Name: CAS9 protein-gRNA kompleksleri Electroporation yoluyla Axolotl omurilik nöral kök hücrelerinin doğrudan gen Knock-Out (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Öğrenin, aksolotl omurilik nöral kök hücrelerinde CAS9-gRNA kompleksi elektroporasyonu ile hızlı gen knock-out yapma yöntemini. Bu teknik omurilik rejenerasyonunun moleküler mekanizmalarını incelemek ve insan omurilik yaralanmaları için tedavi geliştirmek amacıyla kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Prof. Elly M. Tanaka 'ya sürekli ve uzun vadeli destek için teşekkür ederiz. Bu çalışma Çin 'in Ulusal Doğal Bilim Vakfı (NSFC) Grant (317716), Güney Çin normal Üniversitesi (S82111 ve 8S0109) ve bir Çin doktora sonrası Bilim Vakfı Grant (2018M633067) itibaren araştırma başlangıç hibe tarafından desteklenmektedir.

Tüm hayvan deneyleri, Hayvan deneylerinde yerel ve ulusal düzenlemelere uygun olarak ve ilgili kurumsal İnceleme Kurulu onayı ile yapılmalıdır.
1. CAS9-gRNA RNP karışımı hazırlama
<ol><li>GRNAs 'ı tasarlama ve sentezlemek. Not: sadece semenderlerin15,20,21,22ile ilgili biri dahil olmak üzere grnas tasarlama ve synthesizer için diğer yayınlara bakın.</li>
	<li>CAS9-NLS proteini ev içinde hazırlayarak veya ticari olarak satın alarak edinin.</li>
	<li>CAS9-gRNA karışımı 5 μg CAS9-NLS proteini, 4 μg gRNA, 0,9 μL 10X CAS9 tamponu karıştırarak hazırlayın ve hacmi 10 μL 'ye kadar doldurun-80 °C ' de hemen kullanılmamalıdır.</li>
</ol>2. Elektroporasyon için agaroz plakaları hazırlama
<ol><li>1x dpbs 'de% 2 (WT/Vol) agaroz çözeltisi 200 ml hazırlayın. Bir mikrodalga içinde solüsyonu ısıtarak çözülür ve yaklaşık 10 mm derinliğe 10 cm Petri yemekleri üzerine dökün (tüm hayvanı kapsayacak kadar derin).</li>
	<li>Plakaların oda sıcaklığında katılaşma izni verin. Hemen kullanılmadı ise 4 °C ' de depo plakaları.</li>
	<li>Cerrahi neşter kullanarak, kuyruk düz tutmak için bir yarık yapmak için agaroz plaka kesme, hayvan gövdesinde uygun bir iyi, ve elektrotlar yerleştirmek için iki ekstra kuyular (Şekil 1E).</li>
	<li>Plakayı buzun üzerine yerleştirin ve buz gibi soğuk 1x DPBS ile doldurun. Ayarda tutarlı elektrik iletkenlik sağlamak için plakaları yapmak için aynı DPBS çözümünü kullanın.</li>
</ol>3. elektroporator konfigürasyonu
<ol><li>Elektroporatörü yapılandırın. 5 ms, 50 MS aralığı ve hiçbir voltaj çürüme süresi ile 70 V bir Bipolar nabız oluşur Poring darbe ayarlayın. 50 MS süresi, 999 MS aralığı ve% 10 voltaj çürümesi ile 40 V dört Bipolar darbe için transfer nabız ayarlayın.</li>
	<li>Elektrotları elektroporator 'a bağlayın ve cımbların 7 mm dışında olmasını ayarlayın. Elektroporasyon arasında önce ve içinde dpbs bir kabı elektrotlar Submerge.</li>
</ol>4. mikroenjeksiyon cam kapillaries hazırlama ve yükleme
<ol><li>Isı değerini belirlemek için üreticinin talimatlarına göre bir alev/kahverengi mikropipet çektirme üzerinde bir rampa testi gerçekleştirin.</li>
	<li>Aşağıdaki parametreleri kullanarak konik uçları ile enjeksiyon kapillaries çekin: ısı = rampa test değeri, çekme = 100, hız = 100, zaman = 100.</li>
	<li>Stereomikoskop altında iğne gözlemlemek. İnce forseps kullanarak, eğri bir ucu var, böylece kapiller bir açı kırın. Cilt delmek için yeterince güçlü iken, merkezi kanal hedeflemek için yeterince ince bir pozisyonda break. Not: çapı yaklaşık 20 μm veya omurilik çapının yaklaşık% 50 olan nokta iyi bir başlangıç noktasıdır. Optimum kırma elde etmek için birden çok deneme gerekebilir.</li>
	<li>1:30 oranındaki RNP karışımlarına hızlı yeşil FCF solüsyonu ekleyin ve Microloader pipet ucu ile kapiller içine 5 μL enjeksiyon karışımı yükleyin.</li>
	<li>Pnömatik pompanın üzerine kapiller monte edin, eğimli ucu aşağı doğru bakacak şekilde.</li>
</ol>5. Pnömatik pompanın yapılandırılması
<ol><li>Pnömatik pompası yapılandırın. 0,5 inç kare başına pound (psi), 2 psi tutun ve süre Gated için çıkarmak için tutun ayarlayın.</li>
	<li>Kapiller bir damla su içine daldırma ve enjekte etmek için Ayak pedalına basarak kapiller ve pnömatik pompa ayarlarını test edin. Enjeksiyon karışımı yavaş ama sabit bir akışta çıkıyor emin olun.</li>
	<li>Enjeksiyon karışımı kendiliğinden sızmaya başlar veya su kapiller kadar emdi Eğer basılı tutun basıncı ayarlayın. Enjeksiyon karışımı çok yavaş çıkıyor Eğer ejeksiyon basıncı artırın veya kapiller daha fazla kırmak. Enjeksiyon çok hızlı çıkıyor Eğer ejeksiyon basıncı azaltın.</li>
</ol>6. omurilik içine RNP karışımı enjekte
<ol><li>% 0,03 Benzocain çözeltisi içinde en az 10 dk. içinde anestezize semenderlerin hayvanların su içinde ters onları saygısız tarafından duyarlı değildir kontrol edin.</li>
	<li>Yüzük forseps ile bir hayvan pick up ve silikon bir yatağa, hayvanın sol tarafı yukarı bakacak ve kuyruk sağa doğru işaret ile yatıyordu. Enjeksiyon alanını stereomikorkop görüş alanının ortasına konumlandırın (Şekil 1A).</li>
	<li>Mikromanipülatörü, kapiller görünüm alanının sağ tarafındaki 60 ° ' de gelecek şekilde ayarlayın (Şekil 1B).</li>
	<li>Omuriliği ve merkezi kanalı belirleyin (Şekil 1C). Not: omurilik notoakor üzerinde tübüler yapısı.</li>
	<li>Merkezi kanal hedefleyen, yavaşça omurilik merkezi kanala cilt ve kas delmek için kapiller ileriye taşıyın. Omurilik kuyruk kaslarının hemen altında olduğu için, kapiller hareketini küçük adımlarla sınırlandırın.</li>
	<li>Karışımı merkezi kanala enjekte etmek için ayak pedalını basılı tutun. RNP karışımı merkezi kanal boyunca her iki yönde mavi bir çizgi olarak yayılır olup olmadığını gözlemleyin, bu da kapiller doğru konumlandırılmış olduğunu gösterir (Şekil 1D).</li>
	<li>Bu gerçekleşmezse, RNP karışımı başlayana kadar kapiller hafifçe içeri ve dışarı hareket ettirirken ayak pedalını basılı tutun. Kapiller doku tarafından tıkanmış hale gelirse, yüksek basınçlarda suya fırlatarak temizleyin.</li>
	<li>Fırlatma basıncını, RNP karışımının merkezi kanalda yayılmasına neden olacak şekilde ayarlayın, ancak yapıyı havaya uçuracak kadar değil.</li>
	<li>İğne karışımı merkezi kanal boyunca daha da yayılır böylece ayak pedalı basılı tutmaya devam, beyin omurilik ve ventrikül sonunda Terminal vezikül ulaşır kadar. Not: Bu, hayvanın boyutuna bağlı olarak 2 dakikaya kadar sürebilir. RNP karışımı beyin ventrikül girmek için neden bir süre sonra basıncı artırmak için gerekli olabilir.</li>
	<li>Başarılı enjeksiyondan sonra Elektroporasyon mümkün olan en kısa sürede devam edin.</li>
</ol>7. Elektroporasyon
<ol><li>Hayvanları halka forseps ile hazırlanan agaroz Elektroporasyon plakasına (Şekil 1E) buz üzerinde aktarın. Kuyruğunu yarık içine yerleştirin, böylece agaroz (Şekil 1F) ile sandviç yapın.</li>
	<li>Elektrotları kuyruğun her iki tarafındaki kuyulara yerleştirin. Tüm hayvan ve elektrotlar buz-soğuk PBS ile kaplıdır emin olun.</li>
	<li>Electroporation başlatmak için ayak düğmesine basın.</li>
	<li>Elektroporasyon tamamlandıktan sonra, hayvan suya geri dönün.</li>
	<li>Gerekirse daha fazla hayvan enjekte etmeye devam edin.</li>
	<li>Anestezi kapalı giydikten sonra electroporated hayvanların sağlıklı olup olmadığını kontrol edin ve kuyruğuna yapılan herhangi bir hasar yoktur.</li>
</ol>8. vuruş verimliliğini değerlendirmek
<ol><li>Electroporated hayvanın kuyruğunu düzelt. Kuyruk çapraz bölümler yapmak immünohistokimyasal boyama tarafından takip protein düzeyinde knock-out verimliliğini değerlendirmek için. Not: Eğer bir kuyruk amputasyonu Electroporation sonra gerçekleştirilecek ise, kesme kuyruğu bu amaçla kullanılabilir. GFP veya tyrosinase karşı gRNAs ile electroporated hayvanlar, Örneğin, negatif kontrol olarak kullanılabilir4.</li>
	<li>Alternatif olarak, electroporated omurilik çıkarılan ve DNA için lysed olabilir. Düzenlenmiş genetik loci15yüzdesini değerlendirmek Için Sanger sıralamayı veya yeni nesil sıralamanın ardından Genotipleme PCR gerçekleştirin. Not: sonuç düzenleme verimliliği nscs için gerçek düzenleme verimliliği hafife, non-electroporated hücrelerin ve merkezi lümene apikal temas eksikliği ve böylece RNP karışımı almazsınız nöronlar dahil nedeniyle.</li>
</ol>

<ol><li>O'Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+of+the+ependyma+during+axolotl+spinal+cord+regeneration%3A+Changes+in+intermediate+filament+and+fibronectin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression.</a> Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).</li>
<li>Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+Central+Nervous+System+During+Salamander+Tail+Regeneration+from+the+Implanted+Neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Soil+and+Environment%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres.</a> Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).</li>
<li>Nordlander, R. H., Singer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+ependyma+in+regeneration+of+the+spinal+cord+in+the+urodele+amphibian+tail%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail.</a> Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).</li>
<li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-+and+time-directed+electroporation+of+CAS9+protein%E2%80%93gRNA+complexes+in+vivo+yields+efficient+multigene+knock-out+for+studying+gene+function+in+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22npj+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein–gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration.</a> npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002(2016).</li>
<li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+genomic+deletion+of+Sox2+in+the+axolotl+shows+a+requirement+in+spinal+cord+neural+stem+cell+amplification+during+tail+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).</li>
<li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), Cambridge, England. 2165-2171 (2014).</li>
<li>Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+of+genome-edited+alleles+reveals+high+fidelity+axolotl+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Fei, J. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences.+201706855%22%5BJournal%5D)">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).</li>
<li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).</li>
<li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li>
<li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromosome-scale+assembly+of+the+axolotl+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">A chromosome-scale assembly of the axolotl genome.</a> Genome Research. 373548, (2019).</li>
<li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sal-Site%3A+Integrating+new+and+existing+ambystomatid+salamander+research+and+informational+resources%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources.</a> BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).</li>
<li>Campbell, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al+Gene+expression+profile+of+the+regeneration+epithelium+during+axolotl+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration.</a> Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).</li>
<li>Stewart, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+RNA-seq+Analysis+in+the+Unsequenced+Axolotl%3A+The+Oncogene+Burst+Highlights+Early+Gene+Expression+in%5BTitle%5D)+AND+%22the+Blastema.+PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in.</a> the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).</li>
<li>Fei, J. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+and+optimization+of+CRISPR%E2%80%93Cas9-mediated+genome+engineering+in+axolotl+%28Ambystoma+mexicanum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Application and optimization of CRISPR–Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).</li>
<li>Holder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+growth+of+the+motor+system+in+the+axolotl%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Continuous growth of the motor system in the axolotl.</a> Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).</li>
<li>Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salamander+spinal+cord+regeneration%3A+The+ultimate+positive+control+in+vertebrate+spinal+cord+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration.</a> Developmental Biology. 432 (1), 63-71 (2017).</li>
<li>Albors, A. R., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Efficiency+Electroporation+of+the+Spinal+Cord+in+Larval+Axolotl%5BTitle%5D)+AND+%22Salamanders+in+Regeneration+Research%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl.</a> Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).</li>
<li>Albors, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al+Planar+cell+polarity-mediated+induction+of+neural+stem+cell+expansion+during+axolotl+spinal+cord+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration.</a> eLife. 4, 1-29 (2015).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR%2FCas+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).</li>
<li>Graham, D. B., Root, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resources+for+the+design+of+CRISPR+gene+editing+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Resources for the design of CRISPR gene editing experiments.</a> Genome Biology. 16 (1), 260(2015).</li>
<li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+axolotl+%28Ambystoma+mexicanum%29+husbandry%2C+breeding%2C+metamorphosis%2C+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar hiç bir ilgi çatışması bildirmiyor.

Açıklanan protokol, Axolotl omuriliğinde NSCs 'de zaman ve uzaya kısıtlı gen çarpmasına olanak sağlar. Geçerli protokol, NSCs 'nin belirli bir zaman ve konumda yüksek penetrance ile belirli hedeflemesini sağlar. CRE-LoxP sistemini kullanırken ortaya çıkan beyin gibi diğer bölgelerde NSCs 'deki gen knock-out ' d a n kaynaklanan potansiyel istenmeyen efektleri önler. Aynı zamanda kalıcı bir knock-out kaynaklanan gelişimsel etkileri önler, gen fonksiyonu rejenerasyon odaklı çalışma izin. Buna ek olarak, bu protokol, CRE-Lox...

Çoğu omurgasının omuriliği, kalıcı sakatlığa yol açan yaralanma sonrasında yeniden üretilemiyor. Axolotl gibi birçok Salamanders önemli istisnalar içindedir. Axolotl tamamen yapısal olarak özdeş bir omurilik yeniden üretebilir ve tamamen omurilik fonksiyonunu geri. Axolotl omurilik rejeneratif kapasitinin çoğunu ependim hücrelerden kaynaklanmaktadır. Bu hücreler merkezi kanalı hizalar ve memelilerin aksine, Axolotl ependim hücreler nöral kök hücreler (nscs) sonrası embriyonik gelişim olarak kalır. Omurilik yaralanması (örneğin, bir kuyruk amputasyonu) sonra, bu nscs ependim tüp regrow çoğalırlar ve kayıp nöronların yerine ayırt1,2,3. Axolotl omurilik NSCs 'lerin pluripotent olarak kaldığı ve yaralanma sonrasında aktif hale getirilmesinde, insan hastaları için yeni terapötik stratejiler geliştirme konusunda değerli bilgiler temin edilebilir.
Crispr-Cas9 gen knock-out tekniğinde yapılan ilerlemeler nedeniyle, deşifre gen fonksiyonunun çökmesini gerçekleştirmek daha kolay hale gelmiştir ve semenderlerin4,5 de dahil olmak üzere çeşitli türlerin geniş uygulanabilirliğini göstermiştir. 6 , 7 , 8. tam Axolotl genom ve transkriptom son sürümü şimdi herhangi bir genomik Locus hedeflenmesini sağlar ve off-hedef etkileri için daha iyi değerlendirmek için9,10,11,12 , 13 ' ü , 14. Crispr-Cas9 sistemi15kullanarak aksiyolotlar içinde knock-out ve knock-in için iyileştirilmiş protokoller geliştirilmiştir. Cas9 protein-Grna ribonukleoprotein (RNP) şeklinde Crispr-Cas9 makinenin teslimi, Cas9 ve Grna-kodlama plazmids4kullanarak daha verimli olduğu gösterilmiştir. Bu büyük olasılıkla RNP Plasmid vektörler daha küçük olması nedeniyle, onun yeteneği hemen DNA tatili oluşturmak ve RNA bozulması gRNA koruma. Buna ek olarak, RNPs kullanarak transkripsiyon ve çeviri atlar; Böylece, Plasmid elemanları farklı bir türden türetildiği zaman Organizatör gücü ve optimum kodon kullanımı gibi sorunları önler.
Fonksiyon kaybı çalışmaları, ilgi genlerinin potansiyel işlevlerini araştırmak için genel yaklaşımlardan biridir. Rejenerasyon sırasında gen fonksiyonunu incelemek için, bir vuruş ideal gelişim üzerindeki etkileri önlemek için bir yaralanma hemen önce yapılmalıdır. Ayrıca, knock-out hem NSCs hem de rejenerasyon bölgesi ile sınırlandırılmalıdır. Tüm NSCs 'deki hedef geni (CRE-LoxP sistemlerinde bulunan beyinde de dahil olmak üzere) bir vuruş, sonuçların yorumlanmasında bulunabilen rejenerasyona bağlı olmayan efektler üretebilir. Neyse ki, Axolotl omuriliğin yapısı NSCs 'de zaman ve boşluk kısıtlanması için benzersiz bir fırsat sağlar. Omurilik nscs çoğu merkezi kanal ile temas halinde ve merkezi kanal ile temas hücrelerin büyük çoğunluğu teşkil16,17. Bu nedenle, CAS9-Grna kompleksinin merkezi kanala enjekte edilmesi, ardından Elektroporasyon, belirli bir zamanda istenilen bölgede omurilik nscs 'ye teslim edilmesini sağlar4,18,19. Bu protokol, bunun nasıl gerçekleştirileceğini, hedeflenen omurilik NSCs 'de son derece penetran bir vuruş yapmaya neden olduğunu gösterir. daha sonra rejenerasyon ve NSC davranışı üzerindeki etkileri incelemek için sonraki analiz gerçekleştirilir.

<table><tbody><tr><td>Agaroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Benzokain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1501-100G</td><td></td></tr><tr><td>Benzokain% 0.03 (ağırlıkça / hacim)</td> <td>500 ml 10 kez karıştırın; TBS, 500 ml %400 (ağırlıkça/hacim) Holtfreter' S çözeltisi ve 30 mL %10 (ağırlıkça/hacim) benzokain stok çözeltisi. Hacmi dH2O ile 10 L'ye kadar doldurun. Çözelti oda sıcaklığında 6 aya kadar saklanabilir.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benzokain %10 (ağırlıkça/hacim)</td><td>50 g benzokaini 500 ml %100 (hacim/hacim) etanol içinde karıştırın. Çözelti oda sıcaklığında 12 aya kadar saklanabilir.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat cam kılcal damarlar 1,2 mm OD, 0,94 mm İç Çap</td><td>Kekemelik Aleti&nbsp;</td><td>BF120-94-8</td><td></td></tr><tr><td>CaCl<alt>2</alt> ve orta nokta; CAS9 tamponu 102382 2H2O</td><td>Merck</td><td></td>, 10x RNaz içermeyen suda 200 mM HEPES ve 1,5 M KCl'yi karıştırın.<td></td></tr><tr><td></td><td> PH'ı 7.5'e ayarlayın. Filtre sterilize edin, alikot yapın ve eksi derecede saklayın; 20 derece > 24 aya</td><td></td><td></td>kadar</tr><tr><td>C CAS9-NLS proteini&nbsp; &nbsp;</td><td>PNA Bio</td><td>CP03</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü kapları, 10cm</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 - İnce Forseps</td><td>İnce Bilimsel Aletler</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporatör</td><td>Nepa Gene&nbsp;</td><td>NEPA21</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BEX</td><td>Nabız Jeneratörü CUY21EDIT II</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı Yeşil FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı Yeşil FCF Çözeltisi, 5x</td><td>12.5 mg Hızlı Yeşil FCF tozunu 10 mL 1 kez çözün; Pbs.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alevli/Kahverengi Mikropipet Çektirme&nbsp;</td><td>Kekemelik Aleti&nbsp;</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Holtfreter' S Çözeltisi% 400 (Ağırlık / Hacim) & nbsp;</td><td>11.125 g MgSO4&middot'u çözün; 7H2O, 5.36 g CaCl2&middot; 10 L dH2O'da 2H2O, 158.4 g NaCl ve 2.875 g KCl. Çözelti oda sıcaklığında 6 aya kadar saklanabilir.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Merck</td><td>105886</td><td></td></tr><tr><td>Mikro yükleyici pipet uçları</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipülatör&nbsp;</td><td>Narişige</td><td>MN-153&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>106404</td><td></td></tr><tr><td>Pnömatik PicoPump</td><td>World Hassas Aletler&nbsp;</td><td>SYS-PV830</td><td></td></tr><tr><td>Halka Forseps</td><td>İnce Bilimsel Aletler</td><td>11103-09</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZX10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris bazı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Tris tamponlu salin, 10x</td><td>990 ml dH2O içinde 24.2 g Tris bazını ve 90 g NaCl'yi çözün. 10 ml %37 (hacim/hacim) HCl ekleyerek pH'ı 8.0'a ayarlayın. Çözelti oda sıcaklığında 6 aya kadar saklanabilir.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Değişken Boşluklu Cımbız 2 Yuvarlak Platin Plaka Elektrot, 10mm çaplı</td><td>Nepa Gene&nbsp;</td><td></td><td></td>CUY650P10</tr></tbody></table>

cas9 protein-grna kompleksleri electroporation yoluyla axolotl omurilik nöral kök hücrelerinin doğrudan gen knock-out

Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

Axolotl, omuriliği tamamen yeniden üretebilmek için eşsiz bir yetenektir. Bu büyük ölçüde, ependim tüp reform ve spinal kord yaralanmasından sonra kayıp nöronlar ayırt çoğalırlar yaşam boyunca nöral kök hücreleri (nscs) olarak kalan ependim hücreler kaynaklanmaktadır. Bu nscs 'nin pluripotkans sonrası gelişimini nasıl koruyacağı ve spinal kord yaralanması üzerine çoğalırlar tam ön yaralanma yapısının yeniden çözülmesi, memelinin spinal tellerinin nasıl rejenere olduğu ve potansiyel tedavi seçeneklerinin nasıl ortaya çıktığı konusunda değerli bilgiler sunabilir. Kısıtlı bir süre içinde nscs 'nin belirli alt kümelerinde gen çarpması gerçekleştirme, kalkınma müdahaleci etkileri ile şaşırtmadan bu rejeneratif süreçlerin arkasındaki moleküler mekanizmaların incelenmesi sağlayacaktır. Burada açıklanan, CRISPR-Cas9 sistemi kullanılarak Axolotl omurilik NSCs içinde gen knock-out gerçekleştirmek için bir yöntemdir. CAS9-gRNA kompleksini omurilik merkezi kanalına enjekte ederek, Elektroporasyon sonrasında, hedef genler, NSCs 'de omuriliğin belirli bölgelerinde istenen bir zaman noktasında yıkıldı, spinal kord NSCs 'de Moleküler çalışmalar için izin Rejenerasyon.

Sox2 karşı CAS9-Grna kompleksinin enjeksiyonu ve electroporasyonu, Axolotl omurilik merkezi kanalına, spinal kord nscs çoğunluğu IÇINDE büyük Sox2 immünoreactivity kaybına yol açtı, Grna, Tyrosinaz (TYR) karşı bir kontrol olarak (Şekil 2 A). B3-tubulin (TUJ1 ile lekelenmiş), nöronlar için bir Işarettir ve nscs 'de ifade edilmedi ve merkezi kanalı çevreleyen SOX2-TUJ1-hücreler SOX2 silmeleri barındıran hücreler olarak kabul edildi. Miktarlama, CAS9-Sox2<...

Burada sunulan, CAS9-gRNA kompleksini omurilik merkezi kanalına enjekte ederek, akolotl spinal tellerinde zaman ve uzaya kısıtlı gen vuruş yapmak için bir protokoldür ve ardından Electroporation.

CAS9 protein-gRNA kompleksleri Electroporation yoluyla Axolotl omurilik nöral kök hücrelerinin doğrudan gen Knock-Out

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

Bu protokol, omurilik rejenerasyonunun moleküler mekanizmalarının incelenmesi için axolotl spinal kord sinir kök hücrelerinde hızlı ve yüksek nüfuz lu zaman ve uzay kısıtlamalı gen nakavtları sağlar. Bu teknik, nöral kök hücrelerde gen fonksiyonunun incelenmesini, diğer hücre tiplerinden gelen gelişimsel etkiler veya etkilerle şaşkına girmeden tıbbi yenilenmesine olanak sağlar. Axolotl nöral kök hücreler omuriliklerini yenileme yeteneklerine büyük ölçüde katkıda bulunurlar.Rejenerasyon mekanizmaları anlamak insan omurilik yaralanması için tedavi geliştirmek için anlayışlar yol açabilir. Bu yöntem, axolotl nöral kök hücrelerin omurilik yaralanmasına karşı rejeneratif bir yanıt ı nasıl monte ettiğine dair içgörü sağlar. Enjeksiyon kılcal damarını omurilik merkezi kolona doğru konumlandırmak zor olabilir ve test hayvanları üzerinde pratik yapmak teknikte ustalaşmaya yardımcı olur.Yönetimi görüntülemek nasıl enjeksiyon gerçekleştirmek ve başarılı bir enjeksiyon gibi görünüyor gösterebilir. Cas9 kılavuzu RNA ribonnükleer protein karışımını hazırlamak için beş mikrogram Cas9 nükleer lokalizasyon sırası proteini, dört mikrogram kılavuz RNA ve 0,9 mikrolitre 10X Cas9 tamponunu karıştırın.

direct-gene-knock-out-axolotl-spinal-cord-neural-stem-cells-via

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Bu video nöronların genetik olarak tanımlanan gruplar aksonal yollar kullanarak embriyonik civciv omurilik görselleştirmek için nasıl...

Nöronlar, Genetik Tanımlı Gruplar Aksonal tanımında kullanılması Civciv Nöral Tüp Deşifre Ovo Elektroporasyon

Periventriküler Nodüler Heterotopya (PNH) malformasyonu kortikal gelişim (MCD) en sık görülen yetişkinlikte ama genetik temeli en dağınık durumda bilinmeyen kalır. Biz son zamanlarda roman aday genler MCD'ler için tanımlamak için ve doğrudan kendi etken rol içinde vivoonaylamak için bir strateji geliştirdik.

Dizi-CGH, Bütün exome sıralama ve rahim içinde elektroporasyon Rodents beyin malformasyonlar için sorumlu genlerin tanımlamak için birleştirerek yeni bir strateji

Gen hedefleme mutajenez genom düzenleme teknikleri kullanılarak organizmaların geniş bir mümkündür. Burada, Astyanax mexicanus, yüzey balık ve cavefish içeren balık türlerinin efektör nükleazlar (Talens) gibi transkripsiyon aktivatörü kullanılarak hedeflenen gen mutasyon için bir protokol göstermektedir.

genom Düzenleme<em&gt; Astyanax mexicanustan</emKullanma&gt; Transkripsiyon Aktivatör benzeri Efektör Nükleazlar (Talens)

Gen kanal yayın balığı embriyo CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak düzenleme için basit ve etkili mikroenjeksiyon protokol sunulmuştur. Bu protokol için RNA'ların rehberlik ve Cas9 protein tek hücreli embriyo sarısı microinjected. Bu protokol iki kanal yayın balığı bağışıklık ile ilgili genlerin knocking tarafından doğrulandı.

CRISPR/Cas9 Protein gen düzenleme için mikroenjeksiyon kanal yayın balığı, Ictalurus yılan, embriyo içine

Bir iletişim kuralı için hızlı fare CRISPR/Cas9-aracılı gene bozulma ve insan birincil hematopoetik hücreler bu makalede açıklanan. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins elektroporasyon ile vitro transkripsiyon ve ticari Cas9 ile oluşturulan sgRNAs ile tanıtılmaktadır. Yüksek Düzenleme verimliliği sınırlı zaman ve maliyet ile elde edilir.

Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma

Geleneksel işlev kaybı çalışmalar nakavt hayvanlar kullanarak genlerin kez pahalı ve zaman alıcı olmuştur. Somatik mutagenesis CRISPR-aracılı Elektroporasyon tabanlı gen içinde vivoişlevleri anlamak için güçlü bir araçtır. Burada, nakavt fenotipleri beyincik Proliferasyona hücrelerdeki analiz etmek için bir yöntem raporu.

CRISPR-aracılı kaybı serebellar granül işlev analizinin gen transferi Elektroporasyon tabanlı rahim içinde kullanarak hücreleri

Burada, CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak , Trypanosoma cruzi 'nin ekstrellüler amastigote içine bir gen nakavt tanıtmak için bir protokol açıklanmaktadır. Büyüme fenotipi ya akenik amastigote kültürün hücre sayımı ya da ana hücre istilasından sonra hücreli formları proliferasyonu ile takip edilebilir.

CRISPR/Cas9 sistemi kullanılarak Trypanosoma cruzi 'Nin Amastigote aşamasına doğrudan bir gene Knockout tanıtımı

Bu protokolün amacı, embriyonik doku aşılama teknikleri kullanılarak Cas9-mutajenize donör dokusundan elde edilen haploid forelimbs ile şimerik axolotls üretmektir.

Embriyonik Greftleme Yoluyla Mutant Haploid Ekstremiteler ile Şemerik Axolotls Üretimi

Primat serebral organoidlerinin elektroporasyonu, primat (pato) fizyolojik neokorteks gelişimine yakın bir model sistemde farklı progenitör tiplerine ve nöronlara geçici genetik modifikasyonları tanıtmak için kesin ve etkili bir yaklaşım sağlar. Bu, nörogelişimsel ve evrimsel süreçlerin incelenmesine izin verir ve hastalık modellemesi için de uygulanabilir.

Genetik Modifikasyon için Primat Serebral Organoidlerinin Hedefe Yönelik Mikroenjeksiyonu ve Elektroporasyonu

Bu protokol, in vitro olarak bir araya getirilen ve elektroporasyon yoluyla iletilen Cas9-sgRNA ribonükleoprotein kompleksleri kullanılarak fare kemik iliği türevi makrofajlarda genom düzenleme prosedürünü açıklar.

Elektropore Cas9-sgRNA Kompleksleri Kullanılarak Primer Kemik İliği Kaynaklı Makrofajlarda Yüksek Verimli Gen Bozulması

THP-1 hücre hattı, biyoloji ile ilgili çeşitli araştırma alanlarında insan monositlerinin / makrofajlarının işlevlerini araştırmak için bir model olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu makale, sağlam ve tekrarlanabilir fenotipik verilerin üretilmesini sağlayan verimli CRISPR-Cas9 tabanlı mühendislik ve tek hücreli klon izolasyonu için bir protokolü açıklamaktadır.

THP-1 Hücrelerinde Elektroporasyon Tabanlı CRISPR-Cas9 Aracılı Gen Nakavt ve Tek Hücreli Klon İzolasyonu

Öğrenin, aksolotl omurilik nöral kök hücrelerinde CAS9-gRNA kompleksi elektroporasyonu ile hızlı gen knock-out yapma yöntemini. Bu teknik omurilik rejenerasyonunun moleküler mekanizmalarını incelemek ve insan omurilik yaralanmaları için tedavi geliştirmek amacıyla kullanılır.

CAS9 protein-gRNA kompleksleri Electroporation yoluyla Axolotl omurilik nöral kök hücrelerinin doğrudan gen Knock-Out

Daha fazla video keşfet