Transkripsiyon başlangıç site haritalama süper düşük giriş taşıyıcı-kafes kullanarak

Bu yöntem, düşük miktarda başlangıç materyali kullanarak çekirdek organizatörü ve arttırıcı keşfini sağladığından, gen düzenlemesi alanındaki anahtar soruların yanıtlatılmasını sağlayabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, sadece 10 nanogram toplam RNA kullanarak RNA polimeraz II transkripsiyonel başlangıç alanlarının tarafsız, genom genişliğinde tek nükleotit çözünürlüğü haritalamasına olanak sağlamasıdır. CAGE tanı belirteçleri olarak kullanılabilecek hastalık ile ilişkili transkripsiyon başlangıç sitelerini ortaya çıkarmak için paha biçilmez olduğunu kanıtlıyor.

SLIC-CAGE bu keşifleri doku biyopsisi gibi örnekleri ölçeklendirmek için genişletir. SLIC-CAGE, çok çeşitli model organizmaların erken embriyonik gelişim evreleri veya embriyonik dokular dahil olmak üzere zayıf hücre tiplerinin derinlemesine ve yüksek çözünürlüklü organizatörüanalizi için idealdir. Bu protokolde çok sayıda adım olduğundan, tüpler arasında transfer ederken mümkün olduğunca çok malzeme almaya özen yaparak her adımda numune kaybını en aza indirmek çok önemlidir.

Her şablon için PCR karışımını hazırlayarak başlayın. Tampon, dNTPs, benzersiz ileri astar, sentetik taşıyıcı gen ile şablon plazmid ve füzyon polimeraz el yazması yönlere göre birleştirin. Pipetleme ile reaktifleri karıştırın.

Her ters astar ve karışımı 10 mikrolitre PCR karışımı 90 mikrolitre ekleyin. Termobisiklet koşulları için el yazmasına bakın. RNA'da ters transkripsiyon veya RT gerçekleştirin.

Bir mikrolitre ters transkripsiyon astarını, 10 nanogram RNA'yı ve 4,990 nanogram taşıyıcı karışımını toplam 10 mikrolitre lik hacimde birleştirin. Yukarı ve aşağı boru lar karıştırarak karıştırın. Karışımı 65 dereceye kadar beş dakika ısıtın ve hemen buza yerleştirin.

RT karışımını el yazması yönlere göre hazırlayın ve 10 mikrolitre RNA'ya 28 mikrolitre karışımı ekleyin. Homojen olana kadar boru ile tüp içeriğini karıştırın. Rt'yi bir termocycler ile çalıştırın.

Ters transkripsiyon tamamlandıktan sonra ürünü DNase ve RNase içermeyen SPRI manyetik boncuklarla arındırın. 1,8'e bir hacim oranında RT karışımına boncukları ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın. Karışımı oda sıcaklığında beş dakika oturalım.

Sonra, bir manyetik standı üzerine boncuk yerleştirin ve onları beş dakika ayrı bırakın. Supernatant atın ve boncuklar için taze hazırlanmış% 70 etanol 200 mikrolitre ekleyin. Boncukları karıştırmayın veya manyetik standdan çıkarmayın ve ekledikten hemen sonra etanolü çıkarmayın.

Tüpü manyetik standda tutun ve kalan damlacıkları P10 pipetiyle dışarı iterek tüm etanol izlerini çıkarın. Hemen 42 mikrolitre su ekleyin ve pipet 60 kez yukarı ve aşağı örnek elute, köpük neden değil dikkat ederek. Tüpü kapaksız 5 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın ve sonra boncukları manyetik standa ayırın.

Sonra, tüm supernatant almak için özen, tüpler yeni bir dizi supernatant aktarın ama boncuk taşıma önlemek. RNase I tedavisinden sonra, 45 mikrolitre numuneyi 105 mikrolitre hazırlanmış streptavidin boncuklarla karıştırın ve 37 derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka sırasında, pipet her 10 dakikada bir karıştırmak için örnek.

Sonra, manyetik standı nda boncuk ayırın ve supernatant çıkarın. A, B ve C tamponları ile boncukları yıkayın. Manyetik standı 2-3 dakika ayırın ve sonra supernatant çıkarın.

B ve C tamponlarını 37 santigrat dereceye ısıtın ve yıkama adımlarını tekrarlayın. Tüm kapaksız RNA kaldırmak için, iyice streptavidin boncuk ve tüp duvarları yıkamak ve tamamen bir sonraki eklemeden önce yıkama tampon kaldırmak için çok önemlidir. CDNA'yı serbest bırakmak için, 1X RNase I tamponunun 35 mikrolitresinde boncukları yeniden askıya alın ve 95 derecede 5 dakika kuluçkaya yatırın.

Kuluçkadan sonra, boncukları hemen iki dakika buzun üzerine yerleştirin. Boncukları manyetik bir standa ayırın ve süpernatant'ı yeni bir tüp setine aktarın. 1X RNase I tampon 30 mikrolitre boncuk resuspend ve daha sonra manyetik bir stand üzerinde ayrı.

Yaklaşık 65 mikrolitre toplam hacmi için daha önce toplanan supernatant ile supernatant birleştirin. Hedef kitaplık lağvetme için PCR döngülerinin sayısını belirlemek için qPCR gerçekleştirin. QPCR ana karışımlarını taşıyıcıdan tüm DNA kitaplıklarını yükseltmek için hazırlayın.

Termobisiklet koşullarını el yazması talimatlara göre ayarlayın ve hazırlanan numuneyi yükseltin. SLIC-CAGE protokolü, başlangıç RNA materyalinin nanogramlarından sıralamaya hazır kitaplıklar elde etmeyi mümkün kılar. Son kitaplıktaki parça uzunluğu 200 ile 2,000 baz çifti arasında değişir.

Daha kısa parçalar PCR yapılarıdır ve satır aşağı sıralama sorunlarına neden olabilir. Bunları kaldırmak için ek boyut seçimi turları gerçekleştirilebilir. NanoCAGE ile karşılaştırıldığında, SLIC-CAGE transkripsiyon başlangıç yeri tanımlamada önemli ölçüde daha iyi performans sergiler, bu da s.cerevisiae toplam RNA'nın çeşitli miktarlarında yapılan iki tekniğin alıcı işletim karakteristik eğrilerinden belirgindir.

Bu protokolü gerçekleştirirken, örnek kaybının düşük karmaşıklıkta kitaplıklara yol açabileceğini unutmayın. Bunu önlemek için, düşük bağlayıcı pipet uçları ve tüpler kullanılmalıdır. SLIC-CAGE olmadan, çeşitli hücre türlerinin organizatör analizi şimdiye kadar erişilemez olmuştur.

Bu model organizmaların geniş bir yelpazede embriyonik gelişim aşamaları veya embriyonik doku analizi içerir.