hemostaz/tromboz ve yara iyileşmesi4' ün yanı sıra trombositler ana inflamatuar tepkiler, anjiyogenezi ve metastis3,5,6,7' de önemli bir rol oynamaktadır. 8' den itibaren.
Trombositler, diğer kan bileşenlerinden özgür olması gereken biyokimyasal ve fizyolojik özelliklerini incelemek için kandan arındırılır. Kırmızı kan hücreleri (RBC) ve beyaz kan hücreleri (WBC), trombositlerden9,10' a göre önemli ölçüde daha fazla RNA ve protein içerdiğinden, bu hücrelerin az sayıda varlığı bile RNA 'nın transcriptomik ve proteomik analizlerine engel olabilir ve proteinler trombositlerden türetilmiştir. Anti-GPIIb/ııia (JON/A) ve anti-P-selectin gibi Trombin bağlama antikor ile aktif olan trombositlerin tüm kan trombositinden daha verimli bir şekilde etkinleştirildiği tespit edilmiştir.
Trombosit kırılgan olduğundan, örnekleri mümkün olduğunca hafif tedavi etmek önemlidir. Trombosit aktifleşirse, granül içeriklerini serbest bırakıyorlar ve sonunda zayıflatır. Bu nedenle, trombositlerin fonksiyonel özelliklerini bozulmamış tutmak için yalıtım sırasında trombosit sessizliği korumak önemlidir. Birçok protokol, trombositlerin insan, köpek, sıçan ve insan dışı primat ile çeşitli yöntemlerle yalıtımını1,10,11,12olarak tanımlıyor. Yöntemlerden bazıları, santrifüjleme ile trombosit açısından zengin plazma toplanması, ayırma sütununa göre filtrasyon, RBC ile trombositlerin negatif seçimi ve manyetik boncuklara konjuk edilen WBC 'ye özgü antikor gibi birden fazla adımı gerektirir, ve benzeri, zaman alıcı ve trombositler ve bunların içeriğini düşürebilir.
Ford ve meslektaşları iohexol orta11kullanarak insan kanından trombosit arıtma nitelendirdi. Bu yöntem, arıtma sırasında benzer bir hacim kan örneği ve orta kullanır. İnsanlar kan daha yüksek bir hacim verim beri, nispeten trombosit arındırmak kolaydır.
Iohexol, su içinde serbestçe çözünür ve nüklerik asitler, proteinler, polisakkaritler ve nükroproteinler13,14kesitte kullanılan evrensel yoğunluklu gradyan inert bir ortamdır. Bu düşük osmolalitesi vardır ve toksik olmayan, böylece bozulmamış yaşam hücrelerinin arıtma için ideal bir orta yapma11. Bu bir partikül olmayan ortamdır; Bu nedenle, bir degradedeki hücrelerin dağılımı hemocytometer, Flow cytometer veya spektrofotometre kullanılarak belirlenebilir. Seyreltme işleminden sonra hücrelerin veya hücresel parçaların enzimatik veya kimyasal reaksiyonunun çoğunu engellemez.
Fare birçok insan hastalıkları için önemli bir hayvan modeli olarak hizmet vermektedir15,16,17,18. Fare trombositlerin arıtma açıklayan birkaç Yayınlanan Makaleler vardır19,20. Ancak, fare kan nispeten daha küçük bir hacim verir, bu da zor trombosit arındırmak için yapar. Aynı küçük hacim gradyan orta ve kan numuneleri kullanılırsa, trombosit tabakası Santrifüjden sonra RBC-WBC tabakasından açıkça ayrılamaz. Bu yazıda, kan numunesi hacmi ve düşük hızlı santrifüjleme göreli olarak üç kat daha iohexol degrade orta ile fare trombosit arıtma hızlı ve basit bir yöntem tarif ettik. Ayrıca, arıtılmış trombositleri Trombin ile aktive ettik ve kalitesini akış sitometri ve mikroskobik ile araştırdık.

<table><tbody><tr><td>APC sıçan anti-fare / insan CD62P (P-selektin)</td> <td>Termoscientific</td><td>17-0626-82</td><td>Trombosit aktivasyon belirteci</td></tr><tr><td>Eppendorf tüpü</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-166</td><td>Kırkayak için tüp</td></tr><tr><td>FACS DIVA yazılımı</td><td>BD Biosciences Katalog</td><td>dışı ürün</td><td>Trombositlerin ve tam kanın analizi</td></tr><tr><td>FACS tüpü</td><td>Fisher Scientific</td><td>352008</td><td>Akış için tüpler sitomteri</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>İnvitrojen</td><td>26140079</td><td>Boyama tamponu için bileşen</td></tr><tr><td>FITC sıçan anti-fare CD41</td><td>BD Biosciences</td><td>553848</td><td>Trombosit işaretleyici</td></tr><tr><td>Akış sitometresi</td><td>BD Biosciences</td><td>Katalog dışı öğe</td><td>Trombositlerin ve tam kanın analizi</td></tr><tr><td>FlowJo yazılımı</td><td>FlowJo, Inc.</td><td>Katalog dışı ürün</td><td>Trombositlerin ve tam kanın analizi</td></tr><tr><td>Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP)</td><td>EMD Millipore</td><td>03-34-0001</td><td>Trombosit pıhtı oluşumunu önleyin</td></tr><tr><td>Hematokrit Kılcal tüp</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-362566</td><td>Kan alma kılcal boru</td></tr><tr><td>Hemavet</td><td>Drew Scientific Katalog</td><td>dışı öğe</td><td>Kan hücresi analizörü</td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td>Hücre sayma odası</td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>Baxter</td><td>1001936040</td> Fare Mikroskobunu <td>Uyuşturmak İçin Kullanım</td></tr><tr><td>(Olympus CKX41)</td><td>Olympus</td><td>Katalog dışı öğe</td><td>Hücre izleme ve sayma</td></tr><tr><td>Nycodenz (Histodenz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2158</td><td>Gradyan orta</td></tr><tr><td>PE sıçan anti-fare CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>561087</td><td>WBC işaretleyici</td></tr><tr><td>PE-Cy7 sıçan fare önleyici TER 119</td><td>BD Biosciences</td><td>557853</td><td>RBC işaretleyici</td></tr><tr><td>Pipet uçları 200 ve mikro; L, geniş çaplı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21-236-1A</td><td>Kan ve trombosit örneklerinin aktarılması</td></tr><tr><td>Pipet uçları 1000 ve mikro; L, geniş çaplı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21-236-2C</td><td>Kan ve trombosit örneklerinin aktarılması</td></tr><tr><td>Fosfat buffured salin (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14040-117</td><td>Yıkama ve seyreltme için tampon</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Fizyolojik tuzlu</td></tr><tr><td>su Sodyum sitrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-688-26</td><td>Anti-koagülan</td></tr><tr><td>Boyama tamponu</td><td>Kurum içi</td><td>Katalog dışı ürün</td><td>Yıkama ve seyreltme tamponu</td></tr><tr><td>Stel su</td><td>Kurum içi</td><td>Katalog dışı ürün</td><td>Çözücü</td></tr><tr><td>Masa üstü santrifüj</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75253839/433607</td><td>Sallanan kova rotorlu santrifüj</td></tr><tr><td>Trombin</td><td>Enzim Araştırma Laboratuvarı</td><td>HT 1002a</td><td>Trombosit aktivasyon agonisti</td></tr><tr><td>Trisin</td><td>Nycodenz ortamı için Sigma-Aldrich</td><td>T0377</td><td>Tampon</td></tr></tbody></table>

fare kan trombosit arıtma

Purification of Platelets from Mouse Blood

Trombositler, kırmızı kan hücrelerinden (RBC), beyaz kan hücrelerinden (WBC) ve plazma proteinlerinin serbest olması gereken fonksiyonel özelliklerini incelemek için bütün kandan arındırılır. Burada, 20 °C ' de 20 dakika için 400 x g 'de bir sallanan kova rotorunda kan numunesi hacmine ve santrifüje göre üç kat daha fazla iohexol degrade orta kullanarak fare kanından trombositlerin arıtılmasını tarif ediyoruz. Arıtılmış trombositlerin iyileşme/verimi% 18,2-38,5 idi ve saf trombositler, önemli sayıda RBC ve WBC içermeyen bir dinlenme durumudur. Trombin ile tedavi edilen arıtılmış trombositler,% 93 ' e kadar harekete geçirmek için ortaya çıktı. Biz arıtılmış trombositlerin akış cytometrik ve mikroskobik değerlendirme kullanarak yeterince saf olduğunu doğruladı. Bu trombositler gen ifadesi, aktivasyon, granül salınımı, toplama ve yapışma uygulamaları için kullanılabilir. Bu yöntem, diğer türlerin kanından trombositlerin arıtılması için de kullanılabilir.

Trombosit arıtma Özeti bir akış diyagramında açıklanmıştır (Şekil 1). Adımlar bir antikoagülan varlığında Retro-orbital kanama kullanarak fare kan toplama, iohexol degrade orta üzerine kan numunesi eklenmesi, 400 x g bir sallanan kova rotorda santrifüjleme 20 ° at için 20 dakika içinde içerir. Arıtılmış trombositlerin kalitesi, herhangi bir kontamine hücre ve aktif trombositler tespit etmek için antikor ile boyama sonrası mikroskopiye ve Akış sitometrisi ile değerlendirildi.
<p ...

Burada, fare kanı bir anti-koagulan varlığında toplandı. Trombositler, düşük hızlı santrifüjleme kullanılarak iohexol degrade orta tarafından arındırıldı. Trombositler uygulanabilir olup olmadığını araştırmak için Trombin ile aktive edildi. Arıtılmış trombositlerin kalitesi akış sitometri ve mikroskobu ile incelendi.

Fare kan trombosit arıtma

Platelets are purified from whole blood to study their functional properties, which should be free from red blood cells (RBC), white blood cells (WBC), ...

Trombositler biyokimyasal ve fizyolojik özellikleri incelenirken kan hücrelerinden ve proteinlerden arındırılmalıdır. Bu nedenle trombositleri fare kanından arındırmak için bir protokol geliştirdik. Bu teknik, trombositlerin iohexol gradyan orta ve düşük hızlı santrifüj kullanarak arındırılması, trombositlerin diğer kan bileşenlerinden net bir şekilde ayrılmasıile sonuçlanabilir.Trombositleri arındırmak için, 200 mikrolitre taze hasat edilmiş tam kanın 1,5 mililitrelik bir tüpün kenarına, karıştırmadan 600 mikrolitre iohexol gradyan ortama yavaşça inmekten oluşan geniş delikli pipet ucu kullanın. Trombositleri izole etmek için sallanan kova rotorunda santrifüjden sonra, trombosit açısından zengin tabakanın çoğunu ve trombosit fakiri tabakasının küçük bir kısmını beyaz kan hücresi veya kırmızı kan hücresi tabakasını beslemeden toplamak için yeni bir geniş delikli pipet ucu kullanın. Trombosit örneğini yeni bir tüpe ekleyin ve trombositlere bir mililitre PBS ekleyin.Başka bir santrifüj gerçekleştirmeden önce trombositleri ters çevrilerek karıştırın. Daha sonra hafif pipetleme ile PBS 200 mikrolitre pelet resuspend. Trombosit aktivasyonu için, 100 mikrolitre boyama tamponu içeren yeni bir tüpe altı trombosite 1-2 kez 10 aktarın.0.4-milimolar GPRP peptid ile desteklenen boyama tampon 100 mikrolitre içeren farklı bir tüp için altı trombosit ler için bir ila iki kez 10 ekleyin. Trombositleri etkinleştirmek için GPRP peptid ile tüpe trombin ekleyin ve her iki tüpe de antikor kokteyli ekleyin. Pozitif kontrol olarak, 0.4-milimolar GPRP peptid içeren bir tüp boyama tampon 100 mikrolitre ye kadar tam kan bir mikrolitre ekleyin ve bu trombositleri etkinleştirmek için trombin ekleyin.Negatif kontrol olarak, 100 mikrolitreye kadar boyama tamponuna bir mikrolitre tam kan ekleyin. Sonra antikor kokteyli ile her iki kontrol tüpleri leke. Karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika sonra, tüp başına taze boyama tampon bir mililitre ile örnekleri yıkayın.300 mikrolitre taze boyama tamponundaki peletleri yeniden askıya alın. Daha sonra hücre örneklerini ışıktan korunan bireysel akış sitometri analiz tüplerine aktarın. Akış sitometrisi tarafından trombositanaliz etmek için, yeni bir deney oluşturmak ve logaritmik yan dağılım nokta çizimleri karşı logaritmik ileri dağılım oluşturmak.Voltajları gerektiği gibi ayarladıktan sonra, tek renkli lekeli hücreleri telafi kontrolleri için kaydedin. Şimdi tazminat ve kapıları ayarlamak için yeterli hücreleri elde etmek için pozitif kontrol örneği çalıştırın. Daha sonra her tam kan örneği için 100.000 olay elde edin ve kaydedin ve uygun çizim ve kapıları kullanarak akış sitometri verilerini analiz edin.Kan yavaş yavaş orta üzerine eklenirse, iohexol gradyan orta ve kan örneği tüp iki ayrı tabaka oluşturacaktır. Santrifüjden sonra, üst, saman renkli tabaka plazma içerir ama bozulmamış kan hücreleri. İkinci, beyazımsı, trombosit açısından zengin tabaka trombositlerin çoğunluğunu içerir.Üçüncü, şeffaf tabaka trombosit-zayıf tabaka ve doğrudan kırmızı kan hücresi ve beyaz kan hücresi pelet üzerindedir. Tam kan kırmızı kan hücreleri, beyaz kan hücreleri ve yan dağılım nokta arsa karşı bir logaritmik ileri dağılım trombositler farklı popülasyonları sergiler. Saflaştırılmış trombositler, ancak, kırmızı veya beyaz kan hücrelerinin ihmal edilebilir sayıda ayrı bir nüfus göstermektedir.Tam kan örnekleri Ter119 pozitif kırmızı kan hücresi ve SAFlaştırılmış trombosit örneklerinde neredeyse bulunmayan CD45 pozitif beyaz kan hücresi popülasyonları içerir. İşlenmemiş saflaştırılmış trombositler istirahat durumlarını doğrulayan neredeyse hiç aktivasyon belirteci göstermezken, saflaştırılmış trombin ile tedavi edilen trombositler tipik olarak %71 P-selectin ekspresyonu gösterir. İşlenmemiş saflaştırılmış trombosit örneklerinin mikroskobik değerlendirilmesi trombosit agregasyonu olmadığını ortaya koymaktadır.Ancak trombositile aktivasyondan sonra trombositler sağlam bir toplama gösterirler ve arınma sonrası canlılıklarını doğrularlar. Katman iohexol orta üzerine dikkatle kan örneği, ve trombosit toplarken, başarılı trombosit arınması için kırmızı kan hücresi ve beyaz kan hücresi katmanları toplamak değil gibi dikkatle aspire emin olun. Bu yöntem diğer türlerden trombosit arınması için de kullanılabilir.Saflaştırılmış trombositler gen ekspresyonu, aktivasyon, agregasyon, granül salınımı ve yapışma çalışmaları için kullanılabilir.

purification-of-platelets-from-mouse-blood

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, megakaryositlerin farklılaşması ve trombosit oluşumu için bir teknik göstermektedir. İnsan göbek kordonu kanından izole edilen hematopoietik kök progenitör hücreler, trombopoietin varlığında olgun megakaryositlere farklılaşır. Olgun megakaryositler, tek tek trombositlere yol açan proplateletler adı verilen sitoplazmik uzantılar üretir.

Megakaryositlerin Farklılaşması ve Trombosit Oluşumu için İn Vitro Yöntem

Bu videoda, murin tam kanından trombositlerin saflaştırılması ve ardından trombosit agonisti trombin ile aktivasyonu için bir protokol açıklanmaktadır. Akış sitometrisi ile analiz edildiğinde, saflaştırılmış dinlenme trombositleri, hücre yüzeyi markörü CD41'in ekspresyonuna dayalı olarak karakterize edilirken, saflaştırılmış aktive edilmiş trombositler, hem yüzey markörleri CD41 hem de CD62P'yi birlikte eksprese eder.

Murin Tam Kanından Trombositlerin Saflaştırılması ve Aktivasyonu

Bu videoda, süreksiz sükroz gradyan santrifüjleme ile tümör taşıyan bir farenin kanından sitotoksik yüksek yoğunluklu nötrofillerin ve düşük yoğunluklu nötrofillerin izolasyonunu gösteriyoruz.

Tümörlü Fare Kanından Sitotoksik Nötrofillerin İzolasyonu

Kan lökositleri ve trombosit bireyin genel bioenergetic sağlığının bir belirteci olarak kullanılır ve bu nedenle patolojik süreçlerin ve tedavilerin etkisini izlemek için bir potansiyele sahip olabilir. Burada mitokondriyal fonksiyonu ve bu hücrelerde oksidatif patlama izole etmek ve ölçmek için bir yöntem tarif eder.

İnsan lökosit ve trombosit İzolasyonu ve Değerlendirme Protokolleri: Biyoenerji ve Oksidatif Burst

Megakaryocytes son derece saf bir nüfusa kablosunu elde edilebilir kan kaynaklı CD34+ hücreleri. CD34 için bir yöntem+ hücre izolasyon ve megakaryocyte farklılaşması burada açıklanmıştır.

Kordon kan kaynaklı CD34 megakaryocyte farklılaşma ve trombosit oluşumu insan+ hücreleri

Lökosit heyecanla damar hücreleri ve trombositlerin damar duvar yaralanma sonra veya enflamasyon sırasında etkileşim. Burada, lökosit ve hücresel eşleri arasındaki etkileşimler altında yatan moleküler mekanizmaları karakterize etmek için basit bir laminar akış tabanlı tahlil açıklayın.

Lökosit işe kültürlü damar hücreleri ve yapışık trombositler üzerinde araştırmak için Laminar akış tabanlı deneyleri

Burada sunulan peptid CD47 (pepCD47) polibisfosfonat kimya kullanarak metal stentler için ekiçin bir protokoldür. PepCD47 kullanarak metal stentlerin fonksiyonelleştirilmesi inflamatuar hücrelerin bağlanmasını ve aktivasyonunu önler ve böylece biyouyumluluğunu artırır.

CD47-Türetilmiş Peptid İmmobilizasyonu Ile Metal İmplantlara Kan Yoluyla Bulaşan Hücre Bağlılığının Azaltılması

Bu yöntem, MEP ve MKp'nin fare femurları, kaval kemiği ve pelvik kemiklerden akış sitometrisi ile saflaştırılmasını açıklar.

Fare Megakaryosit Progenitors İzolasyonu

Bu protokol, lökofilter türevi CD34+ hematopoetik progenitörlerin elde edilmesi ve bunların kültür ortamında trombositleri serbest bırakabilen proplatelet taşıyan megakaryositlere in vitro farklılaşması ve olgunlaşması ile ilgili tüm adımları ayrıntılı olarak açıklar. Bu prosedür, megakaryopoezleri kontrol eden hücresel ve moleküler mekanizmaların derinlemesine analizi için yararlıdır.

Megakaryosit Farklılaşması ve Trombosit Oluşumunu İncelemek için Hücre Kaynağı Olarak Leukodepletion Filtreleri-Türetilmiş CD34+ Hücreler

Prokoagülan trombosit oluşumu, artmış tromboz riski ile ilişkilendirilmiştir. Burada, prokoagülan trombositlerin ayırt edici özellikleri olan fosfatidilserin ve mikrovezikül salınımının maruziyetini ölçmeyi amaçlayan, yıkanmış trombositleri insan kanından izole etmek için kesin bir protokol sunulmaktadır.

İnsan Saflaştırılmış Trombositlerinden Fosfatidilserin Maruziyeti ve Mikrovezikül Salınımının Ölçülmesiyle Prokoagülan Trombosit Karakterizasyonu

Trombosit metabolizması, özellikle kanama ve trombotik bozukluklarda trombosit hiper ve hipoaktivitesinin rolü ile ilgili olduğu için ilgi çekicidir. Bazı metabolik tahliller için trombositlerin plazmadan izole edilmesi gereklidir; Burada sunulan, yıkanmış trombositlerden hücre içi metabolitlerin izole edilmesi için bir yöntemdir.

Kantitatif metabolik akı çalışmaları için yıkanmış insan trombositlerinin hazırlanması

Öğrenin fare kanından trombosit arıtma yöntemini, iohexol gradyan santrifüjasyonu ve akış sitometrisi analizi kullanarak. Bu protokol, trombosit biyolojisi ve aktivasyon çalışmaları için yüksek saflıkta örnekler sağlar.

Fare kan trombosit arıtma

Daha fazla video keşfet