Murine Ince bağırsak INTRAEPİTELYAL lenfosit intravital görüntüleme

İntravital mikroskopi ince bağırsak mukozası farklı bağışıklık hücresi tipleri arasında epitel içinde hücresel etkileşimlerin spatiotemporal dinamikleri içine fikir sağlayabilir, ya da bu iki bölme arasında. Bu tekniğin en büyük avantajı, bağırsak mukozası içinde yüksek hızlı ve yüksek çözünürlüklü görüntülerin gerçek zamanlı olarak elde edilmesine olanak sağlamasıdır. Bağırsak canlı görüntüleme hücresel etkileşimleri içine ek fikir sağlayabilir, veya hücre sinyalmukozal bağışıklık dahil, epitel biyoloji veya kanser biyolojisi.

Bu, cerrahi tekniğin uygulanmasının yanı sıra görüntü edinimi için farenin sabır ve optimum konumlandırılmasını gerektiren zorlu bir yöntemdir. Bir anestezi transgenik fare ayak tutam yanıt eksikliği doğruladıktan sonra, gelişmiş bir yeşil floresan protein ifade, veya EGFP, Gamma-delta T-hücre reseptörü, yavaş yavaş retro-orbital venöz sinüs içine taze hazırlanmış Hoechst 33342 Boya Çözeltisi 200 mikrolitre enjekte etmek için bir tüberkülin şırınga kullanın. Enjeksiyondan 1-2 dakika sonra, kurumasını önlemek için hayvanın gözlerine merhem uygulayın.

Daha sonra, alt karın orta hattı boyunca deri ve periton yoluyla 2CM dikey kesi yapmak ve dikkatle periton boşluğundan caecum çekmek için açılı forceps kullanın. Minimal dışkı içeriği içeren ince bağırsağın 2-3CM alanını belirleyin, mezenterik kan damarlarını yırtmamaya özen gösterdiniz ve kaecum ve kalan ince bağırsağı periton boşluğuna dikkatlice geri getirin ve ilgi segmentini dışsallaştırın. Altı çizili mezenterin her iki tarafına iki çift forceps yerleştirerek, hafifçe birlikte membran bir delik oluşturmak için forceps uçlarını ovmak.

Açılı çalgılar ve 5CM dikiş bağlı kavisli konik nokta iğne kullanarak, membran deliğinden periton bir tarafı nüfuz, ve periton astar diğer tarafında üzerinden yukarı, üst bir dikiş yerleştirerek, ve kesi kapatmak için kesi altına yakın başka, bağırsak dışsal döngü tutarken. Başarı olasılığını artırmak için, abdominal dikiş yerleştirerek herhangi bir kan damarını kravat veya gözyaşı yok ve bağırsak herhangi bir yabancı kullanımı sınırlamak. Daha sonra, aynı şekilde bağırsak döngü altında deri kapatın, altı çizili periton önceki dikişler arasında kesi ortasında bir dikiş yerleştirerek.

Bir elektrokoter kullanarak, antimesenteric sınır boyunca perforasyon bir çizgi yapmak ve hemen ek ısı kaynaklı doku hasarı önlemek için bağırsak yüzeyine su birkaç damla uygulayın. Artık suyu çıkarmak için kimwipe ile blot. Koterize dokunun distal kenarında yaklaşık 1,5 CM yatay yarık kesmek için vanna makas kullanın, koterize çizgi uzunluğu boyunca, dışsal doku segmentinin proksimal sonuna doğru.

Mukozal yüzey maruz kaldığında, doku sulu tutmak için nemli bir kimwipe ile karın kapağı. İplik Disk Konfokal Mikroskopi Görüntüleme için fareyi kapalı bir kaptaki mikroskoba taşıyın. Görüntüleme yazılımını başlatın ve mikroskobun başını geriye doğru yatırın ve 1 mikromolar pire Alexa Fluor boyası ve Hank'in Tamponlu Tuzlu Solüsyonu'nu cam kapağın kaymış dibine 150 mikrolitre ekleyin.

Fareyi, açılan mukozal yüzeyin doğrudan kapak kaymasına temas edecektir. Önceden ısıtılmış bir kuluçka makinesinde fareyi ve yemeği görüntüleme aşamasına yerleştirin. Her lazer için Uyarma Yoğunluğunu ve Pozlama Süresini sırasıyla en fazla 10-15 miliwatt ve 120-150 milisaniye olarak ayarlayın ve Çerçeve Ortalamasını 2 olarak ayarlayın.

Arka plan gürültüsünü azaltmak için Elektron Çarpankazancı işlevini açın ve piksel boyutunun doğru bir ölçümünü sağlamak için 63X Hedef Kalibrasyon'u seçin. 405 nanometre lazer ve 20X hava hedefi kullanarak, fark hareket veya sürüklenme eksikliği villi bir alan bulmak için çekirdekleri elle görselleştirmek, solunum nedeniyle artifreal hareket alanları kaçınarak, peristalsis veya kalp atışı. X-Y Scan kullanarak, ilgi alanının X-Y koordinatını kaydedin ve gliserol daldırma 63X hedefine geçin.

Seçili alandaki villinin kararlı olduğunu doğrulamak için 405 nanometre kanalda 1 dakikaya kadar canlı görüntü elde edin ve villus ucunun hemen altındaki ortogonal düzlemi bulmak için odağı ayarlayın. Daha sonra villus uç epitelinin hemen altından başlayarak, 1,5 mikrometre basamak kullanarak çekirdekleri çözmek zor olana kadar yaklaşık 15-20 mikrometre aşağı villus'a kadar z-yığınları elde edin. Satın alma başladıktan 3-5 dakika sonra, görüntü istikrarı ve Gama-delta Intraepitelyal Hücre Hareketliliği onaylamak ve villi her alan için 30-60 dakika görüntüleri elde devam.

Gamma-delta İntraepitelyal Lenfositler dinamik bir gözetim davranışı sergilerler, bu davranışta, epifite, bodrum zarı boyunca göç ederek ve çalışma durumundalateral hücreler arası uzaya doğru devriye gezerler. Bu temsili görüntülerde, renkli izler 30 dakika boyunca bireysel Gama-delta Intraepitelyal Lenfositlerin göç yollarını gösterir. İntraepitelyal Lenfositlerin lateral hücreler arası alanda sıklığı anti-interlökin-2 reseptör beta antikorile tedavi edilen farelerde artmış olsa da, bu Gama-delta İntraepitelyal Lenfositlerin %30'dan fazlası rölanti davranışı sergilemiştir.

Bu rölrede fenotip, kontrollere göre interlökin-2-reseptör blokoksiyonu takiben Gama-delta İntraepitelyal Lenfositlerin hem anlık hızında hem de hapsedilme oranında önemli bir azalma ile doğrulandı. Ayrıca, boştaki Gama-delta İntraepitelyal Lenfositler daha uzun süre lere sahipti ve daha sık lateral hücreler arası alan içinde lokalize edildi, hareketli Gamma-delta Intraepitelyal Lenfositler ile karşılaştırıldığında. Peristalsis nedeniyle aşırı hareket eksikliği villi alanları belirlemek zor olabilir.

Fareyi yeniden konumlandırmak daha kararlı bir alanın bulunmasına yardımcı olabilir. Hücre izleme verilerinin daha fazla analizi, belirli hareketlilik davranışını belirlemeye veya hücresel etkileşimleri ölçmek için ek ölçümler sağlamaya yardımcı olabilir. İntravital Görüntüleme ve IEL-motilite analizi, doğuştan gelen immün sinyalin Gama-delta IEL işlevini nasıl düzenlediğine dair fikir veren, IEL fonksiyonunun standart bir okuma-out'u haline gelmiştir.