Yeni kinaz proteinin sağlam biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak moleküler düzeyde karakterize edilmesi

İmmünopreplinasyon, hedef proteini izole etmek ve arındırmak için çok güçlü bir tekniktir. Pürüzsüz koşullarda, proteinler, regülatörler veya substratlar birlikte immünopsipitated olabilir. Daha sonra yeni bir etkileşim ağı keşfedilebilir.

İmmünopresipitated proteinaktivitesi de değerlendirilebilir. Özellikle, bir kizazın aktivitesi P32-ATP etiketleme ile farklı yüzeylerde test edilebilir. Bununla birlikte, bir hastalığa karışan bir kiniazı hedef alan inhibitörlerin aktivitesi değerlendirilebilir.

Onlar yeni ilaçlar geliştirmek için kurşun bileşikleri oluşturabilir. Bu yöntem memelilerden maya veya bakterilere kadar uzatılabilir. Bu teknik o kadar da zor değil.

Önemli noktalara: algılanan etkileşimin belirli olduğundan emin olmak için negatif bir denetime sahip olun ve etkileşimleri ve etkinliği korumak için lysis koşullarını dikkatlice seçin. Küçük ayrıntılar ve jestler bu tekniğin başarısını sağlamak için önemlidir ve onlar malzeme ve makalelerin yöntemleri açıklanmaz. Prosedürü gösteren Fabienne Godin, bizim laboratuvar bir teknisyen olacaktır.

Hücreler biyogüvenlik kabini içinde hücre kültür odasında hazırlandıktan sonra, plakalar medya kaldırmak ve çamaşır suyu ile özel bir atık şişesinde atmak için 10 mililitrelik pipet kullanın. Sonra, taze takviye DMEM 10 mililitre ekleyin ve 37 santigrat derece bir kuvöz içine plakaları geri koymak. Transfeksiyon karışımı hazırlamak için, bir 15 mililitretüp, 10 milimolar Tris hidroklorür çözeltisi 450 mikrolitre ekleyin 7.5, bir milimolar EDTA ve 50 mikrolitre ile takviye 2.5 molar kalsiyum klorür çözeltisi.

Ters çevirme ile karıştırın. Tüpün içine, 10 mikrogram plazma DNA'sına karşılık gelen bir hacim ekleyin, DNA midiprep kiti ile güçlendirilmiş ve bu kitin elüsyon tamponu ile seyreltilmiş, ve konsantrasyonu tespit edilmiştir. Tüpü karıştırmak için ters çevirin.

Daha sonra, bir girdap karıştırıcı üzerinde pürüzsüz ajitasyon ile, yavaş yavaş bes tamponlu tuzlu 2X konsantre 500 mikrolitre ekleyin, tüp içine damla damla. DNA ve kalsiyum fosfat arasındaki karmaşık oluşumu bozmak için değil, çok dikkatli hareket ettirin. Oda sıcaklığında en az 15 dakika veya 45 dakikaya kadar kuluçkaya yatın.

Şimdi, tabağı kuvözden güvenlik kabinine aktarın. Hazırlanan DNA kompleksleri levha nın yüzeyindeki hücrelere damla damla ekleyin. 37 santigrat derecede kuvözde 24 ila 72 saat kuluçka.

Protein bozulmasını önlemek için, her transfected plaka için lysis tampon dört mililitre dikkate alarak, buz üzerinde lysis tampon hazırlayın. Kuvözden transfected hücreleri ile plaka alın. Ortamı çıkarın ve özel bir çamaşır suyu atık şişesine atın.

Hücreleri yıkamak için, transfected hücreleri ayırmakönlemek için, damla levha nın yan tarafında soğuk PBS üç mililitre ekleyin. Tamponu yüzeye yaymak için plakayı yavaşça döndürün. PBS'yi çıkarmak için plakayı yatırın ve atık şişeye atın.

Yıkamayı bir kez daha tekrarlayın. Tabağı buza yerleştirin. Sonunda, PBS'nin geri kalanını dikkatlice çıkarın.

Daha sonra, transfected yıkanmış hücrelere 500 mikrolitre soğuk lysis tampon ekleyin. Tabağın yüzeyine yayın. Buzda 10 dakika kuluçkaya yat.

Zaman zaman, yine plaka yüzeyine tampon yayıldı. Bundan sonra, yüzeyden hücreleri kazımak ve bir mikrosantrifüj tüp onları toplamak için bir hücre spatula kullanın. 10 dakika santrifüj 10, 000 kez G ve dört santigrat derece.

Yeni bir mikrosantrifüj tüp içine supernatant lysate toplamak ve başka bir yeni mikrosantrifüj tüp için bu kesir bir 50 mikrolitre aliquot toplamak. Bu aliquot transfected proteinler iyi ifade olup olmadığını kontrol etmek için kullanılacaktır. Pelet'i çöpe atın.

İlk olarak, uygun antikor ile birleştiğinde agarose boncuk stok çözeltisi yavaşça resuspend. Bir ila iki milimetrelik bir açıklık yapmak için 200 mikrolitreucu ucunu kesin. Ucu bir mikropipete takın ve çözeltinin 40 mikrolitresini çizerek boncukların uca girmesini bekleyin.

Pipet boncuklar birkaç kez yukarı ve aşağı boncuk doğru hacmini sağlamak ve bir mikrocentrifuge tüp boncuk aktarmak için ucu doygunluk. 500 mikrolitre TNET tamponu ekleyin, ters çevrilerek karıştırın ve 1,000 kez G ve dört santigrat derecede iki dakika santrifüj ekleyin. Supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve 500 mikrolitre TNET arabelleği ekleyin.

Dört santigrat derecede en az bir saat dönen bir tekerlek üzerinde kuluçka. Daha sonra tüpü 1,000 kez G ve 4 santigrat derece de iki dakika santrifüj edin ve boncukları ters çevirerek ve santrifüj ederek 500 mikrolitre lysis tamponu ile iki kez yıkayın. Yıkadıktan sonra, daha önce toplanan toplam kesirli tüpün içine aktarın ve dört derece santigrat derecede iki ila dört saat boyunca kuluçkaya yatırın.

Şimdi, immünoppresipated boncukları içeren tüpü 1,000 kez G ve 4 santigrat derecede iki dakika santrifüj edin. Boncukları 500 mikrolitre likis tamponu ile ters çevirerek ve santrifüj ederek beş kez yıkayın. Boncukları yıkarken, supernatant çıkarırken boncukçok yakın gitmek için dikkat edin.

Aksi takdirde boncuklar aspire edilecek ve deneyin sonunda artık boncuk kalmayacak. Elüsyon için, 1, 000 kez G ve dört derece santigrat iki dakika için ilk santrifüj. Dikkatle supernatant kaldırmak için bir mililitre mikropipet kullanın.

Sonra, bir Hamilton şırınga bir çimentolu iğne ile donatılmış, boncuk aspirasyon önlemek için supernatant son damla kaldırmak. Daha sonra, 4X Laemmli tampon 40 mikrolitre ekleyin. Yavaşça tüp dokunarak homojenize.

Oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yat. Sonra, 10,000 kez G ve oda sıcaklığında beş dakika santrifüj. Bir Hamilton şırıngası ile, yeni bir mikrosantrifüj tüp içine supernatant eluate aktarın.

Eksi 80 derecede saklayın. HEK-293 hücreleri etiketsiz LIMK 2-1 veya LIMK 2'nin HA etiketli izoformlarından biri ile transfeksedildi. LIMK 2-1 farklı koşullarda iyi ifade edilir.

Anti LIMK 2-1 antikor LIMK 2a ve LIMK 2b izoformlarını tanımaz ve hücreler LIMK2 küçük müdahale cihetli RNA ile transfeced olduğunda sinyali azalır gibi, küçük müdahale RNA kontrol etmek için karşılaştırıldığında, spesifiktir. Çeşitli insan hücre hatlarında, LIMK 2-1 HEK-293 ve HeLa ifade gibi görünüyordu, ama C6 değil. Limk2-1'in yukarı dakik KAYAsı ile etkileşimini değerlendirmek için koimmünenopret deneyleri kullanıldı. Transfected vektörler tarafından kodlanmış farklı proteinlerin her biri iyi ifade edildi.

LIMK2'nin üç isoform'u ve larp6'nın üç isoformu etkin bir şekilde immünopsipitated edildi. Eluates'te ROCK tespit edildi ve böylece LIMK2'nin üç izoformu ile koimmünpresipitated, ancak larp6 ile değil. Algılanan etkileşim sonra özeldir.

Koimmünpresipitated LIMK 2-1 gama P32 ATP etiketleme ile kizaz aktivitesi için test edildi. LIMK 2-1 kofilin fosforilasyon vermedi, oysa miyelin bazal proteinveya MBP fosforilit yaptı. LIMK 2-1 bu testte etkili bir şekilde immünopsipitated edilir.

Etkileşimin spesifik olduğundan emin olmak için immünoprediyağış yaparken negatif kontrole sahip olmak çok önemlidir. Bir lysis arabelleği bileşimi dikkatle etkileşim ve etkinliği korumak için ayarlanmalıdır. İmmünyağış üzerine, kinaz aktivitesi farklı substratları saymak için değerlendirilebilir.

Mutasyon kolayca ortaya çıkabilir ve spesifik kalıntıların rolünü çözebilir. Yeni vurgulanan etkileşimlerin fizyolojik rolünü anlamak için fonksiyonel çalışmalar da yapılabilir. Hücreler, biyogüvenlik kabini içinde özel bir kültür odasında kültürlendirilmelidir.

P32 ATP belirli bir dikkatle ele alınmalıdır. Radyasyondan korumak için kalkan, Geiger sayacı, özel atık toplamak, radyoaktif maruziyeti tespit etmek ve ipuçlarını filtrelemek için kişisel göğüs ve parmak rozetleri.