Name: Streptococcus mutanslarda Yüksek Moleküler Kütle Proteininin Saflaştırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Öğrenin Streptococcus mutans'ta yüksek moleküler kütleli membran proteinlerinin saflaştırılması için PCR tabanlı bu etkili yöntemi. Bu teknik diğer bakteri türlerine de uyarlanabilir ve mikrobiyoloji araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Japonya Bilimi Destekleme Derneği (JSPS) (16K15860 ve 19K10471 ile T. M., 17K12032 to M. I., ve 18K09926 to N. H.) ve SECOM Bilim ve Teknoloji Vakfı (SECOM) (sayı hibe 2018.09.10 No. 10 10) tarafından desteklenmiştir.

1. Astar tasarımı
<ol><li>
S. mutans His-gtfCinşaatı için astar hazırlayın. NOT: Bu protokolde kullanılan astar dizileri Tablo 1'degösterilmiştir. S. mutans Üretimi için iki aşamalı füzyon PCR yöntemiHis-gtfC şematik Şekil 2'degösterilmiştir.<ol>
<li>Tasarım astarları (gtfC-ters ve spcr-ileri) His-tag kodlama dizisinin eki için, gtfC geni ve spcr (Şekil 2A)arasında müdahale.<ol>
<li>GS bağlantı ve His-tag-kodlama dizisini gtfC-reverse ve spcr-forward astarlarına ekleyin, 5' bölgelerdeki 24 taban birbirini tamamlayıcı dır. NOT: GS bağlayıcısı ve Onun-tag amino asit dizisi (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-His-His-His-His-His) gen çevirisi yoluyla GTF-SI C-terminus bağlı.</li>
			<li>S. mutans WT genomunda gtfC genini hedeflemek için gtfC-ileri astar tasarla >1 kb genin aşağı akışı ve spcr-ters astar, spc r'nin aşağı yakan bölgesini hedeflemek için S. mutans içinde •gtfC. GTFC -forwardve spcr-reverse astarların erimesıcaklığını gtfC-ters ve spcrerime sıcaklıklarıile eşleşecek şekilde ayarlayın - ileri astarlar, sırasıyla.</li>
		</ol>
</li>
		<li>İkinci PCR(Şekil 2B)için iç içe astar (iç içe dönük ve iç içe dönük-ters) tasarla.</li>
		<li>Transformantın genomik DNA'sına özgü tasarım astarları(gtfC-ileri ve koloni-ters)(Şekil 2C; koloni PCR için astarlar kullanılır). NOT: Amplicons gtfC ve spcrarasındaki sınır straddle . GTFC-forwardastarı ileri astar olarak uygulanabilir.</li>
		<li>S. mutans His-gtfC (Şekil 2C;astarlar tarafından amplifiye PCR ürün DNA dizileme için kullanılır) üretimi son onay için tasarım astar (yukarı-ileri ve aşağı-ters).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. S. mutanlardan genomik DNA Çıkarma
NOT: Her S. mutans suşu anaerobik koşullarda 37 °C'de beyin kalp infüzyonu (BHI) orta kültüre olmalıdır. S. mutanların mutant suşları •gtfC ve S. mutans His-gtfC BHI 100 μg/mL spectinomycin ile desteklenmektedir. 
<ol><li>Streak S. mutans WT ve S. mutans •gtfC ayrı ayrı BHI agar plakaları her üzerine. 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>S. mutans WT veya S. mutans • sterilize kürdan kullanarakgtfC tek kolonileri seçin ve BHI suyu 1,5 mL içine aşılamak. 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın. NOT: Koloniler ilk PCR için şablon DNA kaynağı olarak kullanılabilir (adım 3.1).</li>
	<li>Her bakteri kültürünün 1 mL'sini 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın. 15.000 x g1 dakika için kültür santrifüj .</li>
	<li>Süpernatant çıkarın ve hücre pelet yeniden askıya almak için Tris-EDTA tampon (pH 8.0) 1 mL ekleyin.</li>
	<li>15.000 x g1 dakika için süspansiyon santrifüj . Supernatant çıkarın. Hücre peletini 50 μL Tris-EDTA tamponunda (pH 8.0) yeniden askıya alın.</li>
	<li>Süspansiyonu blok kuvöz kullanarak 95 °C'de 5 dakika ısıtın. Santrifüj süspansiyon için 5 dakika 15.000 x g.</li>
	<li>Supernatant'ı yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın (supernatant ilk PCR için şablon DNA olarak hizmet verecektir).</li>
</ol>3. PCR Amplifikasyon
NOT: Tablo 1, Tablo 2ve Tablo 3, sırasıyla PCR astarlarını, reaktifleri ve amplifikasyon döngülerini özetler.
<ol><li>PCR şablonları olarak S. mutanve S. mutans •gtfC genomu kullanarak ilk PCR'yi gerçekleştirin. GTFC geninin aşağı kısmını barındıran bölgeleri ve adım 1.1.1.2'de tanımlanan astarları kullanarak spcr'yi barındıran bölgeleri güçlendirin(Şekil 2A).</li>
	<li>Her PCR ürününü %1 agarose jel üzerinde elektrofore edin. Yaklaşık 1.000 bp ve 2.000 bp. Silika membran bazlı jel çıkarma yöntemi kullanarak jellerden parçaları arındırmak için istenilen DNA parçaları excise. NOT: PCR9,DNA jel elektroforezi10ve DNA arınması11 için temel prosedürler başka bir yerde ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.</li>
	<li>İç içe ve iç içe dönük astarlarla PCR şablonları olarak ilk PCR (yaklaşık equimolar) ürünlerini kullanarak ikinci bir PCR gerçekleştirin(Şekil 2B).</li>
	<li>Agarose jel üzerinde PCR karışımının onda biri elektrofore. Yaklaşık 3.000 bp uygun amplicon üretimi onaylayın.</li>
	<li>
Kalan PCR ürüne çökeltin. NOT: İkinci PCR tarafından üretilen spesifik olmayan amplikonlar homolog rekombinasyona müdahale etmediğinden, PCR ürününün saflaştırılması gerekli değildir.<ol>
<li>PCR karışımına çekirdeksiz su ekleyin ve toplam hacmi 100°L'ye getirin ve ardından 0,1 hacim (10°L) 3 M sodyum asetat (pH 5,2) ve 2,5 hacim (250°L) mutlak etanol ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca karıştırın ve saklayın.</li>
		<li>Numuneyi 4 °C'de 15.000 x g'de 20 dk santrifüj edin. Supernatant atın. DNA peletini yıkamak için %70 etanol1 mL ekleyin.</li>
		<li>Numuneyi 4 °C'de 15.000 x g'de 5 dk santrifüj edin. Supernatant atın. Hava kuruve 10 μL nükleaz içermeyen su ile DNA pelet eritin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Hücre Dönüşümü
<ol><li>Önceki yayında açıklanan adımları izleyerek ikinci PCR ürün tanıtmak için yetkili S. mutans WT hazırlayın5. Hücreleri -80 °C'de saklayın. NOT: Bu deney için, yetkin S. mutans WT hücreleri zaten -80 °C'de S. mutans oluşturmakiçin korunmuştur .</li>
	<li>Konsantre ikinci PCR ürününün 5 μL'sini daha önce dondurulmuş buz gibi donmuş 50 μL'lik buz gibi yetkin hücrelerle karıştırın. Elektroporasyon cuvettes içine karışımı ekleyin. Elektroporasyon cihazını kullanarak hücrelere tek bir elektrik darbesi (1,8 kV, 2,5 ms, 600 Ω, 10 μF) verin.</li>
	<li>BHI suyu 500 μL hücreleri resuspend. Hemen, spektinomisin içeren BHI agar plakaları üzerine süspansiyon 10-100 μL yayıldı. 37 °C'de 2-6 gün boyunca kolonyalar alınacak kadar büyüyüp, 2-6 gün kuluçkaya yatırın.</li>
</ol>5. Genome Rekombinasyon ve Depolama Doğrulama
<ol><li>Rekombinasyon için ekrangtfC ileri ve koloni-ters astar kullanarak koloni PCR gerçekleştirin. Elektroforse bir agarose jel üzerinde her koloni PCR ürün. Yaklaşık 1500 bp'lik DNA parçasını doğrulayın.</li>
	<li>Bir steril kürdan ve subculture kullanarak pozitif kolonilerden birini seçin bhi brop spectinomycin içeren 2 mL bir gecede hücreleri.</li>
	<li>0,8 mL bakteri kültürünü 0,8 mL steril %50 gliserol ve -80 °C veya -20 °C'de stokla karıştırın.</li>
	<li>Kalan 1 mL hücre süspansiyonunu 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın. Genomik DNA'yı hücrelerden çıkarmak için 2.3-2.7 adımlarını tekrarlayın.</li>
	<li>Bir şablon olarak ileri ve aşağı-ters astarlar ve genomik DNA kullanarak PCR gerçekleştirin. Güçlendirilmiş DNA ürününü jellerden arındırmak için 3.2 adımını tekrarlayın.</li>
	<li>Saflaştırılmış amplikontenin DNA dizilimini DNA dizilimi ile belirleyin. NOT: S. mutans His-gtfC'nin neslini DNA dizilimi ile doğruladıklarından emin olun.</li>
</ol>6. Polihistidin arınması-etiketli GTF-SI
<ol><li>Streak S. bir spectinomycin içeren BHI agar plaka üzerineHis-gtfC mutans. 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>BHI suyu 3 mL sterilize kürdan ve alt kültür hücreleri kullanarak tek bir koloni pick up. Bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Spectinomycin olmadan BHI suyu 1 L ile iki konik şişeleri hazırlayın. BHI suyu 1 L içine gece kültürü süspansiyon 1 mL aşılamak. Bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Amonyum sülfat çökelti ile kültür supernatant konsantre proteinler. NOT: Hedef protein hücre içi ise hücre cisimlerinden ayıklayın. Amonyum sülfat çökeltisi için temel prosedürler başka bir yerdeayrıntılı 12.<ol>
<li>4 °C'de 10.000 x g'de 20 dk için bakteri kültürü süspansiyonuna santrifüj edin. 3 L cam bir kabın içine kültür supernatant kurtarın.</li>
		<li>1.122 g amonyum sülfat ekleyin 2 L supernatant (80% doygunluk) bir manyetik karıştırıcı kullanarak güçlü karıştırma ile. Çökeltinin 4 °C'de 4 saat veya daha fazla süreyle karıştırılarak oluşmasına izin verin. NOT: Çökelti oluşumu bir gecede devam edilebilir.</li>
		<li>4 °C'de 20 dk için 15.000 x g amonyum sülfat çökelmiş çözeltiyi santrifüj edin. Süpernatant'ı decant.</li>
		<li>Bir spatula ile çökelti toplamak ve 200 mL cam kabıiçine aktarın. Bağlayıcı tamponun 35 mL'lik peletlerini yeniden askıya alın (50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl, 5 mM imidazol, pH 8.0).</li>
		<li>4 °C'de, yeniden üretilen selüloz diyaliz tüpü kullanılarak bağlayıcı tamponun 2.500 mL'lik süspansiyonu karıştırarak diyalize karşı diyalize titretin. 2 saat sonra diyaliz solüsyonu değiştirin ve bir gecede diyalize devam edin.</li>
		<li>Diyaliz solüsyonunu tekrar değiştirin. Ek bir 2 saat için diyaliz devam edin.</li>
	</ol></li>
	<li>4 °C'de 10 dakika boyunca 20.000 x g'de diyaliz süspansiyonu santrifüj edin. Emme filtrasyon ekipmanı kullanarak süpernatant'ı bir membran filtreden geçirin. Filtrat'ı 75 cm2'lik bir şişeye aktarın.</li>
	<li>Immobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) tarafından filtröz süspansiyondan polihistidin etiketli GTF-SI'yi fraksiyone alın.
	<ol>
<li>Ni yüklü IMAC reçine bulamacının 2 mL'sini (yaklaşık 1 mL reçine) çıkış çıkışı silikon bir tüpe monte edilmiş bir kromatografik kolona aktarın. Yerçekimi akışı ile depolama çözeltisi çıkarın. DİkKAT: Resenin IMAC boyunca kurumasını izin verme.</li>
		<li>Reçine yıkamak için sütuniçine distile su 3 mL ekleyin. Rezorsu dengelemek için bağlama arabelleği 5 mL ekleyin.</li>
		<li>Bir Hoffmann çimdik horoz ile akışı kapatın. Bulamaç yapmak için adım 6.5 filtreli süspansiyon 5 mL ekleyin.</li>
		<li>Kalan filtreli süspansiyon tüm bulamaç ekleyin. Karışımı 4 °C'de 30 dk hafifçe döndürün.</li>
		<li>Karışımı sütuna geri yükleyin. Yerçekimi akışı ile süspansiyon kaldırın. IMAC reçiyi 20 mL bağlayıcı arabellekle yıkayın. NOT: Sonraki IMAC boyunca bir Hoffmann çimdik horoz ile yaklaşık 2 mL / dk akış hızı ayarlayın.</li>
		<li>Elüsyon tamponunun 20 mL'si (50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl, 500 mM imidazol, pH 8.0) rekombinant GTF-SI'yi eleştirmek. NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir. Eluat 4 °C'de depolanmalıdır. IMAC reşini yeniden kullanılabilir. IMAC rezorinin talimatlarına bakın.</li>
	</ol></li>
	<li>Elüsyon tamponu depolama tamponu (50 mM fosfat tamponu, pH 6.5) ile değiştirin ve rekombinant GTF-SI çözeltisini santrifüj ultrafiltrasyon ünitesi kullanarak yaklaşık 1 mL'ye yoğunlaştırın. Rekombinant GTF-SI çözeltisini 4 °C'de saklayın. NOT: SDS-PAGE13 ve batı lekeleme14 kullanarak polihistidin etiketli GTF-SI arınma doğrulayın bir horseradish peroksidaz-konjuge anti-polihistidin monoklonal antikor kullanarak. CHAPS ilavesi (son konsantrasyon, %0.1) eluent için hedef proteine bağlı olarak, birim nonspesifik adsorpsiyon önlemek için gerekli olabilir.</li>
</ol>7. Rekombinant GTF-SI tarafından Fonksiyonel Restorasyon
<ol></ol>

<ol><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual+3rd+Edition%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).</li>
<li>Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+functional+analysis+of+a+gene+of+interest+in+Streptococcus+mutans%3A+gene+disruption+followed+by+purification+of+a+polyhistidine-tagged+gene+product%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product.</a> Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).</li>
<li>Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+splicing+by+overlap+extension%3A+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li>
<li>Murata, T., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+chloride+channel+permease+to+fluoride+resistance+in+Streptococcus+mutans%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans.</a> FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101(2016).</li>
<li>Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+gene-disrupted+Streptococcus+mutans+strain+without+gene+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).</li>
<li>Hanada, N., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+the+Streptococcus+mutansgtfC+gene%2C+coding+for+synthesis+of+both+soluble+and+insoluble+glucans%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans.</a> Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).</li>
<li>LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+nucleotide+base+sequence+analysis+of+a+spectinomycin+adenyltransferase+AAD%289%29+determinant+from+Enterococcus+faecalis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR%3A+The+Polymerase+Chain+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">PCR: The Polymerase Chain Reaction.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">DNA Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Gel Purification.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Wingfield, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+precipitation+using+ammonium+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Protein precipitation using ammonium sulfate.</a> Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+Protein+with+SDS-PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+putative+cariogenic+properties+in+Streptococcus+mutans%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans.</a> Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).</li>
<li>Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+ligation+mutagenesis+in+transformable+streptococci%3A+application+and+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency.</a> Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).</li>
<li>Ge, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+gene+deletions+in+Streptococcus+sanguinis+by+high+throughput+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Astar tasarımı protokolün en kritik adımıdır. GTFC-reverse ve spcr-forward astarlarının dizileri, gtfC'nin 3' son bölgesi nin ve spcr'nin5' uç bölgesinin dizilerine göre otomatik olarak belirlenmiştir. Her astar, 5'bölgelerine bir GS bağlantı layıcısını kodlayan 24 tamamlayıcı temel ve His-tag-kodlama dizisini içerir. Yukarı yayılım bölgelerinde bulunan yerel düzenleyici dizilerin bozulması, 3' sonuna His-tag-kodlama dizilerinin eklenmesiyle önlenebilir. DNA stop ...

Bir genin işlevinin analizi genellikle ilgi geninin bozulduğunu suşlar için yabani tip suşların fenotibik özelliklerinin karşılaştırılmasını içerir. Gen bozan suşu üretildikten sonra, gen ürününün eksojen eklenmesi fonksiyonel restorasyona olanak sağlar.
Sonraki restorasyon tahlilleri için gerekli saflaştırılmış gen ürünleri elde etmek için en yaygın yöntem Escherichia coli1heterolog ifade gerçekleştirerek gereğidir. Ancak, membran proteinleri veya yüksek moleküler kütleli proteinlerin ekspresyonu genellikle bu sistemi kullanarak zordur1. Bu gibi durumlarda, hedef protein genellikle doğal olarak gen ürün kaybına yol açabilir adımlar, karmaşık bir dizi yoluyla protein sentezler hücrelerden izole edilir. Bu sorunların üstesinden gelmek için, gen bozulma yöntemi2, PCR tabanlı DNA birleştirme yöntemi3 (belirlenen iki aşamalı füzyon PCR) ve genetik için elektroporasyon aşağıdaki gen ürün arınması için basit bir prosedür geliştirilmiştir Streptococcus mutansdönüşüm . Gen ürününün C-terminusuna bir polihistidin etiketi (His-tag) eklenmesi, immobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) ile arınmasını kolaylaştırır.
O-tag-ifade suş izole etmek için, ilgi geninin tüm genomik DNA (bu Onun etiketi ifade gen-bozulmuş suş) bir antibiyotik dirençli marker geni ile değiştirilir. His-tag-ifade gerginlik üretmek için prosedür daha önce açıklandığı gibi bir gen bozulmuş gerginlik üretmek için hemen hemen aynıdır4,5. Bu nedenle, fonksiyonel analiz için seri deney olarak gen bozulması ve gen ürün izolasyonu yöntemleri yapılmalıdır.
Bu çalışmada, bir polihistidin kodlama dizisi gtfC 3 ' sonuna eklenir (GenBank çekirge etiketi SMU_1005) gen, kodlama glukozyltransferase-SI (GTF-SI) S. mutans6. Daha sonra streptokok türlerinde ekspresyon çalışmaları yapıldı. E. coli ile heterolog gtfC ekspresyonuna ulaşmak, gtf-SI'nin yüksek moleküler kütlesi nedeniyle zordur. Bu tür S. mutans His-gtfC olarak adlandırılır. GtfC ve spectinomisin direnç gen kasetinin organizasyonunu gösteren şematik bir illüstrasyon (spcr) yabani tip S. mutanlarda 7 loci (S. mutans WT) ve türevleri Şekil 1. GTF-SI, karojenik dişbiyofilminingelişimine katkıda bulunan bir salgı proteinidir 6. Sakaroz varlığı altında, bir yapışık biyofilm WT S. mutans zorlanma düz bir cam yüzey üzerinde gözlenir ama S. mutans gtfC-bozulmuş suşu (S. mutans ΔgtfC)2,5 . Biyofilm oluşumu rekombinant GTF-SI ekselansları üzerine S. mutans ΔgtfC'de geri yüklenir. Suşu, S. mutans His-gtfC , daha sonra rekombinant GTF-SI üretmek içinkullanılır.

<table><tbody><tr><td>Agaroz</td> jel <td>elektroforezi için</td>Agarose <td>Nippon Genetics</td><td>NE-AG02</td></tr><tr><td>Anaeropack</td><td>Mitsubishi Gas Chemical</td><td>A-03</td><td>Anaerobik kültür sistemi</td></tr><tr><td>Anti-His-Tag monoklonal antikor</td><td>MBL</td><td>D291-7</td><td>HRP konjuge</td></tr><tr><td>BCA protein test kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td>Protein konsantrasyonunun</td></tr> <tr><td>ölçülmesiBeyin kalp infüzyon suyu</td><td>Becton, Dickinson</td><td>237500</td><td>Bakteri kültürü ortamı</td></tr><tr><td>CBB R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td>Biyofilm boyama için</td></tr><tr><td>Santrifüj ultrafiltrasyon ünitesi</td><td>Sartorius</td><td>VS2032</td><td>Tampon değişimi ve protein konsantrasyonu</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Kubota</td><td>7780II</td><td></td></tr><tr><td>Kromatografik kolon</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td>IMAC</td></tr><tr><td>Diyaliz membran kelepçesi</td> için <td>Fisher marka</td><td>21-153-100</td><td></td></tr><tr><td>Diyaliz tüpü</td><td>As One</td><td>2-316-06</td><td></td></tr><tr><td>DNA polimeraz</td><td>Takara</td><td>R045A</td><td>Yüksek kaliteli DNA polimeraz</td></tr><tr><td>DNA dizilimi</td><td>Eurofins Genomics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECL substrat</td><td>Bio-Rad</td><td>170-5060</td><td>Batı blot için</td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M pH 8,0)</td><td>Wako</td><td>311-90075</td><td>Tris-EDTA tampon hazırlama</td></tr><tr><td>Elektroporasyon küveti</td><td>Bio-Rad</td><td>1652086</td><td>0,2 cm boşluk</td></tr><tr><td>Elektroporatör</td><td>Bio-Rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>EtBr çözeltisi</td><td>Nippon Gene</td><td>315-90051</td><td>Agaroz jel elektroforezi için</td></tr><tr><td>Jel bant kesici</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-830</td><td></td></tr><tr><td>Jel ekstraksiyon kiti</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-91202</td><td>agaroz jel Görüntüleyiciden DNA ekstraksiyonu</td></tr><tr><td></td><td>GE Healthcare</td><td>29083461</td><td>SDS-PAGE ve batı blotlama için</td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>Wako</td><td>095-00015</td><td>Bağlayıcı tampon ve elüsyon tamponu hazırlama</td></tr><tr><td>İnkübatör</td><td>Nippon Medical & Kimyasal Aletler</td><td>EZ-022</td><td>Sıcaklık ayarı: 4 &�; C</td></tr><tr><td>Kuvöz</td><td>Nippon Medikal & Kimyasal Aletler</td><td>LH-100-RDS</td><td>Sıcaklık ayarı: 37 °C C</td></tr><tr><td>Membran filtre</td><td>Merck Millipore</td><td>JGWP04700</td><td>0.2 &mikro; m çaplı</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj</td><td>Kubota</td><td>3740</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td>Bağlanma tamponu ve elüsyon tamponu</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; 2H < > 2 O</td><td>Wako</td><td>192-02815</td><td>Bağlanma tamponu ve elüsyon tamponu</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Wako</td><td>198-13765</td><td>Bağlanma tamponu ve elüsyon tamponunun hazırlanması</td></tr> <tr><td>(NH < alt > 4 < / alt >) < alt > 2 < / alt > SO< alt >4< / alt ></td><td>Wako</td><td>015-06737</td><td>Amonyum sülfat çökeltme</td></tr><tr><td>Ni yüklü reçine</td><td>Bio-Rad</td><td>1560133</td><td>IMAC için</td></tr><tr><td>PCR primerleri</td><td>Eurofins Genomics</td><td>Özel sipariş</td><td></td></tr><tr><td>edilen Protein standardı</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0381</td><td>SDS-PAGE ve western blotting için</td></tr><tr><td>Solvent filtrasyon</td><td>aparatı Bir</td><td>FH-1G</td><td></td></tr><tr><td>Spektinomisin</td><td>Wako</td><td>195-11531</td><td>Antibiyotikler olarak; 100 & mu'da kullanın; g / mL</td></tr><tr><td>Steril şırınga filtresi</td><td>Merckmillipore</td><td>SLGV004SL</td><td>0.22 &mikro; m çap</td></tr><tr><td>Streptococus mutans &#916; gtfC</td><td>Laboratuvarda stok suşu.</td><td></td><td>gtfC spcr<><>em</td></tr><tr><td>Streptococus mutans UA159</td><td>Laboratuvarda stok suşu.</td><td></td><td>S. mutans ATCC 700610, Yabani tip suş</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td>Biyofilm gelişimi için</td></tr><tr><td>TAE (50 > )</td><td>Nippon Gene</td><td>313-90035</td><td>Agaroz jel elektroforezi için</td></tr><tr><td>Termal döngüleyici</td><td>Bio-Rad</td><td>PTC-200</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1 M, pH 8.0)</td><td>Wako</td><td>314-90065</td><td>Tris-EDTA tampon hazırlama</td></tr></tbody></table>

streptococcus mutans'larda yüksek moleküler kütle proteininin saflaştırılması

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Bir genin işlevinin açıklanması genellikle ilgi geninin bozulduğunu zinde tip suşların ve suşların fenotipik özelliklerinin karşılaştırılmasını içerir. Gen bozulmasından sonra fonksiyon kaybı, bozulan genin ürününün eksojen eklenmesiyle geri kazanılır. Bu genin işlevini belirlemek için yardımcı olur. Daha önce açıklanan bir yöntem gtfC gen sekteye uğrayan Streptococcus mutans suşu oluşturmayı içerir. Burada, gtfC gen ürününü gen bozulmasından sonra yeni üretilen S. mutans suşundan arındırmak için talepedilmeyen bir yöntem tanımlanmıştır. Bu immobilize metal afinite kromatografi kullanarak gen ürün basit saflaştırma sağlayan ilgi geninin 3 ' sonunda bir polihistidin kodlama dizisi nin eklenmesini içerir. Bu yöntemde genetik modifikasyon için PCR dışında enzimatik reaksiyonlara gerek yoktur. Gen bozulmasından sonra gen ürününün ekolarak restorasyonu, farklı türlere de adapte edilebilen gen fonksiyonunu belirlemek için etkili bir yöntemdir.

Şekil 3, ilk PCR(Şekil 3A)ve ikinci PCR(Şekil 3B)her bir amplicon boyutunu gösterir. Her amplicon boyutu Tablo 1'deaçıklandığı gibi, öngörülen boyutu ile karşılık gelir. Şekil 4A, ikinci PCR ürünü ile dönüştürülmüş ve spectinomisin içeren BHI agar plakaları üzerine kaplanmış S. mutans kolonilerini göstermektedir. Colony PCR ürünleri daha sonra a...

Burada açıklanan Streptococcus mutansbir gen ürün saflaştırma için basit bir yöntemdir. Bu teknik proteinlerin saflaştırılmasında, özellikle membran proteinlerinde ve yüksek moleküler kütle proteinlerinde avantajlı olabilir ve diğer çeşitli bakteri türleri ile birlikte kullanılabilir.

Streptococcus mutans'larda Yüksek Moleküler Kütle Proteininin Saflaştırılması

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

Bu yöntem mikrobiyoloji alanındaki anahtar soruların cevaplatına yardımcı olabilir, örneğin E.Coli'de ifade etmesi zor bir gen ürünü nasıl arındırır. Bu tekniğin başlıca avantajları, PCR dışında hiçbir enzimatik reaksiyonun taşıyıcı olmaması ve protein saflaştırma için yaygın uygulamalar da kullanılabildiğidir. Bu yöntem streptococcus mutans protein saflaştırma içine fikir sağlayabilir rağmen, aynı zamanda diğer mikrobiyota türleri için bir haberdar olabilir.Prosedürü gösteren Dr.Mamiko Yamashita, bizim laboratuvardan yüksek lisans öğrencisi olacaktır. Streptococcus mutans primer tasarım ve genomik DNA çıkarma sonra, yabani tip streptococcus mutans ve GFC pcr şablonları olarak streptococcus mutans genom bozulmuş kullanarak ilk PCR gerçekleştirmek. GtfC geninin aşağı kısmını barındıran bölgeleri ve hazırlanan gtfC-ileri ve ters astar ı ve spc r-ileri ve ters astarı kullanarak spektinomisin direnç genini barındıran bölgeleri güçlendirin.Daha sonra, % 1 agarose jel her PCR ürün elektrofore. Mikrosantrifüj tüpler içine jel yaklaşık 1.000 baz çiftleri ve 2.000 baz çiftleri istenilen DNA parçaları çıkarmak için bir jel bandcutter kullanın. Her tüp içine çözünen tampon 500 mikrolitre ekleyin ve jel dilimleri eritmek için 56 santigrat derece onları 10 dakika kuluçka.Silika membran bazlı jel çıkarma yöntemi ile parçaları arındırın. İç içe ve iç içe dönük ve iç içe dönük astarlarla PCR şablonları olarak ilk PCR'nin ürünlerini kullanarak ikinci bir PCR gerçekleştirin. İkinci PCR ürünü elektroforez ile teyit edilemiyorsa, başka bir iç içe astar çifti tasarlanmalıdır.agarose jel üzerinde PCR karışımı nın elektrofore beş mikrolitre. Ethidium bromür jel boyama görüntüsü ile yaklaşık 3.000 baz çifti uygun amplicon üretimi onaylayın ve el yazmasına göre devam edin. Şimdi, konsantre ikinci PCR ürününün beş mikrolitresini buz gibi 50 mikrolitrelik aloquot'a karıştırın.Bir elektroporasyon cuvette içine karışımı ekleyin ve elektroporasyon cihazının cuvette odasına cuvette yerleştirin. Hücrelere 2,5 milisaniye boyunca 1.8 kilovolt, 600 ohm ve 10 mikrofarad içeren tek bir elektrik darbesi verin. Cuvette içine beyin-kalp infüzyon suyu 500 mikrolitre ekleyin.Hemen beyin-kalp infüzyon ütektürin plakaları üzerine spektinomisin içeren süspansiyon 10 ila 100 mikrolitre yayıldı. Koloniler toplanacak kadar büyüyene kadar plakaları 37 derecede 2-6 gün kuluçkaya yatırın. Streptococcus mutans polihistidine kodlama dizisi nin nesil sonra el yazmasına göre sitomisin olmadan gerginlik ve gece aşılama dahil, 10 dakika boyunca bakteri kültürü süspansiyon santrifüj, 4 santigrat derece g 000 kez.Kültür supernatant üç litrelik cam kabı içine aktarın. Kültür supernatant proteinleri konsantre etmek için, bir manyetik karıştırıcı üzerine iki litrelik supernatant yerleştirin ve güçlü karıştırma başlar. Amonyum sülfat 1, 122 gram ekleyin ve dört saatlik bir süre içinde veya bir gecede dört derece santigrat güçlü karıştırma ile çökelti oluşmasını sağlar. Sonraki.amonyum sülfat çözeltisi 15, 000 kez g 4 santigrat derece 20 dakika için çökelti çözeltisi santrifüj. Süpernatant'ı decant. Bir spatula ile, çökelti toplamak ve 200 mililitrelik cam kabı içine aktarın.Bağlayıcı tampon 35 mililitre pelet resuspend. Daha sonra, her biri yaklaşık 25 mililitre süspansiyonu rejenere olmuş selüloz diyaliz tüpüne aktarın. Süspansiyon diyaliz için dört derece santigrat bir karıştırıcı üzerinde karıştırma bağlayıcı tampon 2,5 litre içine diyaliz tüpü yerleştirin.Diyaliz solüsyonunu iki saat sonra değiştirin ve bir gece boyunca diyalize devam edin. Sonraki transfer hortum tüpleri için boru dan diyaliz süspansiyon ve santrifüj tüpleri yerleştirin 20, 000 kez g dört derece santigrat 10 dakika boyunca. Kesit filtrasyon ekipmanları ile, filtre lemek için 0,2 mikrometrelik membran filtre üzerine supernatant dökün.Filtrat'ı 75 mililitrelik bir şişeye aktarın. Polihistidin etiketli gtfSI'yi filtröz süspansiyondan ayırmak için önce immobilize metal afinite kromatografisi hazırlayın. El yazmasına göre rezorini dengeledikten sonra Hoffman çimdik sikini kapatın.Bir bulamaç yapmak için sütuna filtrelenmiş süspansiyon beş mililitre ekleyin. Daha sonra, kalan filtrelenmiş süspansiyon tüm bulamaç aktarın ve yavaşça dört derece santigrat 30 dakika boyunca karışımı girdap. Karışımı sütuna geri yükleyin.Yerçekimi akışı ile süspansiyon kaldırmak için Hoffman çimdik horoz açın. IMAC reçisini 20 mililitre bağlayıcı tamponla yıkayın ve rekombinant gtfSI elde etmek için 20 mililitre elüsyon tamponu temizler. Bundan sonra, bir santrifüj ultra filtrasyon tüpü içine eluate yükleyin ve çözelti konsantre bir ila beş dakika için 2,000 kez g çözeltisi santrifüj.Filtrat kabını boşaltın ve tüpe 15 mililitre depolama tamponu ekleyin. Numuneyi tekrar santrifüj edin ve işlemi iki kez daha tekrarlayın. Rekombinant gtfSI çözeltisi nihayet yaklaşık bir mililitreye konsantre edilir.Bir mikrocentrifuge tüp içine konsantre aktarın ve dört santigrat derece de saklamak. Geri kalan fonksiyonel restorasyon protokolüne devam edin. Bu protokolde, agarose jel elektroforez ilk PCR ve ikinci PCR her amplicon boyutu öngörülen boyutu ile karşılık geldiğini gösterir.Streptococcus mutans kolonileri ikinci PCR ürünü ile dönüştürüldü ve spektinomisin içeren beyin-kalp infüzyon üğnlü plakalar üzerine kaplandı. Agarose jel üzerinde çalışan Colony PCR ürünleri her amplicon öngörülen boyutu olduğunu gösterir. SDS-PAGE tarafından immobilize metal afinite kromatografisi ile saflaştırılmış protein tek bant olarak gözlendi.Anti-polihistidin antikor kullanılarak yapılan batı lekesi, gözlenen bandın 160 kilodaltonun beklenen polihistidin etiketli proteini olduğunu doğruladı. Sakaroz kaynaklı biyofilm şekillendirme yeteneği sadece streptococcus mutans yabani tip ve streptokok mutans His-gtfC ile görüldü, hangi tüp duvarında bir yapışık biyofilm oluşan 1%sakaroz varlığında. Bu streptokok mutans delta gtfC gözlenmemiştir.Ancak, rekombinant gtfSI 25 mikrogram eklenmesi streptococcus mutans delta gtfC yapışık biyofilm oluşum yeteneğini geri. Bu yöntemin başarısı ikinci PCR amplifikasyonuna bağlı olduğundan, ikinci PCR ürünü elektroforez ile teyit edilmelidir. Zaten bu yöntemle elde edilen histidin tipi protein, protein-protein etkileşimleri gibi fonksiyonel asitlere de bir araya gelmektedir.Gelişiminden sonra, bu teknik, gen bozulması ile birlikte, mikrobiyoloji alanında araştırmacılar ın gen fonksiyonunu keşfetmelerinin önünü açtı.

purification-of-a-high-molecular-mass-protein-in-streptococcus-mutans

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Mama magnetosome aktivasyonu dahil olmak gösterildi eşsiz bir Magnetosome ilişkili protein. Burada Mama silme mutant arıtma protokolü (MamAΔ41)...

Saflaştırılması M. magneticum Deformasyon AMB-1 Magnetosome İlişkili Protein MamAΔ41

Kütle spektrometrisi (antipersonel mayınları) ile kombinasyon halinde etiketli proteinlerin saflaştırılması Affinity protein etkileşimi ağların sistematik eşleme için ve biyolojik süreçlerin mekanistik temeli araştırmak için güçlü bir yöntem. Burada, bakteri için geliştirilmiş optimize edilmiş sıralı peptid afinite (SPA) antipersonel mayınları prosedürü...

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Kaynak: Murata, T., vd. Streptococcus mutans'ta Yüksek Moleküler Kütleli Bir Proteinin Saflaştırılması. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, Streptococcus mutans'tan salgılanan polihistidin etiketli bir proteinin saflaştırılması için adım adım bir prosedürü göstermektedir.

Polihistidin Etiketli Bir Proteinin Streptococcus mutans'tan Saflaştırılması İçin Bir Prosedür

Bir yaklaşım, biyokimyasal zar proteinlerinin in vivo protein-protein etkileşimleri (PPI) tanımlamak için tarif edilmektedir. Yöntem, protein çapraz-bağlama, afinite arıtma ve kütle spektrometrisi birleştirir, ve hemen hemen herhangi bir hücre tipi ya da organizma için uyarlanabilir. Bu yaklaşımla, geçici PPI bile tespiti mümkün olur.

Membran-OMURGA: Membran Proteinleri protein-protein etkileşimleri belirlemek için bir Biyokimyasal Aracı In Vivo

Bir yöntem olup (Strep-taktin) reçinesi kovalent Bis (sülfosuksinimidil) suberat (BS3) ile çapraz bağlanmış, modifiye edilmiş streptavidin ile ilgili çift-Strep-etiketli füzyon proteinleri ve bunların özel komplekslerinin etkin arıtma için açıklanmıştır. Bir yöntem hızlı hızlı, iyi bir hedef protein geri kazanımı ve yüksek saflıkta avantajları vardır ve kütle spektrometresi ile bir sonraki analiz ile uyumludur.

Tek aşamalı Strep-taktin Reçine Bis (sülfosuksinimidil) ile çapraz bağlanmış suberat (BS3) hakkında Çift Strep-etiketli proteinler ve komplekslerinin saflaştırılması

Elastin benzeri polipeptitler, yeniden birleştirici protein arıtma için ilaç teslim çeşitli uygulamalar ile uyarıcı yanıt biyo-polimerler vardır. Bu protokol, kromatografi için basit bir alternatif olarak bunların düşük kritik çözelti, sıcaklık faz geçiş davranışları kullanılarak Escherichia coli'den elastin gibi polipeptidler ve bunların peptid veya protein füzyonlarının saflaştırılmasına ve karakterizasyonunu tarif etmektedir.

Peptidler ve proteinler ile rekombinant Elastin gibi Polipeptitlerin ve Fusions olmayan kromatografik saflaştırma<em&gt; Escherichia coli</em

Prolin-prolin endopeptidaz-1 (PPEP-1), insan patojeni Clostridium difficile'den salgılanan bir metalloprotaz ve umut verici ilaç hedefidir. Burada, bu proteinin üretimi ve yapısının belirlenmesi için gerekli tüm yöntemleri açıklıyoruz.

Üretim, Kristalleşme ve Yapı Tayini ve<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 mikro-tohumlama ve Çinko-SAD aracılığıyla

Bu protokol, rekombinant etiketsiz kalsiyum bağlayıcı protein S100A12 ve insan monosit stimülasyonu tahlilleri için iyonkaynaklı oligomerler için bir arıtma yöntemini tanımlar.

İnsan S100A12 ve Bağışıklık Hücre Stimülasyonu için Iyon kaynaklı Oligomerlerin Saflaştırılması

Bu makale, bir C41 (DE3) ekspresyon sisteminde toksik bir nükleaz olan rekombinant Nsp15'in aşırı eksprese edilmesi için bir metodolojiyi ve ardından afinite ve boyut dışlama kromatografisi kullanılarak etiketli proteinin saflaştırılmasını açıklamaktadır. Bu protokoller diğer zorlu toksik proteinler için uyarlanabilir.

Escherichia coli'den Toksik Bir Nükleazın Aşırı İfade Edilmesi ve Saflaştırılması

Bu protokol, Escherichia coli'den elastin benzeri polipeptit (ELP) arındırılması için hızlı, tekrarlanabilir organik çözücü bazlı ekstraksiyon ve çökeltme yöntemini tanımlar; bu yöntem, geleneksel ELP arıtma yöntemlerine potansiyel olarak ölçeklenebilir bir alternatif sunar.

E. coli'den Elastin Benzeri Polipeptitlerin (ELP) Organik Çözücü Bazlı Ekstraksiyon ve Çökeltme Yöntemi Kullanılarak Verimli Arındırılması

Öğrenin Streptococcus mutans'ta yüksek moleküler kütleli membran proteinlerinin saflaştırılması için PCR tabanlı bu etkili yöntemi. Bu teknik diğer bakteri türlerine de uyarlanabilir ve mikrobiyoloji araştırmalarına katkı sağlar.

Streptococcus mutans'larda Yüksek Moleküler Kütle Proteininin Saflaştırılması

Daha fazla video keşfet