Bir besleyici içinde ınsan pluripotent kök hücrelerinden hemogenik endotelyum farklılaşma-ve Xeno-ücretsiz tanımlı koşul

Biz insan pluripotent kök hücrelerinden kan hücreleri üretmek sunuyoruz. Bu tekniğin en büyük avantajı hemojenik endotel hücrelerinin tutarlı ve kesin verimleri elde olmasıdır. Platformumuzun tedavi edici bileşikler için hastalık izleme ve tarama da geniş uygulamalara olanak sağlamasını bekliyoruz.

Bu teknik özellikle hematoloji ve immünoloji araştırmaları için faydalıdır. Bu yöntem insan kan hücrelerinin genetik müdahalesi veya gen düzenlemesi için uygulanabilir. Hemojenik endotel hücrelerinde vektörlerin kolay indüksiyonuna olanak sağlar.

En önemli nokta PSC kolonileri yazmak için LM511-E8 kaplama. Kaplamayı atlamanızı veya başka bir matrisle değiştirmenizi önermiyoruz. Görsel gösteriler önemlidir, çünkü hücreleri bir dissosiasyon arabelleğiyle nasıl durulamagösterebileceğimizi ve lm511-E8 ile plakaların nasıl kaplanabileceğimizi göstermek isteriz.

MTeSR1 orta bir LM511-E8 kaplı altı kuyuplaka üzerinde% 70 ve% 80 biraraya gelirken insan pluripotent kök hücreleri veya hPSCs büyümek. Hemojenik indüksiyondan dört gün önce, orta yı aspire edin ve PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri ayrıştırma solüsyonuyla durulayın ve 37 derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın.

PSC bakım ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın ve süspansiyonu 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri 200 kez G'de üç dakika santrifüj edin. Supernatant aspire ve PSC kaplama ortamda hücreleri resuspend.

Bir mikrofabrikasyon plastik kap üzerine el yazması talimatlara göre PSC süspansiyon plaka, ve gece kuluçka. Hemojenik indüksiyondan üç gün önce PSC küresel leri 15 mililitrelik konik bir tüpe hafifçe pipetleyin ve yerçekimine göre çökeltmek için oda sıcaklığında iki dakika bekletin. Supernatant aspire ve küresel kaplama ortamda küresel askıya.

Süspansiyonu lm511-E8 kaplamalı 10 santimetrelik kültür yemeğine santimetre kare başına dört küresel likte dağıtın ve üç gün boyunca kuluçkaya yatırın. Üç gün sonra, orta aspirate, gün sıfır farklılaşma orta ekleyin ve kültür iki gün boyunca bir hipoksik kuvöz hücreleri. Sonra, gün sıfır orta aspire, gün iki farklılaşma orta ekleyin ve başka bir iki gün için kültür.

İki gün sonra, orta aspire ve PBS ile iki kez hücreleri yıkayın. Hücreleri ayrıştırma solüsyonuyla durulayın ve %5 karbondioksitle 37 derecede 30 dakika kuluçkaya yatın. Kuluçkadan sonra, hücreleri bir milimolar EDTA'da hafifçe yeniden sulandırarak ayırın.

Süspansiyonu 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve hücreleri 200 kez G'de üç dakika santrifüj edin. Süpernatant aspire ve manyetik ayırma tampon 300 mikrolitre ile hücre pelet resuspend. Hücrelere 100 mikrolitre CD34 pozitif mikroboncuk ekleyin ve pipetleme ile hafifçe karıştırın.

30 dakika oda sıcaklığında kuluçka, sonra süspansiyon zorlanma ve manyetik ayırıcı kullanarak CD34-pozitif hücreleri ayırmak için 40 mikrometre hücresüz kullanın. 24 kuyukültür plakasının her bir kuyusuna mililitre başına 5 mikrogram lık 0,5 mililitre fibronektin kaplama çözeltisi verin ve tabağı oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Bu arada, üç dakika için 200 kez G sıralanmış CD34-pozitif hücreleri santrifüj ve EHT orta bir mililitre pelet resuspend.

Bir hücre sayacı ile canlı hücre yoğunluğunu belirleyin ve Hücre yoğunluğunu EHT ortamı ekleyerek mililitre başına 200.000 hücreye ayarlayın. Kaplama çözeltisini fibronektin kaplı kuyulardan aspire edin ve atın ve her kuyuya 0,5 mililitre CD34 pozitif hücre süspansiyonu dağıtın. Hipoksik kuvözdeki hücreleri bir hafta kuluçkaya yatırın.

Yüzen hücreleri toplamak için, kültür ortamını 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve 200 kez G'de üç dakika santrifüj edin. Sonra supernatant aspire. Yapışık hücreleri toplamak için, 0,5 mililitre PBS ile iki kez yıkayın ve ayrıştırıcı tampon ile durulayın.

Fazla sıvıyı aspire edin ve plakayı 37 derecede beş dakika kuluçkaya yatırın. Facs tampon bir mililitre hücreleri resuspend ve yüzen ve yapışık hücreleri karıştırın. Karışık hücreleri 200 kez G'de üç dakika santrifüj edin, sonra süpernatantı aspire edin ve 50 mikrolitre Facs tamponundaki hücreleri yeniden askıya alın.

Facs tampon 50 mikrolitre anti-CD34 ve anti-CD45 antikorları seyreltmek;hücrelere ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında bir saat boyunca hücreleri kuluçka. Daha sonra hücreleri PBS ile iki kez yıkayın, her yıkamadan sonra üç dakika boyunca 200 kez G'de santrifüj edin. Süpernatant aspire ve mililitre dappy başına 0,5 mikrogram facs tampon 0.5 mililitre hücreleri resuspend.

Cd34 ve CD45 ifadesini akış sitometrisi ile ölçün. Hematopoetik hücreleri toplamak için, 15 mililitrekonik tüp kültür ortamı aktarın. PBS ile kuyuyu iki kez hafifçe durulayarak kalan hücreleri toplayın.

Hücreleri 200 kez G'de üç dakika santrifüj edin, sonra süpernatantı aspire edin ve bir mililitre EHT ortamında yeniden askıya alın. Hücreleri sayarak sonra, metilselüloz aralıklı medya üç mililitre için 10, 000 hücre ekleyin, antibiyotikler ile takviye, ve beş kez karıştırmak için 16 gauge şırınga kullanın. Altı kuyulu bir plakanın her kuyunun içine tüm medya süspansiyonu dağıtın.

Hücreleri nemli tutmak için, plaka üzerindeki boş kuyulara su veya PBS ekleyin. Koloniler harekete duyarlı olduğu için kabı rahatsız etmemeye dikkat ederek hücreleri iki hafta kuluçkaya yatırın. İki hafta sonra kolonileri mikroskop altında say.

Hücre morfolojik hematopoetik kokteyl ile stimülasyon üzerine endotel lerden hematopoetik hücrelere değişir. Hematopoetik hücre kolonileri kültürde ortaya çıkar. Hematopoetik atahücreleri CD34 ve CD45 ifade, bu nedenle akış sitometri CD34 ve CD45 ekspresyonu analiz ederek hematopoetik hücre kolonilerinin varlığını doğrulamak için kullanılır.

Koloni oluşturan birim testi, CD34-pozitif ve CD45-pozitif hematopoetik atahücrelerinden granülosit veya makrofaj kolonilerinin neslini gösterdi. Koloni sayısının her 10.000 hücrede 38 koloni oluşturan birim olduğu tahmin edilmektedir. En önemli adımlar PSC küresel spheroidleri solmaktır.

Yüzey ölçümünün bu protokolün verimliliğinde en belirleyici faktör olduğunu bulduk. Bu yordamı, doğal olarak oluşan hücreler ve makrofajlar gibi inerjik hücrelerin off-the-raf üretimi takip edilebilir. Bu platform araştırmacılar ın insan hematopoetik gelişiminde ki temel deterministik faktörleri keşfetmelerine olanak tanır.