Name: Kitosan filmlerde ınsan periodontal ligament hücre kürleri oluşumu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 14 s
Description: Öğrenin, kitosan filmler kullanarak insan periodontal ligament hücre kürelerinin üç boyutlu kültürünü. Bu yöntem, hücrelerin kendini yenileme ve osteojenik farklılaşma yeteneklerini geleneksel yöntemlere göre artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmada Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (NSFC 81700978), orta üniversiteler için temel araştırma fonları (1504219050), Şangay doğal Bilim Vakfı (17ZR1432800) ve Şangay Medikal keşif projesi ( 17411972600).

Çalışma protokolü, Tongji Üniversitesi, okul ve Stomatoloji Hastanesi Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. Tüm hastalar yazılı bilgilendirilmiş onay sağladı.
1. PDL hücre yalıtımı
<ol><li>PDL hücrelerinin kültürü için proliferasyon ortamı yapın: α-MEM orta% 10 FCS ve 100 U/mL kalem/strep ile desteklenmektedir.</li>
	<li>İzole üçüncü Molars aktarmak için buz ile bir kap hazırlayın.</li>
	<li>Cerrahi aletleri otoklav kullanarak sterilize edin.</li>
	<li>Okul ve hastane stomatology, Tongji Üniversitesi Diş Kliniği 'nde yetişkinlerden (18-28 yaş) normal insan etkilenen üçüncü azı özü.</li>
	<li>Üçüncü azı 'ı proliferasyon ortamına yerleştirin ve 4 °c ' de laboratuara aktarın.</li>
	<li>Çıkarılan dişleri steril 100 mm Petri çanağına yerleştirin ve Biohazard laminar akış kaputu içinde çalışır.</li>
	<li>Çıkarılan dişleri yıkamak için 10 mL PBS ekleyin. Yıkama adımını iki kez tekrarlayın.</li>
	<li>Steril bir neşter kullanarak PDL 'i kökten yavaşça ayırın. Not: PDL diş eti veya apikal dokulardan kontaminasyonları önlemek için kökünün orta üçüncü bölümünden kazınmış olmalıdır.</li>
	<li>Sterilize edilmiş bir neşter bıçağı yardımıyla 1-2 mm 'lik parçalara Mince PDL.</li>
	<li>3-4 mL proliferasyon ortamı ile dolu bir T-25 kültür Flask, PDL parçaları yerleştirin.</li>
	<li>37% 5 CO2 ' de nemlendirilmiş hava ile bir kuluçte örneklerine kültür.</li>
	<li>PDL hücrelerinin gelişimi gözlemlendikten sonra kültür ortamını değiştirin. Genellikle PDL hücrelerinin gelişimi için 1-2 hafta sürer. PDL hücrelerinin ters faz kontrast mikroskobu ile gelişimini gözlemlemek.</li>
	<li>Kültür ortamını her hafta sonra iki kez değiştirin.</li>
	<li>PDL hücreleri konfluence ulaştığında, 1:4 oranı (geçiş 1) alt kültür hücreleri.</li>
	<li>Günlük hücre büyümesini gözlemlemek ve haftada iki kez kültür ortamı değiştirin.</li>
	<li>Hücreler% 80 konfluence ulaştıktan sonra 1:4 oranı her sonraki geçiş gerçekleştirin. Hücre tohumlama için üçüncü-beşinci nesil PDL hücrelerini kullanın.</li>
</ol>2. kitosan filmlerin hazırlanması
<ol><li>1% (v/v) asetik asit çözeltisi hazırlanması için, temiz bir cam Beaker çift distile su 495 mL asetik asit 5 mL ekleyin.</li>
	<li>1% w/v kitosan çözeltisi hazırlanması için, 5 g kitosan tozu (ortalama moleküler ağırlık 400 kDa,% 85 asetilasyon derecesi) tartım ve 495 mL 1% (v/v) asetik asit çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>60 °C ' de karıştırma çubuğu ve manyetik karıştırma plakası ile 24 saat boyunca hazırlanmış çözümü karıştırın.</li>
	<li>Kitosan tamamen çözünmesini sağlamak için hazırlanan solüsyonu autoclave. Not: deneme bu aşamada duraklatılabilir.</li>
	<li>Kitosan filmleri oluşturmak için 0,25 mL/cm2' de doku kültürü Polistiren (TCPs) yemeklerine% 1 w/v kitosan çözeltisi ekleyin. Örneğin, 0,5 mL 'ye 1% w/v kitosan solüsyonu bir iyi 24 – kuyu plakasına ekleyin.</li>
	<li>60 °C ' de fırın içinde kuru TCPS yemekleri 24 saat boyunca kitosan filmleri oluştururlar.</li>
	<li>Hazırlamak 0,5 N sodyum hidroksit (NaOH). Karıştırın 10 g NaOH, bir defada biraz, manyetik karıştırın çubuğu kullanarak çift distile su büyük bir hacim içine, ve daha sonra 0,5 L yapmak için çözüm seyreltilen. Not: su NaOH Ekle-katı NaOH su eklemeyin. NaOH dokunmayın! Kimyasal yanıklara neden olabilir.</li>
	<li>0,5 N NaOH ile kitosan filmleri nötralize eder. Ekle 0,5 mL 0,5 N NaOH çözüm için bir iyi 24-kuyu plaka 2 saat.</li>
	<li>Çift damıtılmış su ile üç kez yıkama kitosan filmler. Not: deneme bu aşamada duraklatılabilir.</li>
	<li>Hücre tohumlama öncesinde, oda sıcaklığında gecelik% 70 alkol içinde kitosan kaplı 24-kuyu plakaları sterilize.</li>
	<li>Oda sıcaklığında PBS ile üç kez kitosan kaplı plakaları durulayın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında bir gecede ultraviyole ışık altında tedavi ile kitosan kaplı plakaları sterilize.</li>
</ol>3. hücre tohumlama
<ol><li>Ön sıcak proliferasyon orta PBS çözeltisi ve Trypsin/EDTA solüsyonu 37 °C ' ye kadar.</li>
	<li>T-75 hücre kültürü Flask gelen süpernatant atın.</li>
	<li>10 mL PBS çözeltisi ile confluent PDL hücrelerini yıkayın.</li>
	<li>PBS çözümünü atın.</li>
	<li>T-75 hücre kültürü Flask için Trypsin/EDTA çözüm 1 mL ekleyin.</li>
	<li>37 °C ' de 3 dakika boyunca Trypsin/EDTA çözeltisi olan hücreleri inküat.</li>
	<li>T-75 hücre kültürü Flask proliferasyon orta 3 mL ekleyerek tripsin sindirim sürecini sonlandırmak.</li>
	<li>Hazırlanan hücre süspansiyonunu 15 mL konik Santrifüjlü tüpüne aktarın.</li>
	<li>Süspansiyon 300 x g ve oda sıcaklığında 5 dakika Santrifüjü.</li>
	<li>15 ml konik Santrifüjlü tüpten süpernatant atın ve 500 μL proliferasyon Orta hücre Pelet yeniden askıya.</li>
	<li>Bir hemokytometer ile say PDL hücreleri.</li>
	<li>0,5 x 10 4, 1 x 104, 3 x104ve 6 x 104 hücreli/cm2yoğunluklarında tohum PDL hücreleri.</li>
	<li>37 °C ' de% 5 CO2 ' de nemlendirilmiş hava ile kuluçari filmlerinde kültür PDL hücreleri.</li>
	<li>Kültür ortamını her hafta sonra iki kez değiştirin.</li>
	<li>1, 2, 3, 4 ve 5 günlerde, ters faz kontrast mikroskobu ile günlük hücre morfolojisi gözlemlemek.</li>
</ol>4. hücre hayatta kalma
<ol><li>1, 3 ve 6 günlük kültürden sonra, ticari bir viability/sitotoksisite kiti kullanarak hücrelerin hayatta kalmasının belirlenmesi.</li>
	<li>15 ml 'lik bir tüpte, 5 s için vortekslenir ile 2 mm calcein-am ve 4 mm etidium homodimer PBS taze bir çözelti 2 ml hazırlayın. Not: işlemi karanlıkta tutun.</li>
	<li>Kültür ortamını çıkarın ve PBS 'de küreler yıkayın.</li>
	<li>Karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 2 mm calcein-am ve 4 mm etidyum homodimer içeren PBS 'deki küreler içinde inküye yapın.</li>
	<li>Küreler PBS 'de iki kez durulayın. 24 kuyu plakasının bir kuyusu olan küreler için her seferinde 2 mL PBS kullanın.</li>
	<li>10X veya 20X büyütme kullanarak floresan mikroskobu kullanarak örneklere uyun.</li>
</ol>

<ol><li>Albandar, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+risk+factors+of+periodontal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Dental+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and risk factors of periodontal diseases.</a> Dental Clinics of North America. 49 (3), 517-532 (2005).</li>
<li>Bartold, P. M., McCulloch, C. A., Narayanan, A. S., Pitaru, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering%3A+a+new+paradigm+for+periodontal+regeneration+based+on+molecular+and+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontology+2000%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering: a new paradigm for periodontal regeneration based on molecular and cell biology.</a> Periodontology 2000. 24, 253-269 (2000).</li>
<li>Chen, F. M., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodontal+tissue+engineering+and+regeneration%3A+current+approaches+and+expanding+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B+Review%22%5BJournal%5D)">Periodontal tissue engineering and regeneration: current approaches and expanding opportunities.</a> Tissue Engineering Part B Review. 16 (2), 219-255 (2010).</li>
<li>Yu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+periodontal+tissue+regeneration+by+periodontal+cell+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Periodontology%22%5BJournal%5D)">Enhanced periodontal tissue regeneration by periodontal cell implantation.</a> Journal of Clinical Periodontology. 40 (7), 698-706 (2013).</li>
<li>Yan, X. Z., Yang, F., Jansen, J. A., de Vries, R. B., van den Beucken, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Based+Approaches+in+Periodontal+Regeneration%3A+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis+of+Periodontal+Defect+Models+in+Animal+Experimental+Work%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B+Review%22%5BJournal%5D)">Cell-Based Approaches in Periodontal Regeneration: A Systematic Review and Meta-Analysis of Periodontal Defect Models in Animal Experimental Work.</a> Tissue Engineering Part B Review. 21 (5), 411-426 (2015).</li>
<li>Itaya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristic+changes+of+periodontal+ligament-derived+cells+during+passage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Periodontal+Research%22%5BJournal%5D)">Characteristic changes of periodontal ligament-derived cells during passage.</a> Journal of Periodontal Research. 44 (4), 425-433 (2009).</li>
<li>Zhang, J., Li, B., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+engineered+tendon+matrix+in+the+stemness+of+tendon+stem+cells+in+vitro+and+the+promotion+of+tendon-like+tissue+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The role of engineered tendon matrix in the stemness of tendon stem cells in vitro and the promotion of tendon-like tissue formation in vivo.</a> Biomaterials. 32 (29), 6972-6981 (2011).</li>
<li>Elliott, N. T., Yuan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+three-dimensional+in+vitro+tissue+models+for+drug+discovery+and+transport+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2011).</li>
<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li>
<li>Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+spheroid+formation+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+chitosan+films+on+stemness+and+differentiation+capabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities.</a> Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).</li>
<li>Yeh, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+repair+with+injectable+cell+sheet+fragments+of+human+amniotic+fluid+stem+cells+in+an+immune-suppressed+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model.</a> Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).</li>
<li>Kabiri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+mesenchymal+stem%2Fstromal+cell+osteogenesis+and+autocrine+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">3D mesenchymal stem/stromal cell osteogenesis and autocrine signalling.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 419 (2), 142-147 (2012).</li>
<li>Lee, J. H., Han, Y. S., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Duration+Three-Dimensional+Spheroid+Culture+Promotes+Angiogenic%5BTitle%5D)+AND+%22Activities+of+Adipose-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells.+Biomolecules+%26+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Long-Duration Three-Dimensional Spheroid Culture Promotes Angiogenic.</a> Activities of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & therapeutics. 24 (3), 260-267 (2016).</li>
<li>Yan, X. Z., van den Beucken, J., Yuan, C., Jansen, J. A., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+formation+and+stemness+preservation+of+human+periodontal+ligament+cells+on+chitosan+films%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">Spheroid formation and stemness preservation of human periodontal ligament cells on chitosan films.</a> Oral Diseases. 24 (6), 1083-1092 (2018).</li>
<li>Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+a+three-dimensional%2C+microarray+environment+on+human+Cell+culture+in+drug+screening+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems.</a> Biomaterials. , (2012).</li>
<li>LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+proliferation+in+multicellular+spheroids+is+mediated+through+differential+expression+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors.</a> Cancer Research. 64 (5), 1621-1631 (2004).</li>
<li>Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compaction%2C+fusion%2C+and+functional+activation+of+three-dimensional+human+mesenchymal+stem+cell+aggregate%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate.</a> Tissue Engineering Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).</li>
<li>Cesarz, Z., Tamama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+Culture+of+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, 9176357(2016).</li>
<li>Tong, J. Z., Sarrazin, S., Cassio, D., Gauthier, F., Alvarez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+spheroid+culture+to+human+hepatocytes+and+maintenance+of+their+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Application of spheroid culture to human hepatocytes and maintenance of their differentiation.</a> Biology of the Cell. 81 (1), 77-81 (1994).</li>
<li>Lee, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+injectable+spherically+symmetric+cell+aggregates+self-assembled+in+a+thermo-responsive+hydrogel+for+enhanced+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of injectable spherically symmetric cell aggregates self-assembled in a thermo-responsive hydrogel for enhanced cell transplantation.</a> Biomaterials. 30 (29), 5505-5513 (2009).</li>
<li>Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+three-dimensional+culture+methods+enhance+mesenchymal+stem+cell+properties+and+increase+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+spheroid+culture+system+on+micropatterned+substrates+for+improved+differentiation+efficiency+of+multipotent+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells.</a> Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).</li>
<li>Miyagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfabricated+scaffold+induces+the+spheroid+formation+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+progenitor+cells+and+promotes+efficient+adipogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">A microfabricated scaffold induces the spheroid formation of human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells and promotes efficient adipogenic differentiation.</a> Tissue Engineering Part A. 17 (3-4), 513-521 (2011).</li>
<li>Bartosh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+human+mesenchymal+stromal+cells+%28MSCs%29+into+3D+spheroids+enhances+their+antiinflammatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).</li>
<li>Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+culture+of+mesenchymal+stem+cell+spheroids+in+suspension+preserves+multilineage+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential.</a> Cell and Tissue Research. 347 (3), 701-711 (2012).</li>
<li>Rabea, E. I., Badawy, M. E., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan+as+antimicrobial+agent%3A+applications+and+mode+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action.</a> Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Bu çalışmada, geleneksel 2D Tek tabakalı hücre kültürü ile ilgili bazı sınırlamalar aşmak için bir 3D hücre kültür sistemi tanıttı. Protokole göre PDL hücresel kürüler, kitosan filmlerinde kültür hücreleri tarafından başarıyla oluşturuldu. Önceki çalışmamızda, küresel oluşumunun PDL hücrelerinin Self-yenilenme ve osteogenik farklılaşma kapasitelerinin artması bildirildi14. TCPs gelen hücreler hasat için bir enzim kullanmak yerine, PDL hücre küreler sadece orta birkaç kez14p...

Periodontitis, esas olarak dental plak1ile başlatılan, periodontal bağ (PDL), alveoler kemik ve Periodontitis için mevcut tedaviler genellikle aktif hastalığın ilerlemesini önlemede başarılı olmaktadır, ancak kayıp periodontal dokularda rejenerasyon klinik bir zorluk olarak kalır. Son zamanlarda, periodontal doku rejenerasyonu için hücre tabanlı yaklaşımlar mevcut tedaviler2,3,4dezavantajları aşmak için önemli ilerleme yapılmıştır.
Önceki sistematik incelememiz, PDL hücrelerinin periodontal rejenerasyon için büyük bir potansiyel gösterdiğini göstermiştir5. Geleneksel olarak, PDL hücreleri doku kültürü Polistiren (TCPS) gibi iki boyutlu (2D) substratlar üzerinde kültürlü. Ancak, In vitro Culture6sırasında PDL hücrelerinin karakteristik değişiklikleri gözlenmiştir. Bu fenomen muhtemelen 2D TCPs in vivo üç boyutlu (3D) mikro7farklıdır çünkü. 2B substratlar üzerinde kültürlü hücrelere kıyasla, bir 3D mikroortamda yetiştirilen hücreler in vivo hücrelere daha fazla benzerlik sergiler8. Bu nedenle, 3D hücre kültürü modelleri geleneksel 2D Tek tabakalı hücre kültürü için umut verici bir alternatif sağlar.
Konvansiyonel 3D kültür yöntemi hücreleri 3D Biyomalzemeler kapsüller. 3D biyomalzemelerde kapsüllenmiş hücreler ile karşılaştırıldığında, hücresel küreler daha yakından In vivo durumu taklit, çünkü kürüler yabancı maddelerin ücretsiz büyüyen hücrelerin toplamları vardır9,10,11, 12. hücresel KÜRLERIN msc biyofaaliyetlerini fibronektin ve laminin13dahil olmak üzere, ekstrasellüler matriks (ECM) bileşenlerinin korunması yoluyla tanıtılmasıdır. Geleneksel PDL hücre kültürü modellerini geliştirmek için, son zamanlarda kitosan filmler14PDL hücrelerinin küroid oluşumuna dayalı BIR 3D PDL hücre kültürü yöntemi geliştirdik. Küroid oluşumu PDL hücrelerinin Self-yenilenme ve osteogenik farklılaşma kapasitelerini artırmıştır14. Burada, kitosan filmlerine dayanan ayrıntılı PDL hücre kürü kültür protokolleri sunuyoruz. PDL hücresel kürenin 3D kültür sistemi, geleneksel TCPS hücre kültürüyle ilgili eksikliklerin bazılarını aşmak ve böylece gelecekteki periodontal doku rejenerasyonu için gelişmiş bir terapötik etkinliğine sahip PDL hücrelerini üretmek için uygun olabilir.

<table><tbody><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Gibco</td><td>11900-073</td><td></td></tr><tr><td>asetik asit&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>64197</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü şişesi 25 cm2</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü şişesi 75 cm2</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Kitosan</td><td>Heppe Medikal&nbsp; Chitosan GmbH</td> <td>/</td> <td>molekül ağırlığı 500 kDa, deasetilasyon derecesi% 85</td></tr> <tr><td>FCS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Canlı / Ölü Canlılık / Sitotoksisite Kiti</td><td>Moleküler ve nbsp; Problar</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1310732</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>KeyGen Biotech&nbsp;</td><td></td><td></td>KGB5001</tr><tr><td>kalem/strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin/EDTA&nbsp;</td><td>KeyGen Biyoteknoloji&nbsp;</td><td></td><td></td>KGM25200</tr><tr><td>15 mL konik santrifüj tüpü</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>24 kuyulu plaka</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr></tbody></table>

kitosan filmlerde ınsan periodontal ligament hücre kürleri oluşumu

Formation of Human Periodontal Ligament Cell Spheroids on Chitosan Films

Periodontal bağ (PDL) hücreleri periodontal doku rejenerasyonu için büyük söz tutun. Geleneksel olarak, PDL hücreleri doku kültürü Polistiren (TCPS) gibi iki boyutlu (2D) substratlar üzerinde kültürlü. Ancak, In vitro kültürü sırasında PDL hücrelerinin karakteristik değişiklikleri gözlenmiştir. Bu fenomen muhtemelen 2D TCPS in vivo üç boyutlu (3D) mikroortamdan farklıdır çünkü. 2B substratlar üzerinde kültürlü hücrelere kıyasla, bir 3D mikroortamda yetiştirilen hücreler in vivo hücrelere daha fazla benzerlik sergiler. Bu nedenle, 3D hücre kültürü modelleri geleneksel 2D Tek tabakalı hücre kültürü için umut verici bir alternatif sağlar. Geleneksel PDL hücre kültürü modellerini geliştirmek için, son zamanlarda kitosan filmleri üzerinde PDL hücrelerinin küroid oluşumuna dayanan bir 3D hücre kültürü yöntemi geliştirdik. Burada, kitosan filmlerine dayanan detaylı hücre kürü kültürü protokolleri sunuyoruz. PDL hücresel kürenin 3D kültür sistemi, geleneksel 2D Tek tabakalı hücre kültürüyle ilgili bazı sınırlamaların üstesinden gelmekte ve böylece gelecekteki periodontal doku rejenerasyonu için gelişmiş bir terapötik etkinliğine sahip PDL hücrelerini üretmek için uygun olabilir.

Mevcut protokol kullanılarak, uygulanabilir PDL hücre kürleri başarıyla oluşturuldu. Şekil 1 , bağlı hücreler yerine askıya alınan hücrelerin veya kürlerin çoğunlukla kitosan filmlerinde gözlemlendiği görülmüştür. 0,5 x 104 hücreli/cm2' nin tohumlama yoğunluğu için, ekli PDL hücreleri bazen 1 ve 3 gün bulundu ve PDL hücre kürleri nadiren gözlenen. Aksine, 3 x 104 ve 6 x 104 hücreli/cm2' nin tohumlama yoğu...

Burada, insan periodontal bağ (PDL) hücre kürleri tarafından kitosan filmleri ile ilgili protokoller sunuyoruz. Üç boyutlu (3D) hücresel küreler kültürü geleneksel doku kültürü Polistiren (TCPS) kültür sistemine bir alternatif sağlar.

Kitosan filmlerde ınsan periodontal ligament hücre kürleri oluşumu

Periodontal ligament (PDL) cells hold great promise for periodontal tissue regeneration. Conventionally, PDL cells are cultured on two-dimensional (2D) ...

Bu, chitosan filmlerinin periodontal ligament hücre sferoidlerinin kültürlenmesinin ayrıntılı bir protokolüdür. Konvansiyonel kültür sistemi ile karşılaştırıldığında, küresel kültür sistemi artmış kendini yenileme ve osteojenik farklılaşma yetenekleri ile periodontal ligament hücreleri üretir. Başlamak için, el yazmasında belirtildiği gibi %1 ağırlık-to-volume chitosan çözeltisi hazırlayın.24 kuyulu doku kültürü polistiren plakanın her kuyuya 0,5 mililitre chitosan çözeltisi ekleyin. Chitosan filmleri oluşturmak için plakayı 60 derecede 24 saat boyunca fırında kurutun. Chitosan filmlerini nötralize etmek için, 24 kuyulu plakanın her kuyusuna 0,5 mililitre normal sodyum hidroksit ekleyin ve iki saat boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.Daha sonra chitosan filmlerini üç kez çift distile suyla yıkayın. Chitosan kaplı 24 kuyulu tabağı oda sıcaklığında bir gecede %70 alkolle sterilize edin. Plakayı PBS ile üç kez durulayın ve bir gecede ultraviyole ışık altında bırakın.Hücre tohumlama önce, pre-Sıcak proliferasyon orta, PBS çözeltisi, ve 37 santigrat derece trypsin EDTA çözeltisi. Hücre kültürü şişesinden supernatant atın ve pbs 10 mililitre ile, confluent periodontal ligament veya PDL hücreleri yıkayın. PBS atın ve şişeye bir mililitre tripsin EDTA çözeltisi ekleyin.Şişeyi 37 santigrat derecede üç dakika kuluçkaya yatırın ve tripsin sindirimini sonlandırmak için üç mililitre proliferasyon ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonuna 15 mililitrelik konik bir tüp aktarın ve sonra 300 kez g beş dakika santrifüj edin. Supernatant atın ve çoğalma orta 500 mikrolitre hücreleri yeniden askıya.Bir hemositometre ile hücreleri saymak ve santimetre kare başına beş, 10, 30 ve 60 bin hücre plaka üzerine tohum. Kültür pdl hücreleri bir kuvöz de 37 santigrat santigrat 5% karbondioksit ve nemlendirilmiş hava, haftada iki kez kültür ortamı değişen. Ters faz kontrast mikroskobu ile beş gün boyunca günlük hücre morfolojisini gözlemleyin.Canlı PDL hücre spheroidleri bu protokol kullanılarak başarıyla oluşturulur. Spheroidler nadiren birinci ve üçüncü günlerde alt tohumlama yoğunluğu için gözlenir. Ama iki yüksek yoğunlukta, ilk günden itibaren çeşitli boyutlarda küresel ler bulunur.Homojen küresel balıklarla sonuçlandığı için en uygun tohumlama yoğunluğu santimetre karebaşına 30 bin hücredir. Kültür beş gün sonra, büyük küresel ler tüm tohumlama yoğunlukları için gözlenmektedir. Canlılık telbette, PDL hücrelerinin çoğunun birinci, üçüncü ve altıncı günlerde canlı olduğunu gösterir, ancak ölü hücre sayısı altıncı günde artar.Bu protokolün bir sınırlama küresel oluşumu ndan sonra hücrelerin çoğalması azalmış olmasıdır. Bu nedenle, küresel oluşumdan sonra hücrelerin çoğalmasını teşvik etmek için daha ileri çalışmalar yapılması gerekmektedir.

formation-human-periodontal-ligament-cell-spheroids-on-chitosan

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bir roman imalat, FDA onaylı malzemelerle esnek ince film cerrahi yapıştırıcı, chitosan ve indosiyanin yeşili açıklanmıştır. Bir düşük enerjili bir kızıl ötesi lazer ile basit bir aktivasyon işlemi yoluyla kollajen doku için bu yapışkan yapıştırılması gösterilmiştir.

Bir Kitosan Bazlı, Lazer Aktif İnce Film Cerrahi Yapıştırıcı, &#39;SurgiLux&#39;: Hazırlık ve Gösteri

Mevcut kök hücre tedavilerinde büyük bir engel konak dokularına bu hücrelerin sunmak için en etkili yöntem belirlemektir. Adipoz kaynaklı kök hücreler kendi multipotency korumasını sağlarken Burada, verimli ve yaklaşım, basit bir kitosan tabanlı dağıtım yöntemi açıklar.

Kök Hücre yüklü Chitosan Mikrokürelerin teslimi için bir Kollajen Hidrojel oluşturma

Üç boyutlu yapıların insan egzersize şartlandırılmış serum ile muamele edildiği ve kollajen içeriği, fonksiyonu ve hücre biyokimyası için analiz edildiği bir ligament doku modeli sunuyoruz.

Egzersiz Koşullandırılmış Serum İle Ligament Yapılarının Tedavisi: Bir Translasyonel Doku Mühendisliği Modeli

Burada facile hazırlanması enjekte edilebilir hydrogels kitosan tabanlı dinamik imin kimya kullanarak açıklar. Hidrojel'ın mekanik mukavemeti ve 3D hücre kültürü kendi uygulamasında ayarlamak için yöntemleri sunulmaktadır.

Kitosan-esaslı enjekte edilebilir Hydrogels ve kendi uygulamasında 3D hücre kültürü hazırlanması

Burada, kendi kendine dediferansiye insan artiküler kondrosit farklılaşma kıkırdak benzeri doku içine tanıtmak için peptid iskele montaj içinde 3D-kültür sistemleri elde etmek için bir iletişim kuralı mevcut.

Üç boyutlu peptid iskele memeli hücrelerinde kültür

Biz bir bioprintable aljinat/jelatin bioink gömülü ölümsüzleştirdi tümör ve fibroblast hücreleri içeren türdeş olmayan meme kanseri modeli geliştirilmiştir. Model vivo içinde tümör microenvironment recapitulates ve çok hücreli tümör pulcuklarının, kavrama tumorigenesis sürüş mekanizmaları içine verimli oluşumunu kolaylaştırır.

Bioprintable aljinat/jelatin hidrojel 3D Vitro Model sistemleri hücre küresel oluşumu teşvik

Bu protokol, mikrogravitedeki ameloblast benzeri hücrelerin kültürü ve 3D büyümesi için, uzun ve polarize şekillerini ve emayeye özgü protein ekspresyonunu korumak için bir yöntem sunar. Periodontal mühendislik yapıları kültürü ve mikro yerçekiminde akciğer organları için kültür koşulları da tanımlanmıştır.

Mikro Yerçekiminde Diş ve Solunum Hücre ve Organlarının Yayılımı

Mevcut protokol, kitosan-genipin mikrojellerinin üretimi için emülsiyon bazlı olmayan bir yöntemi tanımlamaktadır. Bu mikrojellerin boyutu hassas bir şekilde kontrol edilebilir ve pH'a bağlı şişlik gösterebilir, in vivo olarak bozulabilir ve zamanla sürekli bir şekilde salınan terapötik moleküllerle yüklenebilir, bu da onları doku mühendisliği uygulamaları için oldukça alakalı hale getirir.

Doku Mühendisliği Uygulamaları için Boyut Kontrollü ve Emülsiyonsuz Kitosan-Genipin Mikrojellerinin İmalatı

Bu çalışmada, periodontitis indüksiyonunun sıçan modeli, ilk maksiller azı dişlerinin etrafında 14 gün boyunca, Porphyromonas gingivalis'ten türetilen tekrarlayan lipopolisakkarit enjeksiyonları ve geciktirici ligatür kombinasyonu ile sunulmuştur. Ligasyon ve LPS enjeksiyon teknikleri peridonti indüklemede etkiliydi, bu da alveoler kemik kaybı ve inflamasyona neden oldu.

Bir sıçan modelinde ligatür ve lipopolisakkarit enjeksiyonunun bir kombinasyonu ile periodontitisin indüksiyonu

Bu çalışma, hücreleri yerçekimi kullanarak düşük yapışma koşulları altında sferoidler halinde toplayarak ve ardından elde edilen sferoidleri mini biyoreaktörlerde kültürleyerek kondrositik sferoidlerin üretilmesi için bir yöntemi açıklamaktadır.

Yerçekimi ve Ev Yapımı Mini Biyoreaktörler Altında Düşük Yapışkan Koşullar Kullanılarak Çeşitli Kondrositlerden Sferoidlerin Üretilmesi

Bu çalışma, farelerde periodontitisi indüklemek için modifiye edilmiş bir 6-0 naylon ligasyon yöntemini tanımlamaktadır, bu yöntem yüksek oranda tekrarlanabilir ve araştırmacıların periodontal hastalığı gelişiminden patolojik sonuçlarına kadar incelemeleri için bir alternatif teşkil etmektedir.

İkinci Üst Azı Dişinde Naylon Ligatür ile İndüklenen İleri Periodontitisin Murin Modeli

Öğrenin, kitosan filmler kullanarak insan periodontal ligament hücre kürelerinin üç boyutlu kültürünü. Bu yöntem, hücrelerin kendini yenileme ve osteojenik farklılaşma yeteneklerini geleneksel yöntemlere göre artırır.

Kitosan filmlerde ınsan periodontal ligament hücre kürleri oluşumu

Daha fazla video keşfet