Lamina Propria Mononükleer Hücrelerin Murine Kolondan Kollajenaz E Kullanarak İzolasyon

Bu protokol kullanılarak bağırsaktan bağışıklık hücrelerinin henotipik analizinde izolasyon GI ve sistemik inflamatuar bozuklukların anlaşılması için geçerli olduğu kanıtlanmıştır. Bu yöntem Fleur's Atomistry veya diğer yöntemlerle sonraki immün fenotipleme sağlayan kirletici enkaz en aza indirerek canlı mononükleer hücrelerin önemli sayıda izole eder. Bağırsak birçok hastalıkta iltihabın önemli bir hedef alanı olduğundan, bu protokol kanser, alerji, transplantasyon ve otoimmünite fare modellerinde bağırsak bağışıklık popülasyonlarının incelenmesi için yararlı olabilir.

Bu protokolün verimini ve verimliliğini optimize etmek için, önemli çözümlerin ve malzemelerin önceden hazırlanması tavsiye edilir. Fare ötenazi ve dikey bir orta hat kesi yaptıktan sonra, periton açmak için ince diseksiyon makas kullanın. Forceps kullanarak, bir tarafa ince bağırsak hareket ve azalan kolon ortaya çıkarmak.

Kolon rektal kısmını maksimum maruz bırakmak için azalan kolon üzerinde hafifçe yukarı çekin. Daha sonra, pelvis derin distal rektum kesmek ve sekal kap distal rektum bir birim olarak tüm kolon incelemek. İlk olarak, nemlendirilmiş bir kağıt havlu üzerinde kolon yerleştirin ve bağırsak duvarına hafif basınç uygulamak ve katı dışkı ayıklamak makas veya forceps bir çift künt ucunu kullanın.

Sonra, bir petri kabında kolon yerleştirin ve soğutulmuş kolon tampon 10 mililitre ile bağırsak floş için 18-gauge künt dolgulu iğne ile 10 mililitreşli şırınga kullanın. Bir petri kabına bir petri kabına yerleştirin 5-10 soğutulmuş kolon tampon mililitre ve kalan kolon içeriğini yıkamak için elle ajite. Her yıkama için taze tampon içeren yeni bir petri kabı kullanarak bu yıkamayı 2-3 kez tekrarlayın.

Bundan sonra, taze soğutulmuş kolon tampon içeren yeni bir petri kabına kolon aktarın. Tek bir dikdörtgen açık kolon parçası oluşturmak için, proksimal kolon için daha kasrekrek sonundan uzunlamasına kolon kesin. Çanak ortanca atın ve temiz soğutulmuş kolon tampon ile değiştirin.

Kolon tampon ile nemlendirilmiş bir kağıt havlu üzerine dikdörtgen kolon doku yerleştirin ve yatay ve daha sonra küçük parçalar halinde dilimleyerek kesti. Soğutulmuş kolon tampon 20 mililitre içeren 50 mililitrelik polipropilen konik tüp içine kolon parçaları toplamak için ince forceps kullanın. Daha sonra, 30 saniye boyunca güçlü bir şekilde tüpü döndürerek parçaları yıkayın.

Yıkamadan sonra, doku parçaları decanting veya vakum supernatant aspirating önce tüpün altına yerleşmek izin, Doku parçaları kaybetmeönlemek için emin olun, her yıkama için taze kolon tampon kullanarak bu tüm yıkama işlemini 3 kez tekrarlayın. Başlamak için, yıkanmış kolon parçaları içeren tüp kollajenaz sindirim tampon 20 mililitre ekleyin. Tüpü kapatın ve 60 dakika boyunca 2 kez G dönüş hızı ile 37 santigrat derecede bir yörünge shaker yerleştirin.

Ajitasyon sırasında doku parçalarının sürekli hareket halinde olduğundan emin olun. İlk olarak, 3 ayrı 15 mililitre polipropilen tüplerin her içine% 66 silika bazlı yoğunluk ayırma medya 5 mililitre dökün. Sonra, Kollajenaz Sindirim 1 sadece supernatant toplamak için 25 mililitre serolojik pipet kullanın.

Temiz bir 50 mililitrelik polipropilen konik tüp içine yerleştirilen 40 mikrolitre zayıf filtrasyon kumaş hücresüzlük süzgeç ile supernatant filtre. Kollajenaz sindirim tampon uğrama için soğutulmuş kolon tampon ile tüp tamamen doldurun. Sonra hücreleri döndürün, süpernatant aspire, ve buz üzerinde pelet tutmak.

Metin protokolünde belirtildiği gibi Kollajenaz Sindirim 2 gerçekleştirmeye devam edin. Kollajenaz Sindirim 2 tamamlandıktan sonra, 18-gauge künt uç iğne ile tüp ve 10 mililitreşli şırınga arasında şiddetle ileri ve geri doku parçaları floş. En az 7-8 pasajlar için bu floş tekrarlayın, hiçbir brüt doku parçaları veya enkaz görünür kadar devam.

Daha sonra, temiz bir 50 mililitrelik polipropilen tüp içine yerleştirilen 40 mikrometre zayıf filtrasyon kumaş hücresüzlük süzgeç yoluyla doku ayrıştırma süspansiyon geçmek. 5 dakika boyunca 4 santigrat derecede 800 kez G de sindirim ve santrifüj söndürmek için soğutulmuş kolon tampon ile kenarına tüp doldurun. Vakum aspirasyon yoluyla supernatant atın ve ilgili tüp kollajenaz Sindirim 1 re askıya pelet çekin.

Bundan sonra, kolon başına% 44 silika bazlı yoğunluk ayırma medya 24 mililitre her pelet askıya. %66 silika bazlı yoğunluk ayırma ortamı içeren 3 tüpün her birine bu ortamın 8 mililitresini yavaşça katmanlamak için 10 mililitrelik serolojik pipet kullanın. Bir tartma terazisi veya bir denge kullanarak santrifüj kovaları içindeki tüpleri dikkatlice dengeleyin.

Santrifüj 859 kez G 20 santigrat derece de 20 dakika ara vermeden. Degrade arabirimindeki hücreleri bozmamaya özen tarak, tüpleri çıkarmadan önce roders dinlenmek için gelmek için izin verin. İlk olarak, genellikle 1-2 mililitre kalınlığında beyaz bant mevcut olan 5 mililitrelik işareti, yakın degrade arayüzü görselleştirin.

Vakum aspire ve arayüze daha kolay pipet erişim sağlamak için degrade üst 7 mililitre atın. Sürekli manuel emme ve sürekli dönen bilek hareketi kullanarak, hücrelerin arayüz katmanını toplayın. İki degrade arasındaki arayüz açık olana ve refractile olana kadar toplayın ve arayüzü yeni bir 50 mililitrelik polipropilen konik tüpe aktarın.

Ardından, toplam süspansiyon 50 mililitreye ulaşana kadar bu küvete FACS Tampon ekleyin. Santrifüj 800 kez G 4 santigrat derecede 5 dakika. Daha sonra, vakum aspirasyon yoluyla supernatant aspire ve FACS Tampon 1 mililitre pelet askıya.

Bu videoda açıklanan prosedür kolon mononükleer hücreleri izole etmek için kullanılabilir veya, değişiklikler ile, ince bağırsak. Ayrıca, izolasyon için Kollajenaz E veya D kullanırken apoptotik ve nekrotik/ölü lenfositlerin fraksiyonlarını karşılaştırmak için sitometri ve veri analizi yapılır, dnase olmadan 1 tedavi. Annexin 5 ve her izolasyon dan sonra tek hücreli süspansiyonlar üzerinde düzeltilebilir canlı ölü mavi boya boyama aşağıdaki, DNAE olmadan Kollajenaz E dnaase olmadan Kollajenaz D ile karşılaştırıldığında izolasyon sonrası canlı hücrelerin önemli ölçüde daha yüksek bir yüzdesi gösterdi.

Hatta dnase ile ya kollajenaz ile karşılaştırıldığında. Buna ek olarak, Kollajenaz E grubunda %41.0 ortanca yüzdesinde nekrotik hücreler saptandı, Kollajenaz D grubunda ise %90.0. Kollajenaz E DNaase grubunda %75.9 ve Kollajenaz D DNae grubunda %80.3.

Multi perimetrik akış sitometrisi, BMT veya allojenik veya syngeneic BmT modellerini aldıktan sonra 7. BmT alıcının kolon çıkarılan Donör CD4 pozitif ve CD8 pozitif T-hücrelerinin ortalama mutlak numaraları hesaplanır ve karşılaştırılır. Bu nedenle bu tür fare modellerinde nadir bulunan bağışıklık hücre popülasyonlarını belirlemek ve/veya quantitate etmek önemli olabilir.

Donör kaynaklı FOX-P3 pozitif T düzenleyici hücreleri de dahil olmak üzere nadir alt kümeler hem syngeneic hem de allojenik BmT modellerinde değerlendirilir. Bu yöntem kullanılarak, bmt'den sonra alıcı fare kolonuna sızan donör türetilmiş kolon T düzenleyicisi gibi nadir alt kümeler bile analiz edilebilir. Bu Kollajenaz E 37 santigrat derece aktif olduğu unutulmamalıdır.

Yani tüm kollajenaz çözeltileri yeterli kollajenaz aktivitesi için önceden ısıtılmış ve iyice aktiviteyi sona erdirmek için söndürdün olmalıdır. Bu protokol, fleur sitometri, moleküler biyoloji teknikleri, mikroskopi, kültür ve diğerleri arasında daha sonraki karakterizasyonu için kullanılabilecek mononükleer hücrelerin çok sayıda sağlar. Bu protokol, kemik iliği nakli modelinde deneysel ve kontrollü farelerin kolondaki iltihabın güvenilir bir değerlendirmesini sağlamıştır.

Böylece organ nakli toleransı yeni düzenleyici bağışıklık mekanizmalarının keşfini kolaylaştırıyor. Clostridium Istoliticum kollajenaz laboratuvar güvenlik teknikleri ile ele alınması gereken bir reaktif olduğunu. Solunduğunda sağlık açısından tehlike oluşturur ve cilt ve göz tahrişine neden olabilir.