Name: Insan kanı mutasyonel yük ve Clonal bileşimi karakterize (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Keşfedin, tek bir hematopoietik kök hücredeki somatik mutasyonları doğru şekilde belirlemek için biyoinformatik analiz yöntemlerini kullanarak. Bu yaklaşım, mutasyonel süreçleri ve soy hattı ilişkilerini çözümlemenize yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmada Hollanda bilimsel araştırmalar Örgütü (NWO) (No. 016. vidi. 171.023) için R. v. B 'ye ait bir VIDI hibe tarafından destekleniyordu.

<ol><li>Osorio, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+Mutations+Reveal+Lineage+Relationships+and+Age-Related+Mutagenesis+in+Human+Hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Somatic Mutations Reveal Lineage Relationships and Age-Related Mutagenesis in Human Hematopoiesis.</a> Cell Reports. 25, 2308-2316 (2018).</li>
<li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+Hematopoiesis+and+Blood-Cancer+Risk+Inferred+from+Blood+DNA+Sequence%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clonal Hematopoiesis and Blood-Cancer Risk Inferred from Blood DNA Sequence.</a> New England Journal of Medicine. 371, 2477-2487 (2014).</li>
<li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-Related+Clonal+Hematopoiesis+Associated+with+Adverse+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Age-Related Clonal Hematopoiesis Associated with Adverse Outcomes.</a> New England Journal of Medicine. 371, 2488-2498 (2014).</li>
<li>Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+haematopoiesis+harbouring+AML-associated+mutations+is+ubiquitous+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Clonal haematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults.</a> Nature Communications. 7, 1-7 (2016).</li>
<li>Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., Wedge, D. C., Campbell, P. J., Stratton, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+Signatures+of+Mutational+Processes+Operative+in+Human+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Deciphering Signatures of Mutational Processes Operative in Human Cancer.</a> Cell Reports. 3, 246-259 (2013).</li>
<li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500, 415-421 (2013).</li>
<li>Alexandrov, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Repertoire+of+Mutational+Signatures+in+Human+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The Repertoire of Mutational Signatures in Human Cancer.</a> bioRxiv. , (2018).</li>
<li>Behjati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequencing+of+normal+cells+reveals+developmental+lineages+and+mutational+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes.</a> Nature. 513, 422-425 (2014).</li>
<li>Blokzijl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+mutation+accumulation+in+human+adult+stem+cells+during+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific mutation accumulation in human adult stem cells during life.</a> Nature. 538, 260-264 (2016).</li>
<li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genome+sequencing%3A+Current+state+of+the+science%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell genome sequencing: Current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17, 175-188 (2016).</li>
<li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+identification+of+single-nucleotide+variants+in+whole-genome-amplified+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Accurate identification of single-nucleotide variants in whole-genome-amplified single cells.</a> Nature Methods. 14, 491-493 (2017).</li>
<li>Welch, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+evolution+of+mutations+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia.</a> Cell. 150, (2012).</li>
<li>Jager, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mutation+accumulation+in+single+human+adult+stem+cells+by+whole-genome+sequencing+of+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring mutation accumulation in single human adult stem cells by whole-genome sequencing of organoid cultures.</a> Nature Protocols. 13, 59-78 (2018).</li>
<li>Boeva, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control-FREEC%3A+A+tool+for+assessing+copy+number+and+allelic+content+using+next-generation+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Control-FREEC: A tool for assessing copy number and allelic content using next-generation sequencing data.</a> Bioinformatics. 28, 423-425 (2012).</li>
<li>Blokzijl, F., Janssen, R., van Boxtel, R., Cuppen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MutationalPatterns%3A+Comprehensive+genome-wide+analysis+of+mutational+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">MutationalPatterns: Comprehensive genome-wide analysis of mutational processes.</a> Genome Medicine. 10, 1-11 (2018).</li>
<li>Thorvaldsdóttir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Genomics+Viewer+%28IGV%29%3A+High-performance+genomics+data+visualization+and+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Integrative Genomics Viewer (IGV): High-performance genomics data visualization and exploration.</a> Briefings in Bioinformatics. 14, 178-192 (2013).</li>
<li>Notta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+single+human+hematopoietic+stem+cells+capable+of+long-term+multilineage+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment.</a> Science. , (2011).</li>
<li>Lee-Six, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+dynamics+of+normal+human+blood+inferred+from+somatic+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Population dynamics of normal human blood inferred from somatic mutations.</a> Nature. 561, 473-478 (2018).</li>
<li>Behjati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequencing+of+normal+cells+reveals+developmental+lineages+and+mutational+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes.</a> Nature. , (2014).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Burada sunulan, bireysel hkms 'de yaşam sırasında birikmiş mutasyonları tespit etmek ve bu mutasyon verilerini kullanarak erken gelişimsel soy ağacı oluşturmak için bir yöntemdir.
Bu işlemleri başarıyla gerçekleştirmek için birkaç kritik gereksinim karşılanması gerekir. İlk olarak, numunenin canlılığı sağlanmalıdır. Numunenin hızlı işlenmesi, prosedürün verimliliğini sağlamak için anahtardır. İkinci olarak, büyüme faktörü gücü kaybı HSPCs 'in klonal genişlemesini olumsuz yönde etkileyecektir. Yüksek büyüme faktörü potens sağlamak için, donma-çözülme döngüleri önlemek ve tek kullanımlık aliquots hazırlamak önemlidir. Üçüncü, WGS yaptıktan sonra, mutasyon arama ve filtreleme, klonal kültürün klonallık doğrulamak için çok önemlidir. Kültürün klonallık onaylamak için, mutasyonların VAF etrafında küme olmalıdır 0,5 karyotypically normal bir örnek (Şekil 3). Kordon kanı HSPCs gibi düşük mutasyonel yükü olan hücrelerde, düşük mutasyon numaraları nedeniyle klonallık belirlemek daha zordur.
Yaklaşımımız WGS için izin vermek için tek hücrelerin in vitro genişlemesine dayanır. Bu nedenle, yaklaşımımız, HSPCs gibi genişletmek için çoğallandırıcı potansiyele sahip hücrelere sınırlıdır. Bizim elimizde, tüm tek sıralı hücrelerin yaklaşık% 5-30% yeterince genişletmek edebiliyoruz. Azaltılmış büyüme oranları olası bir seçim önyargı neden olabilir. Daha önce de anlatıldığı gibi, bu teknik hücrelerin genişlemesine güvenmiyorsa, WGA kullanan Yöntemler bu seçim önyargı üstesinden gelebilir. Ancak, WGA kendi eksiklikleri vardır, ve klonal amplifikasyon doğru tüm genom içinde allelik bırakma ve genom boyunca eşit kapsama olmadan mutasyonların sayısını belirlemek için tek yöntem kalır, özellikle düşük gerçek somatik örnekleri mutasyon numaraları.
Bu yaklaşım kullanılarak oluşturulan veriler, tek hücrelerde algılanan mutasyonlar, Şekil 6' da tasvir edilen hücre sırlarını incelemek için kullanılabiliyor olduğu için, hematopoetik sistemin phylogenlerini belirlemek için kullanılabilir. Tipik olarak, bir veya iki mutasyon sağlıklı bir bağışçı1her şube tanımlayabilir. Bu yana, ilk dalları tanımlayan mutasyonlar, germline türevleri1,18,19filtreleme için kullanılan eşleşen normal örnekteki düşük VAF ile de mevcut olacaktır. Bu durumda, onlar hematopoetik sistemden gelişimi sırasında çok erken ayırmak için bekleniyor olarak MSCs gibi olmayan-hematopoetik hücrelerin kullanımı, tercih edilir. T-hücreler hematopoetik Orijin olduğu için, bu hücrelerin, germline türevleri filtrelemek için eşleşen normal bir örnek olarak kullanımı, bu nedenle gelişimsel soy ağacının en erken dallanma yapımında konabilir. Belirli olgun kan nüfusa şube özgü mutasyonların subclonal varlığı, hangi hedeflenen derin sıralamayı ile ölçülebilir, bu şube gençliğinde bu olgun hücre türüne yol verebilir gösterecektir. Buna ek olarak, yaklaşımımız, mutajisik pozlama içinde vivo ve sonuçta bunun lösemi gelişimine nasıl katkıda bulunabileceği mutasyonel sonuçları değerlendirmek için izin verir.

Hematopoetik kök ve progenitör hücrelerinin (hspcs) endojen veya ekstrensek mutajenik kaynaklara maruz kalması,1ömrü boyunca DNA 'daki mutasyonların kademeli olarak birikmesine katkıda bulunur. Hspcs1 ' deki kademeli mutasyon birikimi, lösemi-sürücü mutasyonları taşıyan hspcs tarafından tahrik edilen semptomatik olmayan bir durum olan yaşla ilgili klonal hematopoezinin (Arch)2,3' te sonuçlanabilmektedir. Başlangıçta, kemer ile bireylerin lösemi için artan bir risk olduğunu düşünülmektedir2,3. Ancak, son çalışmalar eski bireyler4arch% 95 bir insidansı göstermiştir, malignite daha az net ile dernek yapma ve neden Arch ile bazı bireyler sonunda ya da malignite geliştirmek değil neden soru yükselterek. Yine de, HSPCs 'deki somatik mutasyonlar ciddi sağlık riskleri teşkil edebilir, Miyelodisplastik bozukluklar ve lösemi belirli kanser sürücüsü mutasyonlarının varlığı ile karakterize edilir.
Mutasyonel süreçleri tanımlamak ve kan klonallık incelemek için, bireysel HSPCs mutasyon birikimi karakterize edilmesi gerekir. Mutasyonel süreçler genom, sözde mutasyon imzalarında karakteristik desenler bırakmak, hangi tespit edilebilir ve mutasyonlar genom genelinde koleksiyonları nicelik5. Örneğin, UV ışığa maruz kalma, alkilleyici ajanlar, ve DNA onarım yolları kusurları her biri farklı bir mutasyonel imza ile ilişkilidir,6,7. Buna ek olarak, mutasyon birikiminin Stokastik doğası nedeniyle, elde edilen mutasyonların çoğu (değilse) hücreler arasında benzersizdir. Mutasyonlar aynı bireyin birden çok hücre arasında paylaşılır, bu hücrelerin ortak bir üst8paylaştığı gösterir. Bu nedenle, paylaşılan mutasyonları değerlendirerek, Lineage ilişkileri hücreler arasında tespit edilebilir ve bir gelişimsel soy ağacı şube tarafından inşa edilebilir. Ancak, fizyolojik olarak normal hücrelerdeki nadir somatik mutasyonları kataloglama, sağlıklı dokularda poliklonal doğası nedeniyle Teknik olarak zordur.
Burada sunulan bir yöntem doğru tanımlamak ve bireysel HSPCs genomları somatik mutasyonlar belirlemek için. Bu, HSPCs in vitro yalıtım ve klonal genişleme içerir. Bu klonal kültürler orijinal hücrenin genetik makyajını yansıtmaktadır (yani orijinal hücredeki mutasyonlar kültürdeki diğer tüm hücreler tarafından paylaşılacaktır). Bu yaklaşım, tüm genom sıralamaları (WGS) için yeterli DNA elde etmemizi sağlar. Daha önce klonal kültürü sırasında in vitro olarak birikmiş mutasyonların hücrelerin bir alt kümesi tarafından paylaşılacak olduğunu gösterdik. Bu, tüm in vitro mutasyonların filtrelenmesini sağlar, çünkü in vivo elde edilen mutasyonlar9' a kıyasla daha küçük bir parça okunacak. Önceki yöntemler tüm genom amplifikasyon (WGA)10kullanarak WGS için tek bir hücreden yeterli DNA elde etmiştir. Ancak, WGA ana dezavantajı genom nispeten hata eğilimli ve dengesiz amplifikasyon olduğunu, hangi allel bırakma neden olabilir11. Bununla birlikte, bu yaklaşım tek hücrelerin in vitro genişlemesine dayanır gibi, WGA bağımlı yöntemler için değil, yeterli çoğalan potansiyel ile kan hücreleri ile sınırlıdır. Klonal kültürlerin sıralanması önceki çabaları tek hspcs12klonal amplifikasyon sağlamak için besleyici katmanları kullanarak güvenerek. Ancak, besleyici katmanlardan DNA potansiyel olarak klonal kültürlerin DNA 'sını kirleterek, sonraki mutasyon çağırma ve filtreleme işlemini karıştırabilir. Burada sunulan yöntem sadece CL, tek HSPCs genişletmek için belirtilen orta dayanır ve bu nedenle DNA kontaminasyonu sorununu önler. Bugüne kadar, bu yöntem insan kemik iliği, kordon kanı, viably dondurulmuş kemik iliği ve periferik kan üzerinde başarıyla uyguladıysanız.

<table><tbody><tr><td>0.20 ve mikro; m şırınga filtresi</td><td>Corning</td><td>431219</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Şırınga, Luer kilidi</td><td>BD</td><td>613-3925</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-50G</td><td></td></tr><tr><td>CD11c FITC</td><td>BioLegend</td><td>301603</td><td>Klonu 3.9</td></tr><tr><td>CD16 FITC</td><td>BioLegend</td><td>302005</td><td>Klonu 3G8</td></tr><tr><td>CD3 BV650</td><td>Biolegend</td><td>300467</td><td>Klonu UCHT1</td></tr><tr><td>CD34 BV421</td><td>BioLegend</td><td>343609</td><td>561</td></tr><tr><td>CD38 PE</td><td>BioLegend</td><td>303505</td><td>Klon HIT2</td></tr><tr><td>CD45RA PerCP/Cy5.5</td><td>BioLegend</td><td>304121</td><td>Klon HI100</td></tr><tr><td>CD49f PE / Cy7</td><td>BioLegend</td><td>313621</td><td>Klon GoH3</td></tr><tr><td>CD90 APC</td><td>BioLegend</td><td>328113</td><td>Klon 5E10</td></tr><tr><td>Hücre Süzgeci 5 mL tüp</td><td>Corning</td><td></td><td></td>352235</tr><tr><td>CELLSTAR plaka, 384w, 130 & L, F-alt, TC, kapak</td><td>Greiner</td><td>781182</td><td></td></tr><tr><td>Kriyojenik flakon</td><td>Corning</td><td>430487</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>ThermoFisher</td><td>61965059</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>ThermoFisher</td><td>10500</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Flt3-Ligand, birinci sınıf</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-096-479</td><td>Tek kullanımlık alikotlarda yeniden yapılandırma (25 &mu; L) 100 &mu'da; PBS'de %0.1 BSA'da g / mL</td></tr><tr><td>İnsan Rekombinant IL-3 (E. coli eksprese edilmiş)</td> <td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>78040.1</td><td>Tek kullanımlık alikotlarda yeniden yapılandırma (2.5 &mu; L) 100 &mu'da; PBS'de% 0.1 BSA'da g / mL</td></tr><tr><td>İnsan Rekombinant IL-6 (E. coli eksprese edilmiş)</td> <td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>78050.1</td><td>Tek kullanımlık alikotlarda yeniden yapılandırma (5 &mu; L) 100 &mu'da; PBS Human SCF'de% 0.1 BSA'da g / mL</td></tr><tr><td>, birinci sınıf</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-096-695</td><td>Tek kullanımlık alikotlarda yeniden yapılandırma (25 &mu; L) 100 &mu'da; PBS Human TPO'da% 0.1 BSA'da g / mL</td></tr><tr><td>, birinci sınıf</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-095-752</td><td>Tek kullanımlık alikotlarda yeniden yapılandırma (12.5 &mu; L) 100 &mu'da; PBS</td></tr><tr><td>Integrative Genomics Viewer 2.4'te %0.1</td> BSA'da g/mL <td>Broad Institute</td><td></td><td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/download</td></tr><tr><td>Iscove'un Modifiye Eagle's Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>12440061</td><td></td></tr><tr><td>Soyu (CD3/14/19/20/56) FITC</td><td>BioLegend</td><td>348701</td><td>Klonları: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56</td></tr><tr><td>Lenfopp</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td># 07861</td><td>Yoğunluk gradyan ayırma</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>için kullanılır Enstitünün tesisinde üretilmiştir. Ticari olarak temin edilebilen PBS ayrıca kullanılabilir</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Primosin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>Antibiyotik formülasyonu</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mikro Kiti</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 florometre</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Test Kiti</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>SH800S Hücre Sıralayıcı</td><td>Sony</td><td>SH800S</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM, 500 mL</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>9650</td><td></td></tr><tr><td>TE TAMPON PH 8.0, DÜŞÜK EDTA</td><td>G-Biosciences</td><td>786-151</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>ThermoFisher</td><td>12605-10</td><td></td></tr></tbody></table>

insan kanı mutasyonel yük ve clonal bileşimi karakterize

Characterizing Mutational Load and Clonal Composition of Human Blood

Hematopoetik kök ve progenitör hücreler (hspcs), lösemi gibi yaşlarla ilişkili hastalıklara katkı sağlayan bir ömür süresince DNA mutasyonları giderek birikir. Mutasyon birikimi karakterize yaşlılık ilişkili hastalıkların etiyolojisi anlayışını artırabilir. Burada sunulan bireysel hspcs içinde somatik mutasyonlar Katalog için bir yöntemdir, tüm genom sıralamaları dayanmaktadır (WGS) klonal primer hücre kültürlerinin. Orijinal hücrede bulunan mutasyonlar, klonal kültürdeki tüm hücreler tarafından paylaşılır, ancak hücre sıralamadan sonra in vitro olarak elde edilen mutasyonlar hücrelerin bir alt kümesinde bulunur. Bu nedenle, bu yöntem, yaşam sırasında biriken bireysel HSPCs genomları mevcut somatik mutasyonların doğru tespiti için izin verir. Somatik mutasyonların bu katalogları, hematopoetik dokuda aktif olan mutasyonel süreçlere ve bu süreçlerin lötekjenlere nasıl katkıda bulunmasına ilişkin değerli öngörüler sağlayabilir. Buna ek olarak, aynı bireyin birden çok HSPCs arasında paylaşılan somatik mutasyonları değerlendirerek, klonal soy ilişkileri ve kan nüfuslarının nüfus dinamikleri tespit edilebilir. Bu yaklaşım tek hücrelerin in vitro genişlemesine dayandığı için, yöntem yeterli çoğalan potansiyele sahip hematopoetik hücrelerle sınırlıdır.

Deneysel prosedür Deneysel iş akışı Şekil 1' de tasvir edilir. Giriş malzemesi tipine göre farklı adımlarla takip edilmelidir. Şekil 2 ' de bir kordon kan hücresi Sıralamalı bir akış cytometrik çıkış tasvir edilir. İlk olarak, tüm Monositik hücreler bu nüfusun etrafında gevşek bir kapı çizerek seçilir. Ardından, tekli doğrusal FSC-h/FSC-a oranı olan hücreler için seçerek izole edilir, daha düşük bir FSC-h/FSC-a oranı olarak ceketleri veya hücre kümeleri içerir. Lekelenmiş denetim örneği Lineage-, CD34+, CD38-, CD45RA-için hücre sıralama kapıları tanımlamak için kullanılır. Ayrıca, CD90 ve CD49f progenitör hücreleri veya kendini yenileyen kök hücreleri17 (Şekil 2) arasında ayırt etmek için kullanılabilir. Dizin sıralama, bireysel hücrelerin Re-Tracing sağlar ve sıralanmış hücreler kahverengi noktalar olarak tasvir edilir. Hücre kültürü sırasında, bireysel klonlar farklı bir hızda genişletebilir, bazı klonlar içinde genişleyen ile 3 hafta, diğer klonlar sadece tamamen kültür beşinci haftası kadar genişletilir iken. Bkz. Şekil 3A, B temsili koloni gelişimi için. Bir temsili resim kaplama sonra 11 gün içinde neredeyse confluent MSC toplu kültürü gösterilir (Şekil 3c).
Sıralama ve mutasyon analizinden sonra kalite kontrolü Gösterilen kopya numarası değişiklikleri (Şekil 4) kontrol etmek için Control-freec14 tarafından oluşturulan kopyalama sayısı analizinin bir örnek çıktıdır. Karyoktifik bilgiler, SNVFI çalışması sırasında hangi kromozomların dışlandığını gösterebilir (adım 7,6). Snvfı tarafından oluşturulan VAF Arsa (Şekil 5) örnekteki varyant allel frekansları bir histogram olduğunu. 0,5 de yoğunluk arsa bir zirve örnek klonal olduğunu gösterir. Mutasyonların arkasındaki biyolojik nedenlerden daha fazla bilgi almak için, bunlar R paketi MutationalPatterns15kullanılarak analiz edilebilir. Burada tasvir bir 96-trinucleotid Arsa üreten tipik bir analiz (Şekil 6). Farklı mutasyon türlerinin ölçülmesini ek olarak, bu araç ile imza çıkarma da gerçekleştirilebilir.
Gelişimsel bir soy ağacı oluşturmak Klonlar arasında paylaşılan mutasyonlar veya bir klon içinde mevcut (ve düşük VAF) germline kontrol ıGV kullanılarak doğrulanır. Mutasyonlar, numune içinde mevcut olduğunda ve germline (şekil 7a) yüksek VAF düzeylerinde değil, gerçek olarak kabul edilir. Kötü eşleştirilen bölgelerde (şekil 7b) meydana gelen IGV 'de bulunmadığı zaman mutasyonlar yanlış olarak kabul edilir. Diğer durumlarda, SNVFı tarafından algılanan olaylar cevapsız germline mutasyonlar (Şekil 7C). Seçilen klonlar için bu mutasyonlar için hedeflenen yeniden sıralamayı kullanarak mutasyonların bağımsız yeniden sıralamaları oldukça önerilir.  Klonlar arasında paylaşılan somatik mutasyonların algılanması sonrasında, ikili matris oluşturulur (adım 10,8). Bir heatmap, paylaşılan mutasyonlar A-M içeren ve içermeyen hücreler içeren inşa edilir. Bu heatmap üzerinde gelişimsel soy ağacı belirtilir (Şekil 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig1.jpg"> Şekil 1: giriş malzemesine dayalı deneysel prosedürü tasvir eden akış şeması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig1large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig2.jpg"> Şekil 2: hücre sıralama stratejisi. İlk olarak, küçük mononükleer hücrelerde gating gerçekleştirilir. İkinci olarak, tek hücreler doğrusal kesir seçimi ile Gated. Lineage negatif hücreler Gated. Tüm CD34+ CD38- CD45- hücreler tek hücreli-sıralanır. Kahverengi hücrelerin kesir, sıralanan hücreler seçeneği "Dizin sıralama" tarafından vurgulanan olan, unutulmamalıdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig2large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig3.jpg"> Şekil 3: temsilci hücre kültürü sonuçları. Temsilci HSPC klonlar bir 384 iyi plaka at (a) 2 hafta kaplama sonra ve (B) 4 hafta kaplama sonra. (C) msc kültürü 2 hafta sonra orta değiştirme. Ölçek çubuğu = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig3large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig4.jpg"> Şekil 4: karyotipler. (A) clonal HSPC kültürü ve (B) msc toplu örnek. Karyotürleri okuma-derinlik analizi ile belirlendi. Her iki grafik de karyotypically normal bir örnek gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig4large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig5.jpg"> Şekil 5: varyant allel frekansları histogram. Snvfı (VAF &gt; 0.3) son filtreleme adımına önce bir klon varyantların varyant allel frekansları histogram. VAF 'da bir zirve = 0,5 örnek clonal olduğunu gösterir. Düşük VAF ile subclonal mutasyonlar SNVFı (VAF &gt; 0.3) son filtreleme adımı sırasında hariç tutulur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig5large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig6.jpg"> Şekil 6: HSPC örneğinde somatik mutasyonların temsili mutasyonel spektrum analizi. Tasvir, her trinükleotid değişikine (orta üssün mutasyona uğramış olduğu) Toplam spektrumuna göreceli katkı oluşturmaktadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig6large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig7.jpg"> Şekil 7: ıGV16kullanarak mutasyonların manuel olarak incelenmesi. (A) mutations klonlama ve toplu örnek içinde mevcut olduğunda doğru olarak kabul edilir. (B) mutations kötü eşleştirilen bir bölgede mevcut olduğunda yanlış pozitis olarak kabul edilir. (C) mutasyonlar, germline denetiminde mevcut olduğunda yanlış pozitif olarak kabul edilir. Dikey çizgi, adlandırılan mutasyonun konumunu gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig7large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig8.jpg"> Şekil 8: gelişimsel soy ağacının inşası. Tasvir bir dendrogram gelişimsel kökleri geliştirme sırasında bölme gösteren olduğunu. Dendrogram altında heatmap farklı klonlar içinde mutasyonların varlığını gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig8large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>

Hücrelerdeki somatik mutasyon desenleri önceki mutajenik pozlamayı yansıtır ve gelişimsel soy ilişkilerini ortaya çıkarabilir. Burada sunulan bir metodoloji Katalog ve bireysel hematopoetik kök ve Progenitör hücrelerde somatik mutasyonları analiz etmektir.

Insan kanı mutasyonel yük ve Clonal bileşimi karakterize

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) gradually accumulate DNA mutations during a lifespan, which can contribute to age-associated diseases such ...

Bu yöntemle tek bir hematopoetik kök hücredeki mutasyon sayısını doğru bir şekilde belirleyebiliriz. Bu mutasyonlar mutasyon süreçlerini çözmek ve hematopoetik soyları incelemek için kullanılabilir. Yöntemimiz, hematopoetik kök hücreleri in vitro klonlayarak tüm genom amplifikasyon tekniklerinin kullanılmasını önler ve bu da daha düşük hata oranları ve downstream analizinin yararları ile sonuçlanır.Hematopoetik kök hücrelerin genomlarında bulunan mutasyonel desenler, maruz kaldıklarını gösteren mutajenik ve DNA onarım süreçlerini ortaya çıkarabilir. Metin protokolünde açıklandığı gibi örnek malzeme ve boyama hazırlanması ile bu prosedüre başlayın, sonra hematopoetik kök ve ata hücresi veya HSPC kültür ortamı 25 mililitre hazırlamak. Her kuyuda 75 mikrolitre HSPC kültür ortamı ile bir hücre kültürü 384 iyi plaka doldurun.Dış kuyularda ortamın buharlaşmasını önlemek için, dış kuyuları 75 mikrolitre steril su veya PBS ile doldurun ve bu kuyuları hücre sıralamaiçin kullanmayın. Uygun sinyal HSPC'lerinin doğru sıralanması bu protokoldeki en kritik adımdır. HSPC sıralama için kapıları, lekeli örnekten 10.000 hücredeki lekesiz bir kontrole göre ayarlayın.Doğrusal ileri dağılım yüksekliği ve ileri dağılım alanı fraksiyonu etrafında bir geçit çizerek tek hücreleri geçit. Soy fraksiyonu için bir geçit çizmek için lekesiz kontrol fraksiyonu kullanın. CD34 pozitif hücreler için geçitler çizin ve CD38 negatif, CD45RA negatif hücreler için belirli bir kapı ayarlayarak bu alt kümeyi daha da karakterize edin.384 kuyulu plakayı faks makinesine yükleyin ve tek hücreleri sıralayın. Faks makinesine uygulanabilirse, sıralanmış hücrelerin izlenmesini etkinleştirmek için dizin sıralama verilerini tutma seçeneğini belirleyin. Kültür tek tek sıralanmış HSC'ler için, şeffaf polietilen sargı kapağı ile 384-iyi kültür plakası sarın.384 kuyulu plakayı %5 karbondioksitiçeren nemlendirilmiş 37 derecelik bir kuvöze aktarın ve görünür klonlar ortaya çıkana kadar üç ila dört hafta kuvözde tutun. Dört haftalık kültürden sonra, hangi kuyuların %30 veya daha yüksek bir kesişme alanı olduğunu belirleyin. Her koni için, 1,5 mililitrelik mikrotüpleri %1'lik Bir mililitre BSA ve PBS ile doldurun ve tüpü ilgili kuyuya göre etiketlayın.Pipet ucuna yapışan hücre sayısını en aza indirmek için %1 BSA ve PBS içeren bir pipet ucunu önceden ısla. 75 mikrolitre olarak belirlenen 200 mikrolitrelik pipet ile kuyunun dibini kazırken orta yı en az beş kez yukarı ve aşağı şiddetle pipetler. Hücre süspansiyonu, kuyuya karşılık gelen etiketli mikrotüpte toplayın.Maksimum hücre alımını sağlamak için 75 mikrolitreye kadar taze %1 BSA ve PBS ile kuyuda pipetingi tekrarlayın. Klonsal olarak kültürlü hücreler kuyunun dibine yapışabilir. Tüm hücrelerin toplanıp toplanmadığından emin olmak için standart, ters ışık mikroskobu kullanarak kuyuları inceleyin.%30'dan fazla biraraya gelen tüm kuyular hasat edilmişse, 384 kuyuluk plakayı kuvöze geri yerleştirin. Klonal kültürler beş haftaya kadar çoğalabilir. Hücre süspansiyonundan 5 dakika 350 kez aşağı doğru çevirin.Küçük bir pelet görünür olmalıdır. Dikkatle supernatant yaklaşık beş mikrolitre hariç tüm kaldırın. Hücre peletleri eksi 20 derecede dondurulabilir ve DNA izolasyonundan önce birkaç ay saklanabilir.Siyonun ilk dallarında bulunan mutasyonlar da toplu örneklemde alt klonal olarak bulunacaktır. Daha sonraki dallanma soyu sadece HSPC'ler arasında paylaşılan mutasyonlarla tanımlanır. Klonların bir alt kümesinde bulunan ve toplu olarak subklonaly mevcut mutasyonları tanımlamak için, klonlar arasında paylaşılan somatik mutasyonlar için ilk filtre.Unix tabanlı bir terminalde filtersomatic'i edin. ne dosya pats ayarlamak ve diğer parametreleri ayarlamak. Filtresomatik çalıştırın.pi komut dosyası. LowVAF topluyu kullanarak subkonnaly olarak bulunan mutasyonlar için filtre uygulayın. bir Unix tabanlı terminalde r komut dosyası.Bu paylaşılan ve benzersiz tek nükleotit türevleri için ayrı vcf dosyaları oluşturacaktır. Toplu örneklemde bulunmayan klonlar arasında paylaşılan tüm mutasyonları, tüm mutasyon konumlarını örtüşerek belirleyin. IgV kısaltılmış Integrative Genomic Viewer kullanarak manuel inceleme ile yanlış pozitif hariç.Mutasyon tüm klonlarda germline mevcut olduğunda veya kötü eşlenen bölgelerde mevcut olduğunda mutasyonlar yanlış olarak kabul edilir. Gerçek mutasyonlar iki klon arasında paylaşılabilir veya subclonaly toplu olarak mevcut olabilir. Tüm paylaşılan loci'yi hedefli veya sanger sıralamasını kullanarak bağımsız olarak yeniden sırala.Paylaşılan mutasyonları kullanarak, mutasyonun mevcut olmadığını ve mutasyonun varlığını gösteren bir mutasyona karşı ikili bir mutasyon tablosu oluşturun. Mutasyon ikili tablosunu, R tabanlı işlevleri kullanan hücreler arasındaki soy ilişkilerini gösteren bir dendrogramla birlikte ısı haritası olarak çıktı. Isı haritası her hücre için mutasyon durumunu gösteriyor.Kopya numarası değişikliklerini denetlemek için kontrol üç c tarafından oluşturulan kopya numarası analizinin örnek çıktısı olarak gösterilir. Tek nükleotit varyant filtreleme tarafından oluşturulan varyant alel fraksiyonu çizimi, örnekteki varyant alel frekanslarının histogramıdır. Yoğunluk çizimindeki 0,5'lik bir tepe, örneğin klonal olduğunu gösterir.Burada 96 trinükleotit çizimi üreten tipik bir mutasyonal desen analizi gösterilmiştir. Farklı mutasyon türlerinin sayısallaştırılmasına ek olarak bu araçla imza çıkarma da yapılabilir. Klonlar arasında paylaşılan veya germline kontrolünde ki bir klonda bulunan mutasyonlar IGV kullanılarak doğrulanır.Mutasyonlar, örnekte mevcut olduğunda doğru olarak kabul edilir ve germline yüksek varyant alel frekans düzeylerinde değildir. Mutasyonlar IGV mevcut değil, hangi kötü eşlenen bölgelerde olabilir yanlış olarak kabul edilir. Diğer durumlarda, tek nükleotit varyant filtreleme ile tespit edilen olaylar germline varyantları cevapsız.Seçilen klonlarda bu mutasyonlar için mutasyonların hedeflenen sıralama ile bağımsız olarak sıralanması şiddetle tavsiye edilir. Klonlar arasında paylaşılan somatik mutasyonların tespitinden sonra, ikili bir matris oluşturulur, a ile m.the gelişimsel soy ağacı gösterilir paylaşılan mutasyonlar ile ve olmadan hücreleri içeren bir ısı haritası oluşturulur. Burada sunulan meta için bir sonraki adım olarak, hemopoetik kök hücrelerde aktif olan mutasyonel süreçler mutasyonel imza analizi kullanılarak belirlenebilir.

characterizing-mutational-load-and-clonal-composition-of-human-blood

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Burada LacI transgenik fare modeli kullanılarak arıtılmış, hematopoietik hücrelerin az sayıda için bir in vivo deneyini tarif mutagenez. LacI gen DNA mutantlarının sıklığı, yer ve tip kendiliğinden ortaya çıkan veya Genotoksinlerin maruz kaldıktan sonra belirlemek için izole edilebilir.

Saf Hematopoetik kök / progenitör hücrelerin DNA mutasyonları belirlenmesi

Bu protokol, lenfomaların rekombine immünoglobulin ağır zincirli VDJ bölgelerini derin dizileme ile sorgulamak ve tek tek tümörün klonal mimarisini tanımlamak için VDJ yeniden düzenlemesini ve somatik hipermutasyon durumunu geri almak için bir yaklaşımı tanımlar. Eşleştirilmiş tanı ve nüks örnekleri arasındaki klonal mimarinin karşılaştırılması, lenfoma nüks klonal evrim modlarını ortaya çıkarır.

VDJ-Seq: B Hücreli Lenfoma klonal Evrim Patterns Reveal Rearranged İmmünglobulin Ağır Zincir Gen Derin Sıralama Analizi

Burada, biz ayrıntıları teknik özellikleri ve sağlam IG Gen Dizi Analizi hastalarda kronik lenfositik lösemi (CLL), emin olmak için temel gereksinimleri dayalı Avrupa araştırma girişimi birikmiş deneyim bir iletişim kuralı mevcut CLL (ERIC).

Kronik Lenfositik Lösemi içinde immünglobulin Gene dizi analizi: Sıra yoruma hasta malzemeden

Burada monosit alt kümeleri tam kan akış sitometresi tarafından karakterize için bir iletişim kuralı mevcut. Bu nasıl alt kümeleri kapı ve onların ifade yüzey işaretlerinin değerlendirmek özetleyen ve M1 (iltihabi) ve M2 işaretleri (anti-inflamatuar) ifadesi değerlendirme bir örnek vererek içerir.

İnsan monosit alt kümeleri tam kan tarafından karakterizasyonu Akış Sitometresi Analizi

Bu makalede, belirli bir hastadan farklı örnekler arasında klonal ve subklonal değişiklikleri tanımlamak için bir yöntem açıklanmaktadır. Burada açıklanan deneyler belirli bir tümör tipine odaklansa da, yaklaşım diğer solid tümörler için genel olarak uygulanabilir.

Hedefe Yönelik Sıralama Yaklaşımı ile Karşılaştırmalı Lezyonlar Analizi

Burada, bir dalgalanma test gerçekleştirmek ve mikrobiyal mutasyon oranını tahmin etmek için bir protokol sunulmuştur. Bu protokol, araştırmacıların farklı mikrop ve ortamlardaki mutasyonları tetkik etmelerini sağlayarak genotip ve ekolojik bağlamın spontan mutasyon oranlarını nasıl etkilediğini belirleyecektir.

Dalgalanma Tsalimi ile Mikrobiyal Mutasyon Oranlarının Ölçülmesi

Mevcut protokol, kan örnekleri ve bağırsak biyopsilerinden DNA izolasyonu, yeni nesil sıralama için TCRβ ve IGH PCR kütüphanelerinin üretimi, bir NGS çalışmasının performansı ve temel veri analizi için bir yöntem tanımlamaktadır.

Yeni Nesil Dizileme Kullanılarak T ve B Hücre Reseptörü İmmün Repertuar Analizi

Kemik iliği naklinin (BMT) üç yöntemini tarif ediyoruz: toplam vücut ışınlamalı BMT, korumalı ışınlamalı BMT ve fare modellerinde klonal hematopoez çalışması için ön koşullandırması olmayan BMT yöntemi (benimseyen BMT).

Klonal Hematopoez Çalışması İçin Farelerde Kemik İliği Nakli İşlemleri

Deneysel evrim dondurulmuş arşivlerine kolayca uyarlanabilen tek nükleotid olmayan polimorfizm alel dinamiklerini takip etmek için uygun maliyetli bir yöntem geliştirdik. Üçlü PCR tekniği, deneysel evrim boyunca bir yerleştirme alelinin göreceli frekansını ölçmek için otomatik paralel kılcal elektroforez ile birleştirildi.

Deneysel Olarak Evrimleşmiş Popülasyonlarda Yapısal Varyantların Dinamiklerini Takip Etmek

Burada sunulan, hücre bölünmelerinin sayısını, yüzey hücresi fenotipini ve hücresel akrabalığı aynı anda ölçmeye izin veren akış sitometrisine dayalı bir tekniktir. Bu özellikler, permütasyon tabanlı bir çerçeve kullanılarak istatistiksel olarak test edilebilir.

Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücreler için Akış Sitometrisi ile Akrabalık, Bölünme Sayısı ve Fenotipin Eşzamanlı Değerlendirilmesi

Keşfedin, tek bir hematopoietik kök hücredeki somatik mutasyonları doğru şekilde belirlemek için biyoinformatik analiz yöntemlerini kullanarak. Bu yaklaşım, mutasyonel süreçleri ve soy hattı ilişkilerini çözümlemenize yardımcı olur.

Insan kanı mutasyonel yük ve Clonal bileşimi karakterize

Daha fazla video keşfet