Name: Vesiculo da otonom vezikül büyümesi için peptid membran öncülerinin sentezini (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-28T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Keşfedin, film rehidrasyonu ve cam boncuklar kullanarak peptit bazlı küçük unilamellar veziküller oluşturma yöntemini. Hassas biyolojik örnekleri koruyarak otonom membran büyümesi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz minnetle DFG TRR 235 (yaşam doğuşu, proje P15), Avrupa Araştırma Konseyi (Grant anlaşması No. 694410 AEDNA) ve TUM Uluslararası Enstitüsü bilim ve mühendislik ıGSSE (Proje No. 9,05) aracılığıyla mali destek kabul . Biz örnek hazırlama ile onun yardımı için E. Falgenhauer teşekkür ederiz. TX-TL sistemi ve yararlı tartışmalar konusunda yardım almak için A. Dupin ve M. Schwarz-Schilling ' e teşekkür ederiz. Biz yararlı tartışmalar için N. B. Holland teşekkür ederiz.

1. elastin-benzeri polipeptitlerin ifadesi
<ol><li>1. gün: başlangıç kültürünün hazırlanması ve peptit ifadesi için sarf malzemeleri
	<ol>
<li>Hazırlamak ve otoklav ifade kültürü şişeler (4 x 2,5 l) ve 3 L lb orta. 1 l lb orta için 1 l ultra saf su lb toz 25 gr ekleyin.</li>
		<li>100 ml lb orta, 50 μL steril filtre (0,22 μm filtre) kloramfenikol çözeltisi (EtOH 'da 25 mg/ml) ve 50 μL steril filtreli (0,22 μm filtre) karbenikilin çözeltisi (100 mg/ml,% 50 EtOH ve% 50 ultra saf su) ile bir Starter kültürü hazırlayın.</li>
		<li>E. coli strain bl21 (de3) plyss ile pET20b (+) ifade vektör polypeptid DIZISI MGHGVGVP ((GEGVP)4(Gvgvp) 4 ((gfgvp) 4 (gvgvp))3 içeren bir önceden yapılmış bakteriyel stok küçük bir çizgi ekleyin (Gfgvp)4GWP (EF olarak kısaltılmış), ön ısıtılan 100 ml marş kültürüne ve 37 °c ' de 16 h ile, bir sallayarak Kuluçl (E. coli suşları ve vektörler talep üzerine kullanılabilir) ile 250 rpm için inküyasyon.</li>
		<li>Ön-sıcak ifade kültür şişeler ve lb medya 37 ° c gece böylece onlar ertesi gün için hazırlanır.</li>
	</ol></li>
	<li>2. gün: protein ifadesi
	<ol>
<li>750 ml her ifade kültürü Flask, 375 μL steril filtre (0,22 μm filtre) kloramfenikol stok (25 mg/ml EtOH) ve 375 μL steril filtre (0,22 μm filtre) karbenikilin stok (100 mg/ml% 50 EtOH ve% 50 ultra saf su) ekleyin.</li>
		<li>Antibiyotik dağıtmak için ajitasyon sonra, 600 Nm (OD600) optik yoğunluk ölçümü için bir referans örnek olarak medyanın 2 ml alın.</li>
		<li>İfade Flask için başlangıç kültürü 7,5 mL ekleyin ve 250 rpm ile 37 °C ' de 1 h için inküye.</li>
		<li>Bu adımda her Flask OD600 her 20 dk kontrol edilecektir sonra.</li>
		<li>Optik yoğunluk yaklaşık 0,8 ulaştığında sıcaklığı 16 °c ' ye düşürebilir ve her ifade Flask içine ultra saf suda 750 μL 1 M steril filtrelenmiş β-isoprohacim thiogalactoside (IPTG) ekleyerek peptid ifadesine neden olur.</li>
		<li>250 rpm ile 16 h için 16 °C ' de indüklenen bakteriler ile ifade Flask kuluçk.</li>
	</ol></li>
	<li>3. gün: ifade edilen polipeptit ekstraksiyonu
	<ol>
<li>Hasat sonrası hücre peletleri kütlesinin belirlenmesini sağlamak için santrifüjleme Flask ön tartın.</li>
		<li>4.000 x g ve 4 °c ' de ön soğutmalı santrifüjle 20 dakika santrifüj yoluyla ifade flsordan tüm bakterileri topla.</li>
		<li>Süpernatant dökün ve steril bir kağıt havlu üzerinde santrifüj şişeler leke.</li>
		<li>Santrifüjleme flsorlar tartmak ve hücre Pelet kütlesi hesaplayın.</li>
		<li>750 mL 'Lik orijinal hücre kültüründen, pipetleme ile 15 mL fosfat-tamponlu tuz (PBS, pH 7,4) içinde ve 4 °C ' de 20 dakika için 4.000 x g 'de Santrifüjden aşağı Pelet edilen hücreleri resuspend. Süpernatant dökün ve steril bir kağıt havlu üzerinde santrifüj şişeler leke.</li>
		<li>PBS (pH 7,4) kullanarak 1 gram hücre peleti başına 2 ml tampon içinde lizis adım için hücre peleti resuspend lizozim (1 mg/ml), 1 mm phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF), 1 mm benzamidin ve 0,5 U DNase ı ile desteklenmektedir.</li>
		<li>Bir sonicator ile buz üzerinde daha fazla lizis için hücreleri sonikat 8 W için 9 dakika alternatif 10 s sonication ve 20 s duraklatma adımları, izleyen bir 9 dakika duraklama sırasında örnek buzda soğutulması gereken. Bir kez daha 9 dk sonication adım tekrarlayın.</li>
		<li>Nüklik asit yağış için 1 L orijinal hücre kültürü başına% 10 (w/v) polileneimine (PEı) 2 mL ekleyin.</li>
		<li>Numuneyi 2 mL santrifüjli tüplere dağıtın ve 60 °C ' de 10 dk, 4 °C ' de 10 dakika boyunca inkübasyon yapın.</li>
		<li>Solüsyonu 4 °C ' de 10 dakika 16.000 x g 'de santrifüjle ve ELP 'yi içeren süpernatant topla.</li>
	</ol></li>
	<li>Ters sıcaklık Bisiklet ile protein arıtma:
	<ol>
<li>Peptit hidrofilik parçası hidrofobik geçiş ve toplama neden 2 pH için süpernatant ayarlayın. PH ayarlamak için, fosforik asit ve sodyum hidroksit kullanılır. pH çizgileri pH seviyesini belirlemek için yeterlidir.</li>
		<li>Numunenin arıtma verimi artırmak için, örnek 60 °C ısı ve 2 M 'ye kadar sodyum klorür ekleyin.</li>
		<li>Daha sonra, numuneyi 16.000 x g 'de Oda SıCAKLıĞıNDA (RT) 10 dakika santrifüjün.</li>
		<li>Süpernatant atın ve PBS içinde Pelet yeniden çözülür (ancak ilk hacminin sadece yarısı önceki adıma göre kullanılır).</li>
		<li>PH 'yi fosforik asit ve sodyum hidroksit ile 7 ' ye ayarlayın. pH çizgileri pH belirlemek için yeterince doğrudur.</li>
		<li>Numuneyi daha sonra 16.000 x g 'de 4 °c ' de 10 dakika santrifüjine atın.</li>
		<li>Süpernatant toplayın ve adımlar 1.4.1 Repeat-1.4.6 kadar 3x toplam, adım 1.4.4 son tekrarı dışında, sadece su PBS yerine eklenir.</li>
		<li>Bir emilim spektrometresi ile peptidler konsantrasyonu ölçmek. 280 nm de 5500/M/cm tükenme katsayısı kullanın.</li>
		<li>700 μM ' ye kadar ELP konsantrasyonunu ayarlayın.</li>
	</ol></li>
</ol>2. cam boncuk yöntemi kullanarak vezikül üretimi
<ol><li>Bir santrifüj vakum konsantratörü kullanarak 1,1 mM ELP çözeltisi konsantre.</li>
	<li>Konsantre ELP çözeltisi 200 μL 'i 1.250 μL, 2:1 kloroform/metanol karışımı ile karıştırın ve sonra da vorosimetif.</li>
	<li>10 mL yuvarlak alt Flask için 1,5 g küresel cam boncuk (212 – 300 μm boyutunda) ekleyin.</li>
	<li>ELP ve kloroform/metanol karışımı içeren çözüm yuvarlak alt Flask ve mix nazik sallayarak ile ekleyin.</li>
	<li>Bir döner buharlaştırıcı için Flask bağlayın. Hızı 150 RPM 'ye ayarlayın ve sıvı oda sıcaklığında buharlanıncaya kadar yaklaşık 4 dakika için-0,2 x 105 PA (-200 mbar) basıncını düzenler.</li>
	<li>Kalan kloroform ve metanol Buharlaştırıcı sağlamak için en az 1 h için bir kurutucu içine yuvarlak alt Flask yerleştirin. Cam boncuk kaybını önlemek için, gevşek ekli alüminyum folyo yuvarlak alt Flask açılış etrafında sarılmış olmalıdır.</li>
	<li>Tek bir deney için mix 100 PBS gibi şişme çözeltisi 60 μL ile peptid kaplı cam boncuk mg. Bu numuneyi 25 °C ' de 5 dakika boyunca kulbe etme</li>
	<li>Örnek hızlı bir masa üstü santrifüjle cam boncuklar tortu için santrifüj.</li>
	<li>Veziküller içeren süpernatant toplamak için bir pipet kullanın.</li>
</ol>3. veziküller Içinde RNA aptamer dBroccoli transkripsiyonu
<ol><li>Bir RNase-Free çalışma ortamı oluşturmak için RNase dekontaminasyon çözümünü içeren mendiller ile laboratuar tezgahını temizleyin.</li>
	<li>T7 promotor ve dbroccoli dizisini içeren ssDNA 'yı (5 μM) karıştırın (gagacggtcgggtccatctgagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcagatgtcgagtagagtgtgggctc), yanı sıra, kodlamayan Strand (5 μM) ile birlikte nuclease-ücretsiz su ile tamamlayıcı Rnapol reaksiyon tampon [40 mm Tris-HCL (pH = 7,9), 6 mm MgCl2, 1 mm ditiyotreitol (DTT), ve 2 mm spermidine], transkripsiyon reaksiyonu için DNA şablonu hazırlamak için.</li>
	<li>Çözeltinin 5 dakika boyunca 90 °C ' de 30 dakika boyunca 20 °C ' ye kadar yavaş bir sıcaklık azalmasına neden olur.</li>
	<li>Hazırlamak 1 mM (5Z)-5-(3, 5-difluoro-4-hidroxybenzylidene)-2, 3-dimetil-3, 5-dihydro-4H-ımidazol-4-One (DFHBI) çözeltisi DMSO 5 mL DFHBI 1,26 mg çözünerek.</li>
	<li>Rnapol reaksiyon tamponunu karıştırarak transkripsiyon reaksiyonu hazırlayın [40 mm Tris-HCL (pH = 7,9), 6 mm MgCl2, 1 mm ditiyotreitol (DTT) ve 2 mm spermidin] ile 125 mm KCL, 15 mm MgCl2, 4 mm rntp, 10 μM dfhbi, 200 Nm DNA şablonu, 0,5 U/μL RNase önleyici murine ve su.</li>
	<li>Reaksiyon başlamadan hemen önce, 4 U/μL T7 polimeraz ekleyin.</li>
	<li>Adım 2,7 şişlik çözeltisi olarak bu reaksiyon karışımını kullanın ve genellikle 1 saat olan deneme süresi için 37 °C ' de Inküye yapın.</li>
</ol>4. transkripsiyon-tercüme (TX-TL) reaksiyon
Not: Transkripsiyon-çeviri reaksiyonu için, bir ham hücre özü yanı sıra reaksiyon tampon ve DNA gereklidir. Ham hücre ekstresi Sun ve al.18' de açıklandığı gibi hazırlanır. TX-TL reaksiyonu için aşağıdakileri kullanın: 33% (v/v) ham E. coli özü, 42% (v/v) reaksiyon tamponu, ve% 25 (v/v) fenol-kloroform SAFLAŞTıRıLMıŞ DNA artı katkı maddeleri. Son konsantrasyonlarda yaklaşık 9 mg/ml protein, 50 mm HEPES (pH = 8), 1,5 mm ATP, 1,5 mm GTP, 0,9 mm CTP, 0,9 mm UTP, 0,2 mg/ml tRNA, 26 mm koenzim A, 0,33 mm nad, 0,75 mm kampı, 68 mm folinik asit, 1 mm spermidin , 30 mm Pep, 1 mm DTT,% 2 Peg-8000, 13,3 mm maltoz, 1 U T7 RNA polimeraz ve 50 nm plazmid DNA 'sı ultra saf suda.
<ol><li>
DNA şablonu fenol-kloroform arıtma
	<ol>
<li>5 ml lb orta ve 5 μL steril filtreli (0,22 μm filtre) karbenikilin çözeltisi (100 mg/ml,% 50 EtOH ve% 50 ultra saf su) ile altı gecelik kültür hazırlayın.</li>
		<li>DH5α E. coli içeren önceden üretilmiş bir bakteriyel stokta pET20b (+) ifade vektörü ile her ön ısıtılmış 5 ml gecede kültürüne küçük bir çizgi ekleyin ve 250 rpm ile 16 saat boyunca 37 °c ' de inküye yapın. Hangi peptit (EF) veya protein (YPet veya mVenus) ifade edilecek bağlı olarak, belirli bir kodlama Plasmid kullanılır.</li>
		<li>Kullanım kılavuzunda açıklandığı gibi veya Zhang ve al.24tarafından sağlanan Protokolü izleyerek Plasmid 'i bir mini-Prep kiti ile ayıklayın.</li>
		<li>Ön arıtılmış Plasmid DNA 'Sı 100 μL hazırlayın (konsantrasyon 200 – 600 ng/μL arasında yer alabilir) ve 100 μL roti-fenol/kloroform/isoamill alkol (pH = 7.5 – 8.0) ile karışımı daha iyi faz ayrımı sağlamak için bir mikrosantrifüjlü tüpte kullanabilirsiniz.</li>
		<li>Tüp 6 x 'e kadar yavaşça ters çevirin ve RT 'de 16.000 x g 'de 5 dakika santrifüj yapın.</li>
		<li>Tüpün üst aşamasına 200 μL kloroform ekleyin ve tüpü 6x 'e çevirin.</li>
		<li>Numuneyi 16.000 x g 'de 5 dakıka boyunca RT olarak Santrifüjü.</li>
		<li>Ayrı bir tüp için süpernatant pipet ve etanol yağış için 3 M sodyum asetat 10 μL ekleyin.</li>
		<li>1 mL-80 °C soğuk etanol ekleyin ve örneği 1 saat için-80 °C ' de saklayın.</li>
		<li>Numuneyi 4 °C ' de 15 dakika için 16.000 x g 'de Santrifüjü.</li>
		<li>Süpernatant decant ve eklemek 1 ml-20 °c soğuk 70% (v/v) etanol.</li>
		<li>16.000 x g 'de 4 °c ' de 5 dakika Santrifüjü.</li>
		<li>Pipetleme ile sıvıyı çıkarın. DNA Pelet rahatsız değil dikkatli olun.</li>
		<li>Kalan etanol Buharlık için yaklaşık 15 dakika RT at örnek saklayın.</li>
		<li>Örnek konsantrasyonunu yaklaşık 300 Nm 'ye ayarlamak için numunenin ultra saf suyu ekleyin, bu da 260 Nm 'de emilimi ile ölçülür.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
TX-TL reaksiyonu hazırlanması
	<ol>
<li>Hazırlanan ham hücre ekstresi ve buz üzerinde reaksiyon tampon çözüyor.</li>
		<li>Bir 60 μL reaksiyon karışımı için, plazmid DNA (Phenol-Chloroform) için 37,5 μL reaksiyon tampon ekleyin [50 mM HEPES (pH = 8), 1,5 mM ATP, 1,5 mM GTP, 0,9 mM CTP, 0,9 mM UTP, 0,2 mg/mL tRNA, 26 mM koenzim A, 0,33 mM NAD , 0,75 mM kampı, 68 mM folinik asit, 1 mM spermidin, 30 mM PEP, 1 mM DTT,% 2 PEG-8000, ve 13,3 mM maltoz), ardından da 28,7 μL ham hücre ekstresi eklenmesi. Son hacim için ultra saf su ile doldurun 58,8 μL.</li>
		<li>Reaksiyon başlamadan hemen önce, T7 RNA polimeraz çözeltisi 1,2 μL ekleyin ve numuneyi yukarı ve aşağı pipetleme ile karıştırın.</li>
		<li>Bu reaksiyon karışımını adım 2,7 bir şişlik çözeltisi olarak kullanın ve genellikle 4 – 8 saat olan deney süresince 29 °C ' de inküye yapın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. bakır katalizör Azide-alkyne Huisgen Cycloaddition aracılığıyla fluorophores ile elastin benzeri Polypeptides konjugasyon
<ol><li>DMSO 'da 20 mM NHS-azid bağlayıcı (γ-azidobutirik asit N-hidroxysuccinimide ester) solüsyonu hazırlayın.</li>
	<li>PBS (8 g/l NaCl, 0,2 g/L KCl, 1,42 g/L na2HPO4, 0,27 g/l K2hpo4, pH = 7,2) ve NHS-AZIDE (1,2 mM) ile ELP çözeltisi (600 ΜM) ile mix 250 μL ve RT 'de 12 saat boyunca inküye yapın.</li>
	<li>Numuneyi 10 kDa Dializ kasetinde yükleyin ve tuzları ve kalıntı NHS-Azide kaldırmak için 1 L ultra saf su içinde 12 h için 4 °c ' de saklayın.</li>
	<li>Aktif ELP 'yi (500 μM) alkyne-konjugasyonlu boya (500 μM), Cy5-alkyne veya Cy3-alkyne ile karıştırın.</li>
	<li>Bu numuneyi 1 mM TBTA (Tris (benzyltriazolylmethyl) Amin), 10 mM TCEP (Tris (2-karboksilil)-phosphine hidroklorür) ve 10 mM CuSO4 ile karıştırın ve 12 h Için 4 °c ' de Inküye yapın.</li>
	<li>Numuneyi 10 kDa Dializ kasetinde yükleyin ve 4 °c ' de 1 L 'de 12 saat boyunca ultra saf su ile saklayın, tuzları ve kalıntı alkyne-konjuyum boyaları çıkarın.</li>
	<li>Bu boya-modifiye ELPs Cy3 etiketli ELPs ve Cy5 etiketli ELPs bölüm iki peptidler benzer bir 1:1 karışımı kullanılır.</li>
</ol>

<ol><li>Chen, I. A., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinetic+study+of+the+growth+of+fatty+acid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles.</a> Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).</li>
<li>Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggered+gene+expression+in+fed-vesicle+microreactors+with+a+multifunctional+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).</li>
<li>Hardy, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-reproducing+catalyst+drives+repeated+phospholipid+synthesis+and+membrane+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).</li>
<li>Scott, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Free+Phospholipid+Biosynthesis+by+Gene-Encoded+Enzymes+Reconstituted+in+Liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes.</a> PLoS ONE. 11 (10), e0163058(2016).</li>
<li>Deamer, D. W., Barchfeld, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+macromolecules+by+lipid+vesicles+under+simulated+prebiotic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Evolution%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of macromolecules by lipid vesicles under simulated prebiotic conditions.</a> Journal of Molecular Evolution. 18 (3), 203-206 (1982).</li>
<li>Adamala, K., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonenzymatic+Template-Directed+RNA+Synthesis+Inside+Model+Protocells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nonenzymatic Template-Directed RNA Synthesis Inside Model Protocells.</a> Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).</li>
<li>Zhu, T. F., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+growth+and+division+of+model+protocell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Coupled growth and division of model protocell membranes.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (15), 5705-5713 (2009).</li>
<li>Kurihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-reproduction+of+supramolecular+giant+vesicles+combined+with+the+amplification+of+encapsulated+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA.</a> Nature Chemistry. 3 (10), 775-781 (2011).</li>
<li>Chu, H. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+an+elastin-like+polypeptide+%28ELP%29+in+a+cell-free+protein+synthesis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme+and+Microbial+Technology%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system.</a> Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).</li>
<li>Martino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Expression%2C+Aggregation%2C+and+Triggered+Release+from+Polymersomes+as+Artificial+Cell-like+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).</li>
<li>Vogele, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+synthetic+cells+using+peptide-based+reaction+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments.</a> Nature Communications. 9 (1), 3862(2018).</li>
<li>Huber, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+amphiphilic+proteins+as+building+blocks+for+the+intracellular+formation+of+organelle-like+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments.</a> Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).</li>
<li>McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product+purification+by+reversible+phase+transition+following+Escherichia+coli+expression+of+genes+encoding+up+to+251+repeats+of+the+elastomeric+pentapeptide+GVGVP%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP.</a> Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).</li>
<li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+chemistry+of+biological+free+energy+transduction+as+demonstrated+by+elastic+protein-based+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).</li>
<li>Urry, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin%3A+a+representative+ideal+protein+elastomer%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Elastin: a representative ideal protein elastomer.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).</li>
<li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally-responsive+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.</a> Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).</li>
<li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+synthesis+of+protein-based+polymers+with+precisely+specified+molecular+weight+and+sequence+by+recursive+directional+ligation%3A+examples+from+the+elastin-like+polypeptide+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system.</a> Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).</li>
<li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762(2013).</li>
<li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+2.3+mg%2Fml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li>
<li>Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., Mückl, A., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+communication+between+bacteria+and+cell-free+gene+expression+systems+within+linear+chains+of+emulsion+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical communication between bacteria and cell-free gene expression systems within linear chains of emulsion droplets.</a> Integrative Biology. 8 (4), 564-570 (2016).</li>
<li>Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+All+E.+coli+TX-TL+Toolbox+2.0%3A+A+Platform+for+Cell-Free+Synthetic+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).</li>
<li>Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes+and+polymersomes%3A+a+comparative+review+towards+cell+mimicking%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking.</a> Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).</li>
<li>Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broccoli%3A+Rapid+Selection+of+an+RNA+Mimic+of+Green+Fluorescent+Protein+by+Fluorescence-Based+Selection+and+Directed+Evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).</li>
<li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purifying+Plasmid+DNA+from+Bacterial+Colonies+Using+the+Qiagen+Miniprep+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 247(2007).</li>
<li>Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+light+scattering%3A+a+practical+guide+and+applications+in+biomedical+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları beyan.

Film rehidrasyon Küçük unilamellar veziküller oluşturulması için ortak bir işlemdir. Başarısızlık ana kaynağı prosedürde kullanılan malzemelerin yanlış işleme olduğunu.

Başlangıçta, ELPs E. coli hücreleri tarafından üretilmektedir. ELP arıtma sonrası verim önemli adımlarla protokolün ne kadar dikkatle gerçekleştirileceğinden bağlı olarak farklılık gösterebilir. Bunlar ters sıcaklık bisiklet (ıTC) adım ve yağış sonra E...

Sentetik canlı hücresel sistemlerin oluşturulması genellikle iki farklı yöne yaklaştı. Yukarıdan aşağı yöntemle, bir bakterinin genomu temel bileşenlerine düşer, sonuçta minimal bir hücreye yol açılır. Aşağıdan yukarı yaklaşımda, yapay hücreler, fonksiyonel olarak tutarlı bir hücre benzeri sisteme entegre edilmesi gereken moleküler bileşenlerden veya hücresel alt sistemlerinden de Novo monte edilir.
De Novo yaklaşımı, gerekli biyokimyasal bileşenlerin bölümlendirme genellikle fosfolipidler veya yağ asitleri1,2,3,4yapılan membranların kullanılarak elde edilir. Çünkü "modern" hücre membranlarının ağırlıklı olarak fosfolipidler oluşur, yağ asitleri prebiyotik membran muhafazaları makul adaylar kabul edilir ise5,6. Yeni membranların oluşumu veya membran büyümesini kolaylaştırmak için, amphiphilik yapı taşları dış7 veya ideal bir membranlı bölme içinde üretim ile ilgili anabolik süreçleri kullanarak sağlanmalıdır4 ,8.
Lipid sentezi nispeten karmaşık bir metabolik süreçtir iken, peptidler hücre içermeyen gen ifade reaksiyonları kullanarak oldukça kolay üretilebilmektedir9,10. Bu nedenle, amphiphilik peptidler tarafından oluşturulan peptid membranların büyüme edebiliyoruz yapay hücre taklit için muhafazaları olarak lipid membranlara ilginç bir alternatif temsil11.
Amphiphilik elastin-gibi di-blok kopolimerler (ELPs) peptidler, bu tür membranların için yapı taşı olarak hizmet verebilir çekici bir sınıftır12. ELPS temel amino asit sırası motif (gagvp)n, burada "a" prolin ve "n" dışında herhangi bir amino asit olabilir motifi tekrarı sayısı13,14,15,16,17 . ELPs esas olarak glutamik asit11oluşan bir hidrofilik blok ve ağırlıklı olarak fenilalanin içeren bir hidrofobik blok ile oluşturulmuştur. PH ve tuz konsantrasyonu gibi bir ve çözüm parametrelerine bağlı olarak, ELPS sıcaklık tt'de sözde ters sıcaklık geçişi sergiler, peptidler hidrofilik bir hidrofobik tamamen geri dönüşümlü faz geçişi geçmesi Durum. Peptidler sentezini kullanarak veziküller içinde kolayca uygulanabilir "TX-TL" bakteriyel hücre ekstresi11,18,19,20,21, hangi sağlar birleştirilmiş transkripsiyon ve çeviri reaksiyonları için gerekli tüm bileşenleri.
TX-TL sistemi birlikte kapsüllenmiş, DNA şablonu ile ELP 'Ler, cam boncuklardan su kaybı-rehidrasyon kullanan ELPS veziküllerine sağlam bir destek olarak kodlanıyor. Veziküllerin oluşumu, boncuk yüzeyinden kuru peptitlerin rehidrasyon yoluyla oluşur11. Vezikül oluşumu için22 diğer yöntemler, potansiyel olarak daha düşük polydispersity ve daha büyük vezikül boyutlarını (örn. Elektro-oluşum, emülsiyon faz transferi veya mikrofluidik tabanlı Yöntemler) gösterebilir. Kapsülleme yönteminin canlığını sınamak için, fluorogenic aptamer dBroccoli23 ' ün TRANSKRIPSIYONU, TX-TL sistemi ile gen ifadesinden daha az karmaşık olan11' i alternatif olarak kullanılabilir.
Vesiculo membran yapı taşları ve membran içine daha sonra birleşmesi ifadesi nedeniyle, veziküller büyümeye başlar11. ELPs membran birleşme bir FRET tahlil aracılığıyla gösterilebilir. Bu amaçla, ilk vezikül nüfusun oluşumu için kullanılan ELPs bir FRET çifti oluşturan eşit hisseler floresan boyalar ile konjuated edilmelidir. Vesiculo 'da etiketli olmayan ELPs 'in ve membranın içine birleşmesi üzerine, membran içinde etiketli ELPs seyreltilir ve dolayısıyla FRET sinyali11' i düşürür. Konjugasyon için çok yönlü ve ortak bir yöntem olarak, bakır katalizlü Azide-alkyne halkakatılma kullanılır. Tris (benzyltriazolylmethyl)-Amin gibi bir stabilizasyon ligand kullanımı ile, reaksiyon reaksiyonlarının hidroliz olmadan bir fizyolojik pH 'da sulu bir çözelti yapılabilir11, hangi konjugasyon reaksiyonlar için uygun olan peptidler dahil.
Aşağıdaki protokol büyüyen ELP tabanlı peptidosomes için hazırlık ayrıntılı bir açıklamasını sunar. Cam boncuk metodunu kullanarak peptidler ve vezikül oluşumunun ifadesi açıklanmıştır. Ayrıca, flororojenik dBroccoli aptamer ve ELP veziküller içinde protein ifadesi için transkripsiyon-çeviri reaksiyonu transkripsiyon nasıl uygulanacağı açıklanmıştır. Son olarak, sağlanan bir FRET tahlil ile vezikül büyümesini kanıtlamak için kullanılabilecek fluorophores ile ELPs konjugasyon için bir işlemdir11.

<table><tbody><tr><td>2xYT</td><td>MP biyomedikal</td><td>3012-032</td><td></td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>5PRIME Faz Kilidi JelTM tüp</td><td>VWR</td><td>733-2478</td><td></td></tr><tr><td>alkin konjuge Cy3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>777331</td><td></td></tr><tr><td>alkine konjuge Cy5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>777358</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>Benzamidin</td><td>Carl Roth</td><td>CN38.2</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta 2 E. coli suşu</td><td>Novagen</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>Bradford BSA Protein Test Kiti</td><td>Bio-rad</td><td>500-0201</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9501</td><td></td></tr><tr><td>Karbenisilin</td><td>Carl Roth</td><td>6344.2</td><td></td></tr><tr><td>Kloramfenikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>Kloramfenikol</td><td>Carl Roth</td><td>3886.3</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Carl Roth</td><td>4432.1</td><td></td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>USB</td><td>14121</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Carl Roth</td><td>P024.1</td><td></td></tr><tr><td>DFHBI</td><td>Lucerna Teknolojileri</td><td>410</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Carl Roth</td><td>A994.1</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Carl Roth</td><td>9065.2</td><td></td></tr><tr><td>Folinik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878</td><td></td></tr><tr><td>Cam boncuklar, asitle yıkanmış</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1277</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>USB</td><td>16800</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6147</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (&beta;-izopropil tiyogalaktozit)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth</td><td>P017.1</td><td></td></tr><tr><td>K-glutamat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1149</td><td></td></tr><tr><td>LB Suyu</td><td>Carl Roth</td><td>X968.2</td><td></td></tr><tr><td>Lizozim</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carl Roth</td><td>82.2</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth</td><td>KK36.3</td><td></td></tr><tr><td>Mg-glutamat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Bio-Spin Kromatografi Sütunları</td><td>Bio-Rad</td><td>732-6204</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6522</td><td></td></tr><tr><td>NHS-azid bağlayıcı (y-azidobütirik asit oksisüksinimid ester)</td><td>Baseclick</td><td>BCL-033-5</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000 Carl</td><td>Roth</td><td>263.2</td><td></td></tr><tr><td>pH şeritleri</td><td>Carl Roth</td><td>549.2</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetilsülfonil florür</td><td>Carl Roth</td><td>6367.2</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su</td><td>VWR</td><td>76180-684</td><td></td></tr><tr><td>Fosforik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W290017</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat dibazik çözelti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8584</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik çözelti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8709</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Miniprep Kiti</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>RNAPol reaksiyon tamponu</td><td>NEB</td><td>B9012</td><td></td></tr><tr><td>RNase inhibitörü murin</td><td>NEB</td><td>M0314S</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Mendil</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9788</td><td></td></tr><tr><td>rNTP</td><td>NEB</td><td>N0466S</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Fenol/Kloroform/İzoamil alkol</td><td>Carlroth</td><td>A156.1</td><td></td></tr><tr><td>RTS Amino Asit Örnekleyici</td><td>5 Prime</td><td>2401530</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer Diyaliz Kaseti, 10k MWCO (Kit)</td><td>Termo-Bilimsel</td><td>66382</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Carl Roth</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Carl Roth</td><td>8655.1</td><td></td></tr><tr><td>Spermidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>Steril filtreli (0.22 &mikro; m filtresi)</td><td>Carl Roth</td><td>XH76.1</td><td></td></tr><tr><td>T7 polimeraz</td><td>NEB</td><td>M0251S</td><td></td></tr><tr><td>TBTA (tris (benziltriazolilmetil) amin)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>TCEP (tris (2-karboksietil) -fosfin hidroklorür)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>Tris tabanı</td><td>Fischer</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>tRNA (E. coli'den)</td> <td>Roche Uygulandı Bilim</td><td>MRE600</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>USB</td><td>23160</td><td></td></tr></tbody></table>

vesiculo 'da otonom vezikül büyümesi için peptid membran öncülerinin sentezini

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Biyokimyasal reaksiyonlar bölümlendirme sentetik hücrelerin merkezi bir yönüdür. Bu amaçla, peptid tabanlı reaksiyon bölmeleri lipozomlar veya yağlı asit bazlı veziküller için cazip bir alternatif olarak hizmet vermektedir. Dıştan veya veziküller içinde, peptidler kolayca ifade ve membran öncüleri sentezini basitleştirebilirsiniz. Burada sağlanan, cam boncuklardan su kaybı-rehidrasyon kullanan amphiphilik elastin benzeri polipeptidler (ELP) temelinde ~ 200 Nm çapları ile veziküllerin oluşturulması için bir protokoldür. Ayrıca sunulan bakteriyel ELP ifadesi ve ters sıcaklık Bisiklet yoluyla arıtma için protokoller, hem de floresan boyalar ile onların kovalent functionalization. Ayrıca, bu raporda bir biyokimyasal reaksiyon için daha az karmaşık bir örnek olarak ELP veziküller içinde RNA aptamer dBroccoli transkripsiyon etkinleştirmek için bir protokol açıklanmaktadır. Son olarak, bir protokol sağlanır, hangi floratik proteinleri ve membran peptid vesiculo ifadesinde sağlar, vezikül büyüme ikincisi sonucu sentezinde ise.

Vezikül üretimi Şekil 1 , farklı şişme çözeltileri ve cam boncuk yöntemiyle hazırlanan veziküllerin iletim elektron MIKROSKOBU (Tem) görüntülerini gösterir (Ayrıca bakınız VOGELE ve al.11). Şekil 1a'da örnek için sadece PBS, veziküller oluşumunu kanıtlamak ve boyutlarını belirlemek için şişlik çözeltisi olarak kullanılmıştır. TX-TL şişme çözeltisi olarak kullanıldığında (Şekil 1B), vezikül...

Burada sunulan peptid tabanlı Küçük unilamellar veziküller büyüme yeteneğine oluşturulması için protokoller vardır. Membran peptid vesiculo üretiminde kolaylaştırmak için, bu veziküller bir transkripsiyon-çeviri sistemi ve peptid-kodlama Plasmid ile donatılmıştır.

Vesiculo 'da otonom vezikül büyümesi için peptid membran öncülerinin sentezini

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

Protokolümüzde, peptitlerden yapılmış reaksiyon bölmeleri oluşturmak için küçük cam boncuklardan film yeniden hidrasyon uyguluyoruz. Deneylerde, protokolün basitliğinden ve sağlamlığından faydalanıyoruz. Bu tekniğin en büyük avantajı, kullanılan ham hücre özü gibi hassas numuneleri bile dahil edebilme yeteneğidir.Organik çözücülerle temas numuneyi önemli ölçüde etkileyecektir. Bu prosedüre başlamak için, ELP çözeltisini 1.1 milimolara yoğunlaştırmak için santrifüj vakum konsantratörü kullanın. Bu konsantre çözeltinin 200 mikrolitresini 2-1 kloroform ve metanol karışımının 1,250 mikrolitresini karıştırın.Girdap çözeltisi iyice karıştırmak için. Sonra, on mililitrelik yuvarlak alt şişe ye 1,5 gram küresel cam boncuk ekleyin. Yuvarlak alt şişeye ELP ve kloroform metanol çözeltisi ekleyin ve yavaşça karıştırmak için sallayın.Şişeyi döner buharlaştırıcıya bağlayın. Hızı 150 RPM'ye ayarlayın ve sıvı oda sıcaklığında buharlaşana kadar basıncı yaklaşık dört dakika boyunca 20.000 pascal'a ayarlayın. Olası kaynama geriliği nedeniyle döner evaporatör kullanırken dikkatli olmak önemlidir.Bundan sonra, gevşek cam boncuk kaybını önlemek için yuvarlak alt şişe nin açılması etrafında alüminyum folyo sarın ve kalan kloroform ve metanol buharlaşır sağlamak için, en az bir saat boyunca bir kurutucu içine şişe yerleştirin. Tek bir deney için, 100 miligram peptid kaplı cam boncukları 60 mikrolitre şişme çözeltisi ile karıştırın. Bu numuneyi 25 derecede beş dakika kuluçkaya yatırın.Örnekleri hızlı bir şekilde santrifüj ve cam boncuk tortu için bir masa üstü santrifüj kullanın. Sonra veziküller içeren supernatant, toplamak için bir pipet kullanın. İlk olarak, daha iyi faz ayrımı sağlamak için bir mikro santrifüj tüp içinde roti-Fenol, kloroform veya izoamyl alkol 100 mikrolitre ile önceden saflaştırılmış plazmid DNA 100 mikrolitre karıştırın.Tüpü altı kez hafifçe ters çevirin ve 16,000 kez g ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca santrifüj edin. Daha sonra, üst faza 200 mikrolitre kloroform ekleyin ve tüpü altı kez ters çevirin. Numuneyi 16,000 kez g ve oda sıcaklığında beş dakika santrifüj edin.Bundan sonra, pipet ayrı bir tüp için supernatant ve etanol yağış için üç molar sodyum asetat 10 mikrolitre ekleyin. 80 santigrat derecede bir mililitre soğuk etanol ekleyin ve numuneyi 80 derecede bir saat saklayın. Sonra, 16, 000 kez g ve 15 dakika boyunca dört derece santigrat örnek santrifüj.Supernatant decant ve 20 santigrat derece soğuk% 70 etanol bir mililitre ekleyin. Santrifüj 16, 000 kez g ve dört santigrat derece beş dakika. Daha sonra, DNA peletrahatsız değil dikkatli olmak, pipetleme ile sıvı çıkarın.Kalan etanol buharlaştırmak için yaklaşık 15 dakika oda sıcaklığında örnek saklayın. Bundan sonra, numune konsantrasyonunu 260 nanometrede emilim le ölçülen yaklaşık 300 nanomolar'a ayarlamak için numuneye ultra saf su ekleyin. Transkripsiyon-çeviri reaksiyonu hazırlamak için, hazırlanan ham hücre ekstraksiyonu ve buz üzerindeki reaksiyon tamponu izleyin.60 mikrolitrelik reaksiyon karışımı için plazma DNA'sını reaksiyon tamponunun 37,5 mikrolitresine ekleyin, 28,7 mikrolitre ham hücre ekstresi ekleyin ve ultra saf suyla 58,8 mikrolitrelik son hacmi doldurun. Reaksiyon başlamadan hemen önce, T7RNA polimeraz çözeltisinin 1,2 mikrolitresini ekleyin ve pipetleri yukarı ve aşağı karıştırın. Deney süresince numuneyi ve şişlik çözeltisini 29 santigrat derecede kuluçkaya yatırın, bu da genellikle dört ila sekiz saattir.Veziküllerin iletim elektron mikroskobu görüntüleri, TX/TL ve hatta sadece PBS gibi çeşitli şişme solüsyonlarının vezikül oluşturmak için kullanılabileceğini göstermektedir. Her iki çözüm için de boyut belirleme düz bir adımdır. Dinamik ışık saçılımı, cam boncuk yöntemi olmadan hazırlanan veziküllerin 134 nanometre çapında sonuç verdiğini, cam boncuklar kullanıldığında %25'lik bir polidağılım la sonuçverdiğini, çapın %21'lik bir polidispersite sahip iki floresan proteinin floresan şiddeti ile ELP vezikülleri içinde ölçüldüğünde floresan plaka okuyucu kullanılarak ölçülür.Vezikül oluşumundan sonra veziküllerin içeriği ve dış solüsyonun aynı olduğunu, bu nedenle protein ekspresyonunu bastırmak için kanamisin antibiyotiğinin dış solüsyona eklenmediğini belirtmek önemlidir. Bir kontrol olarak, Kanamisin de şişme çözeltisi eklenir, bu durumda vezikül içinde protein ifadesi bastırılır. Bu Kanamisin membran yoluyla diffüz olmadığını gösterir, ve sürekli iç ekspresyon bastırır, her zaman.FRET tnes sonra membran içine ELP dahil göstermek için yapılır. Membran ELP'lerinin ekspresyonu üzerine, ek peptidler membrana dahil edilmiştir, bu da FRET çiftleri arasındaki ortalama mesafeyi arttırır ve bu da donör sinyalinin artmasına neden olarak sonuçlanır. Sunulan teknik basit reaksiyon kapları üretmek veya peptid bazlı membranlar ile yapay hücreler oluşturmak için kullanılabilir.İçerideki içerik gerektiği gibi seçilebilir. Bu peptit vezikülleri kullanarak, şimdi içlerinde daha karmaşık sentez reaksiyonları üzerinde ileriye bakabilirsiniz.

in-vesiculo-synthesis-peptide-membrane-precursors-for-autonomous

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu protokol, büyük unilamellar lipid veziküller içine peptid translokasyonu kantitatif ölçmek için bir yöntem. Bu yöntem ayrıca membran translokasyon oranı hakkında bilgi sağlar ve çift katlı lipit katmanını etkin ve kendiliğinden geçtiğini peptidler tanımlamak için kullanılabilir.

Büyük Unilamellar Veziküller Ölçme Peptid Translokasyon

Biz bir teknik veziküller, temassız embriyolardan için yerelleştirilmiş kalsiyum iyon degradeler kullanarak mevcut. Bir dev lipid vezikül, çevresinde bir kalsiyum iyon eriyik mikroenjeksiyon membran borulu çıkıntılar üretiminde kaynaklanan lipit membran yeni model için kullanılmaktadır.

Yanıt olarak lokalize kalsiyum iyon degradeler dev veziküller membran Remodeling

Membran proteinlerinin yeniden yapılandırılması ve enzimlerin ve diğer suda çözünür bileşenlerin mikrometre altı ve mikrometre boyutundaki lipid veziküllerinde kapsüllenmesi için bir protokol sunuyoruz.

Nano ve Mikrometre Boyutlu Veziküllerde Denge Dışı Metabolik Ağların İnşası

Biz yıldız biçimli altın Nanostars gümüş tohum aracılı büyüme yöntemi kullanılarak sentezlendi. Nanostars çapı 200 ila 300 nm arasında değişir ve ipuçları sayısı 7 ila 10 arasında değişmektedir. Nanopartiküller, yakın kızılötesi merkezli geniş bir yüzey plazmon rezonans modu var.

Gümüş Tohum aracılığı Büyüme Yöntemi ile Altın Nanostar Sentezi

Burada kendi kendine montaj 3-boyutlu iskele kültür insan nöral progenitör hücrelerin kullanımını tanımlamak. Biz flow sitometri ile analiz edilecek daha sonra örneğin iskeleleri hücreleri serbest bırakmak için bir protokol mevcut. Bu protokol detaylı mekanistik çalışmalar gerçekleştirmek için diğer hücre türlerine adapte olabilir.

3 boyutlu montaj Self-Peptid Hidrojel İnsan Sinir Progenitör Hücreler Yetiştiriciliği

Aşağıdaki protokol tiyol-ene fotoğrafı tıklama reaksiyonlar oluşturduğu adım büyüme PEG-peptid Hidrojellerde pankreatik β-hücreleri encapsulating için teknikler sağlar. Bu malzeme platformu hücre kapsülleme için cytocompatible mikroçevrede sunuyor, ama aynı zamanda hidrojellerin bünyesinde oluşturulan hücre yapılarının kullanıcı kontrollü hızlı iyileşme sağlar sadece.

Adım büyüme PEG-peptid Hidrojeller kaynaktan β-hücre sferoidlerin Üretimi ve Kurtarma

Bir damlacık arayüz lipid ikili tabakasına karşı mikroakışkan jeti zar asimetri, zar proteinlerinin dahil edilmesi, ve malzeme kapsülleme üzerinde kontrol ve veziküllerin üretilmesi için güvenilir bir yöntem sağlar. Bu teknik, bölümlere biyomoleküllerin istenen biyolojik sistemlerin çeşitli çalışma uygulanabilir.

Mikroakışkan jeti kullanarak çift katlı lipid Vesikül Üretimi

Biz burada bir verici ve alıcı florofor siteleri arasında bir proteaz bölünme mevkisinin katılması, geliştirilmiş bir lüminesans Rezonans Enerji Transferi (LRET) yöntemini tarif etmektedir. Bu tadilat ile proteinlerin arıtılmadan zar proteinlerinin çalışmaya izin ilgi zar proteinleri, ortaya çıkan spesifik LRET sinyalleri elde edilmesine olanak sağlamaktadır.

Lüminesans Rezonans Enerji memeli hücrelerinde ifade Membran Proteinleri Konformasyonel Değişiklikleri Eğitim transfer

Electrospun nanolifler oranı, mükemmel mekanik bütünlüğü ağırlığı ve hücre büyümesi ve çoğalması desteklemek için yüksek bir yüzey alanı vardır. Bu nanolifler biyomedikal uygulamalarda geniş bir yelpazesi var. Burada Elektrospinning tekniği kullanılarak, keratin / PCL nanolifler imal ve doku mühendisliğinde olası uygulamalar için lifleri karakterize.

Biyomedikal Mühendisliği için keratin bazlı nanofiber sentezi

Heparin ve protaminden üretilen kendiliğinden birleşen polielektrolit kompleksleri (PEC), osteojenik büyüme faktörlerinin salınımını yakalamak ve düzenlemek için aljinat boncuklar üzerinde biriktirildi. Bu uygulama stratejisi, spinal füzyon uygulamalarında BMP-2 dozunun 20 kat azaltılmasını sağlar. Bu makale, PEC'lerin faydalarını ve üretimini göstermektedir.

Heparin Binding Domain osteojenik Büyüme Faktörü Teslim polielektrolit Kompleksi

Keşfedin, film rehidrasyonu ve cam boncuklar kullanarak peptit bazlı küçük unilamellar veziküller oluşturma yöntemini. Hassas biyolojik örnekleri koruyarak otonom membran büyümesi sağlar.

Vesiculo 'da otonom vezikül büyümesi için peptid membran öncülerinin sentezini

Daha fazla video keşfet