Fareler içinde ateroskleroz ölçümü
June 12th, 2019
Ateroskleroz murine modelleri, moleküler düzeyde patojenik yolları araştırmak için yararlı araçlardır, ancak lezyon gelişimi için standartlaştırılmış bir ölçmek gerektirir. Bu protokol, aort kökü, Aort kemer ve brachioksefalik arter dahil olmak üzere ana arter damarlarında lezyon boyutunu belirlemek için optimize edilmiş bir yöntem açıklanmaktadır.
Kardiyovasküler hastalık küresel ölüm ana nedenidir. Fare modelleri bu hastalığı incelemek için yararlı araçlardır ve protokolümüz farelerde ateroskleroz ölçmek için kullanılabilir. Bu protokol kullanılarak lezyon büyüklüğü üç vasküler yerde ölçülebilir.
Aort kökü, aort kemeri ve brakiyosefalik arter. Farelerde ateroskleroz un ölçülmesi sıkıcı bir görev olabilir. Süreci hızlandırabileceğini umduğumuz ayrıntılı adımlar attık.
Bu adımlardan bazılarını yazılı olarak açıklamak zordur. Biz bu video sağlam aterosklerotik lezyon boyutu analizi elde size yardımcı olacağını umuyoruz. Standart protokollere göre bir fare kalp hasat sonra, bir mantar yatak üzerinde kalp yerleştirin, bir diseksiyon mikroskop altında ventral tarafı ve apeks aracılığıyla mantar için kalp düzeltmek için bir iğne kullanın.
Anatomik forseps ile kalbin tabanını tutarak, sagital düzlemde caudally 20 derecelik açıda düzenlenen bir neşter kullanın, ve transversal düzlemde 20 derece kranial, kalbin apikal üçte ikisini kesmek için. Optimum kesme sıcaklığı bileşik aort kökü ve kalbin tabanını gömmek veya OKT, ve yavaşça bileşik ile aort kökü doldurmak ve herhangi bir hava kabarcıkları kaldırmak için forceps ile kalp sıkmak. Örneği, aort kökü dik olarak alt yüzeye dik olan OCT ile dolu bir kriyomoldun dibine aktarın ve bileşimi kuru buz üzerinde dondurun.
Daha sonra doku örneğini dondurucu torbasında eksi 80 derecede kriyokesit e kadar saklayın. En yüz analizi için bir sabitleme yatağı hazırlamak için, düz bir 25 x 25 mm yüzey yapmak ve aort için koyu bir arka plan yapmak için film etrafında siyah elektrik yalıtım bandı sarın parafin balmumu film sekiz kez bir segment katlayın. Sabitleme yatağının arka tarafına bir etiket yerleştirin ve fare kimlik numarasını kaydetmek için kurşun kalem kullanın.
Sabitleme yatağına aort kemer iaktarın ve dokuya PBS bir damla ekleyin. Stereo mikroskop kullanarak, kalan periadventiyal yağ dokusundan aortu temizleyin ve vannas makasını ve Dumont forceps'u kullanarak aortu manipüle etmeden veya zarar vermeden çevredeki tüm yağ dokusunu nazikçe soyup kullanın. Daha sonra, intimal yüzeyi ortaya çıkarmak için aort lümen içine Vannas makas tanıtmak.
Distal yönde yükselen kemer dış eğrilik kesme başlayın, brakiyosefalik arter de dahil olmak üzere dalları açık kesmeye devam ve azalan torasik bölgenin dorsal kısmı koruyucu. Intimal yüzeyi görüntülemek için, daha az eğriliği açın ve aort açık katlayın. Mikro Castroviejo iğne tutucusu kullanarak, numuneyi germeden, numuneyi germeden, doku yerinde tutulurken pimleri numuneden hafifçe bükerek, açık kemeri sabitleme yatağına sabitleyerek sabitletir.
Sonra dört santigrat derece PBS bir Petri çanak iğneli kemer yüzüstü saklayın. Sudan IV boyama için, numuneyi sudan IV çalışma solüsyonuna yedi dakika boyunca aktarmadan önce, numuneyi kemer aşağı bakacak şekilde %70 etanollü bir Petri kabında beş dakika durulayın. Kuluçka sonunda, normal intimal yüzeyi lekeden arındırmak için %80 etanolte iki üç dakikalık yıkama ile numuneyi durulayın ve ardından dokuyu orijinal Petri kabına geri döndürmeden önce PBS'de son bir durulama yapın.
Daha sonra 10X büyütme de dijital kameraya bağlı bir stereo mikroskop altında mikrograflar elde, PBS batık iğnelenmiş kemer görüntüleri elde, Petri çanak altına sabitleme yatağı tutmak için küçük metal ağırlıkları kullanarak. Gömülü aort kökünün kriyokesitlerini elde etmek için kriyostat sıcaklığını eksi 20 dereceye, kesit kalınlığını da 10 mikrometreye ayarlayın. Ventriküler doku dışa bakacak şekilde numune tutucuüzerinde aort kökünü içeren OCT bloğunu monte edin.
Gerekirse bazı ek OCT ile konumlandırma güvenli. Aort kökü artık bıçak dik konumlandırılmalıdır. Sıradan mikroskop slaytlar üzerinde kalp kas dokusu içeren ilk kontrol bölümleri toplamak, bir ışık mikroskop altında doku ile ilerlemesini kontrol 200 mikrometre.
İlk aort cusp göründüğünde, kesit düzlemini diğer iki tepeyle hizalamak için örneği sıfır noktasına doğru yatırın ve sıfır noktasından itibaren kesilen her 10 mikrometrelik bölümü sayın. Planlanan slayta göre 90 mikrometreden ve ileriye doğru analiz için bölümleri toplamaya başlayın, ta ki sıfır noktasından 800 mikrometreye ulaşılınana kadar. Aort kökündeki toplam damar alanının lezyon fraksiyonunun hesaplanması, verilerin kesit leme sırasında olası açı farklılıklarına karşı daha az duyarlı olmasını sağlar.
Buna ek olarak, eğri nin altındaki alanı veya fare başına atheroto lezyon boyutunu hesaplamak ve gruplar içindeki bireysel varyasyonları daha fazla görselleştirmek için verileri nokta çiziminde sunmak açıklayıcı olabilir. Lezyonal lipid birikimi, toplam lezyon alanının renk eşikli yağı kırmızı O pozitif alanları ile ölçülebilir. Sağ ve sol koroner arterler genellikle aort sinüs yaklaşık 250 mikrometre aort farklılaşmak genellikle en belirgin lezyon boyutları ile çakışıyor.
En face aort kemerlerinin temsili görüntülerinde koyu arka plan kaldırılması görsel ekran artırabilir. Lezyon boyutu genellikle gruplar içinde dağıtılır ve öğrencinin gruplar arasındaki t-testi kullanılarak istatistiksel analize izin verilir. Deneysel numunelerinizi işlemek için yeterli beceri elde edene kadar bazı test materyalleri ile pratik yapmanızı öneririz.
Lezyon boyutu gruplar arasında farklıise, mekanizmayı belirlemeniz gerekir, çünkü lezyon kompozisyonu analizi genellikle takip etmek için bir sonraki adımdır.
Genel Bakış
Bu protokol, aterosklerotik lezyon boyutunun fare modellerinde niceliği için optimize edilmiş bir yöntemi tasvir eder ve aort kökü, aort arkı ve brakiosefalik arter gibi büyük arter damarlarına odaklanır. Sağlanan detaylı adımlar, genellikle sıkıcı ve karmaşık olabilen nicelleştirme sürecini hızlandırmayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Kardiyovasküler araştırma
- Patoloji
Arka Plan
- Kardiyovasküler hastalık dünya genelinde önde gelen ölüm nedenlerindendir.
- Fare modelleri ateroskleroz çalışmaları için esastır.
- Standartlaştırılmış nicelleştirme yöntemleri doğru analiz için gereklidir.
- Lezyon boyutu ölçümü, hastalık ilerleyişini anlamak için kritiktir.
Çalışmanın Amacı
- Fare aterosklerotik lezyonlarını ölçmek için standartlaştırılmış bir protokol sağlamak.
- Lezyon boyutu nicelleştirmesinin doğruluğunu ve verimliliğini artırmak.
- Ateroskleroz mekanizmaları hakkında daha fazla araştırmayı kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Fare kalplerinin hasat edilmesi ve analiz için hazırlanması.
- Dokunun optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğinde gömülmesine.
- Aort arkının en face analizini gerçekleştirmek.
- Lipid birikimlerini görselleştirmek için Sudan IV boyama kullanımı.
Ana Sonuçlar
- Aterosklerotik lezyonları hazırlamak ve analiz etmek için detaylı adımlar.
- Lezyon fraksiyonunu ve eğrinin altındaki alanı hesaplama yöntemleri.
- Lezyon boyutlarını karşılaştırmak için istatistiksel analiz önerileri.
- Sonuçların daha iyi temsil edilmesi için görsel geliştirme teknikleri.
Sonuçlar
- Protokol, fare modellerinde aterosklerozu nicelleştirmek için güvenilir bir yöntem sunar.
- Standartlaştırma, araştırmada tekrarlanabilirliği ve doğruluğu artırır.
- Lezyon karakteristiklerini anlamak, gelecekteki terapötik stratejiler için bilgi sağlayabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantitative lesion analysis in murine atherosclerosis models is critical for de-risking early cardiovascular targets and validating mechanistic hypotheses. Standardized measurement of lesion size across key vascular sites enables reproducible, cross-study comparisons and supports predictive confidence in preclinical discovery. This protocol's integration of multi-site quantification and statistical rigor positions it as a foundational tool for cardiovascular drug discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust interrogation of therapeutic hypotheses related to cholesterol and inflammation in atherosclerosis.
- Supports functional target validation by quantifying lesion burden in genetically modified mouse models.
- Facilitates biological de-risking through standardized, reproducible lesion measurement across multiple vascular sites.
- Provides quantitative endpoints for portfolio triage and early go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated murine systems for downstream compound screening and mechanistic studies.
- Standardizes lesion quantification, reducing experimental variability and enhancing reproducibility.
- Generates quantitative outputs (lesion fraction, area under the curve) suitable for comparative analysis.
- Enables reliable evaluation of candidate interventions in preclinical models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical endpoints with disease-relevant vascular sites for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement by providing quantitative, statistically analyzable data.
- Facilitates mechanistic de-risking by enabling lesion composition and lipid accumulation analysis.
- Enhances predictive value for downstream biomarker and efficacy studies.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol anchors the early discovery-to-preclinical continuum by providing standardized, quantitative lesion analysis in murine models of atherosclerosis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying lesion size in response to genetic or pharmacological perturbations.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative lesion measurements for cross-group comparisons and assay readiness.
- Analytics: Enables statistical analysis (e.g., Student's t-test) of lesion size distributions and group differences.
- Translational Research: Connects preclinical findings to clinical endpoints by focusing on disease-relevant vascular sites.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable, standardized workflow for cardiovascular target validation and mechanistic studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiovascular target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of lesion quantification workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by providing robust, quantitative endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of cardiovascular discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine cardiovascular dissection and histological analysis.
- Needs access to cryosectioning equipment, stereo microscopy, and digital imaging infrastructure.
- Demands cross-team standardization of lesion measurement and statistical analysis protocols.
- Adaptation may be needed for different mouse strains or genetic backgrounds.
- Careful training and practice are essential to minimize technical variability and ensure data quality.
