Name: Erişkin Serebellar Dilimlerde Uzun Süreli Depresyon İndüksiyonunun Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Öğrenin, gen manipülasyonu yapılmış hayvan modellerinde Purkinje hücrelerinde uzun süreli depresyon indüksiyonunu değerlendirmek için çoklu elektrofizyolojik protokolleri. Bu yöntem, sinaptik plastisite ve motor öğrenme mekanizmalarını incelemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A. Oba'ya teknik yardımları için teşekkür ederiz. Bu araştırma kısmen Bilimsel Araştırma Hibe-in-Aid (C) 17K01982 k.y tarafından desteklenmiştir.

Tüm deneysel prosedürler, deneylerde hayvanların bakımı ve kullanımı konusunda RIKEN komitesi tarafından onaylanmıştır. Fareler, RIKEN Beyin Bilimi Merkezi'nin hayvan tesisinde iyi kontrollü sıcaklık (23-25 °C) ve nem (%45-%65) altında tutuldu. Koşul -ları. Hem erkek hem de dişi WT fareler (C57BL/6, 3-6 ay) kullanıldı.
1. Deneylerde Kullanılan Çözümlerin Hazırlanması
NOT: Tüm çözümler metaliçermeyen ultra saf suda (direnç > 18,2 MΩ) ve diğer kirlerde (toplam organik karbon (TOC) < 5,0 ppb) yapılmalıdır. Dilim kesme ve kayıt için yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) çalışma ACSF 10 kez (x10) stok deney gününde taze yapılır. Kullanmadan önce %5 CO2/ %95 O2 gaz karışımı ile çözeltileri kabar. ACSF'nin pH'ı 7.4 ± 0.1'e, ozmolarite ise 315 ± 5 mOsm/kg'a ultra saf su eklenerek ayarlanır.
<ol><li>1250 mM NaCl, 30 mM KCl, 12,5 mM NaH2PO4ve 260 mM NaHCO3içeren 10 x ACSF stoku hazırlayın. Bu çözelti 4 °C'de saklanabilir.</li>
	<li>
125 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM CaCl2,1 mM Mg2SO4, 1,25 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3 ve 20 mM glikoz içeren acsf çalışmaya hazırlayın.
	<ol>
<li>İlk olarak, yağış önlemek için yaklaşık 800 mL ultrasaf suya 1 mL 1 ML 1 M Mg2SO4 çözeltisi ile 1 mL ekleyin. Sonra 100 mL 10x ACSF ve glikoz ekleyin. Son olarak, ultra saf su ekleyerek toplam 1.000 mL hacim yaratın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beyin işleme için% 3.3 agar hazırlayın. 30 mL'lik 1 g agarı %0,9 NaCl çözeltisinde çözünve kaynayana kadar mikrodalgafırında ısıtın. Karıştırmak için karıştırın, sonra steril bir 4 cm x 10 cm plastik kutu içine dökün ve katılaşmak için izin. Agar plakasını(yaklaşık8 mm kalınlığında) buzdolabında saklayın.</li>
	<li>
Dahili çözümü hazırlayın.
	<ol>
<li>60 mM KCl, 60 mM K-glukonat, 0,3 mM EGTA, 4 mM MgCl2,4 mM ATP, 0,4 mM GTP ve 30 mM HEPES içeren K+bazlı dahili solüsyonu hazırlayın (pH 7.2). NOT: Düşük konsantrasyon (0.3 mM) EGTA, yavaş bir Ca2 +-şelatör, saf suda muhtemelen kontamine Ca2 + şelat eklenir, ancak iç çözeltide EGTA bu düşük konsantrasyonu asla LTD indüksiyon engeller ( Şekil3, Şekil 4, Şekil 5) tüm hücre kaydı sırasında. Ölçülen ozmotik basınç 285 mOsm/kg'dır.</li>
		<li>60 mM CsCl, 46 mM D-glukonat, 27 mM tetraethylamonnium klorür (TEA-Cl), 0,3 mM EGTA, 4 mM MgCl2,4 mM ATP, 0,4 mM GTP ve 30 mM HEPES (pH 7.2, CsOH kullanılarak ayarlanmış) içeren Cs+bazlı dahili solüsyonu hazırlayın. NOT: Cs+ voltaj bağımlı K-kanallarını engeller ve uzunluk sabitini artırarak uzak dendritlerde yer kıskaç koşullarını iyileştirir. Ölçülen ozmotik basınç 285 mOsm/kg'dır.</li>
		<li>Çözeltilerin 200 μL aliquot'larını hazırlayın ve -30 °C'de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Beyin Diseksiyonu ve Kırpma
<ol><li>Sıcaklık 4 °C'den az olana kadar buzüzerinde iki 50 mL ACSF gagasını soğutun ve oksijenverin. ACSF'nin buz gibi gagalarından birine 50 μL tetrodotoksin (TTX, 1 mM) ekleyin ve dilim kesme için saklayın. FARE serebellar dilim LTD indükleme yeteneği ayırarak elde etmek için, normal ACSF TTX eklenmesi gereklidir.</li>
	<li>Dilimleme odasının buz banyosu alanını buzla doldurarak metal numune tepsisini soğutun.</li>
	<li>Anestezi kavanozuna 1 mL isofluran(~1000 mL) dökün ve 30-45 s. Farenin mekanik uyarıma yanıt verememesini onaylayarak derinden anestezi olduğundan emin olun.</li>
	<li>Cerrahi makas kullanarak farenin kafasını koparın. Baş tutun ve bir oftalmolojik makas kullanarak orta hat boyunca yüzeysel deri kesti. Kafatasının yüzeyini yaygın olarak ortaya çıkarmak için parmaklarınızla tutarak deriyi çekin.</li>
	<li>Bir oftalmolojik makas kullanarak kulak ve göz hemen üzerinde büyük spinocerebellar delikten bir çizgi boyunca yatay kafatası kesin. Kafatasını iki gözün üstündeki bir çizgi boyunca kesin ve kafatasını izole etmek için çıkarın.</li>
	<li>Bir neşter kullanarak beyin ortasında beyin kesin, sonra kafatasından beyincik de dahil olmak üzere beynin kaudal kısmını izole. ACSF buz gibi bir kabın içine batırın. Genellikle, beyin bloğunun beyin bloğunun acsf öncesi soğutulmuş kabına daldırma için decapitation toplam süre az 60 s olmalıdır.</li>
	<li>Buklayan borunun konumu, kabın içinde beyin bloğunu karıştırmamak için ayarlanmalıdır. Mekanik hasar kayıt sırasında dilimin şişmesine neden olabilir. En az 7 dakika bekletin ve beynin soğumasını bekleyin.</li>
	<li>Beyin bloğunu kesmek için, büyük bir agar plakasından (4 cm x 10 cm) dikdörtgen bir agar parçası (2 cm x 2 cm) kesin ve fazla sıvıyı emmek için bir filtre kağıdına koyun.</li>
	<li>Agar parçasını filtre kağıdına ters çevirin, ardından agar parçasını önceden soğutulmuş metal numune tepsisi (16 cm x 20 cm) üzerine bir filtre kağıdına yerleştirin. Bir spatula kullanarak beyin bloğu pick up ve filtre kağıdı bir parça ile etrafında aşırı sıvı absorbe.</li>
	<li>Tutkal (tıbbi siyanoakrilat anlık yapıştırıcı) kullanarak agar blok üzerine beyin bloğu monte. Agar için beyin bloğunun alt (ventral tarafı) eklemek için emin olun.</li>
	<li>Sağ yarımküreyi bıçakla kesin. Kesme düzleminin tarafının PC'nin dendritik düzlemine mümkün olduğunca paralel olduğundan emin olun, çünkü bu taraf numune tepsisinin yüzeyine bağlı. Kesme ve yarımkürenin diğer tarafında kaldırın. Sonra, üst ve alt koliküli arasındaki beyni kesip, ve omuriliği kes.</li>
	<li>Önceden soğutulmuş numune tepsisine agar bloğu ile kesilmiş beyincik sağ tarafında tutkal. Spatulanın düz kısmıyla serebellumun etrafına aşırı tutkal yayın ve aşırı tutkalın serebellar yüzeye bağlanmasını önleyin. Metal tepsiyi yatırın ve tutkaldüzeltmek ve fazla tutkal yıkayın için ACSF dökün.</li>
</ol>3. Beyin Dilimleme
<ol><li>Serebellumun dorsal tarafı ön tarafta olacak şekilde örneği yönlendirin. 1 μM TTX içeren buz gibi kesme ACSF dökün, beyincik tamamen batırmak için yeterli. ACSF içine bir gaz tüpü yerleştirin ve O2/ CO2 gaz karışımı ile köpürme başlar.</li>
	<li>Dürbün altında ince bir cızırtı kullanarak araknoid mater çıkarın. Serebellar peduncle bir bıçakla kesin ve beyin sapı ve agar blok kaldırın. Tepsiyi 180°döndürün, böylece beyincik sırt yüzeyi bir jiletle karşı karşıya.</li>
	<li>Bıçağı ayarlayın ve ilk kesme yerini ayarlayın. Vibratom dilimleme parametrelerini aşağıdakilere ayarlayın: genlik 5,5'e, frekans85 Hz'e, hız 3-4'e ve dilim kalınlığı nı 300 μm'ye ayarlayın.</li>
	<li>Naylon ağdaki serebellar dilimi bir akrilik kuvöze aktarın ve dilimi oksijenli ACSF'ye tamamen batırın. Kuluçka makinesi 26 °C sıcaklık taslayan bir su banyosuna yerleştirilmelidir.</li>
	<li>Dilimleme sırasında oluşan hasarın geri kazanımı için dilimleri en az 1 saat saklayın.</li>
</ol>4. Tüm hücreli Patch-clamp Kayıt
NOT: Bir yama-kelepçe kaydı aşağıdaki ekipman gerektirir: kızılötesi diferansiyel girişim kontrastı (IR-DIC) optik, yama-kelepçe amplifikatör, veri sayısallaştırıcı, dijital uyarıcı, izolatör, bilgisayar, veri toplama için yazılım ile dik bir mikroskop ve analiz, motorlu manipülatör, mikroskop platformu, titreşim izolasyon tablosu, Faraday kafes, solüsyon ısıtma sistemi, peristaltik pompalar ve elektrot çekmece.
<ol><li>ACSF'ye pikrotoksin (0,1 mM) ekleyin ve 3 dakika boyunca ultra-sonication kullanarak çözün.</li>
	<li>2 mL/dk. Kayıt odasının sıcaklığınıyaklaşık30 °C'de koruyun.</li>
	<li>4 adımlı bir çekmece kullanarak filament (dış çap = 1,5 mm) ile borosilikat cam kılcal çekerek bir kayıt elektrot olun. Uç çapı 1 μm civarında olmalıdır.</li>
	<li>2 adım ile çekmece kullanarak aynı kılcal çekerek uyarıcı bir elektrot yapmak, sonra dürbün mikroskobu altında bir demir blok karşı ucu vurarak ince bir ipucu üretmek için kırmak. Son çapı 3-5 μm olmalıdır.</li>
	<li>Serebellar dilimi kayıt odasına aktarın ve naylon ipliklerle pt-ağırlık ile düzeltin. Acsf ile uyarıcı bir elektrot doldurun.</li>
	<li>PF'lerin uyarılması için, uyarıcı elektrotun purkinje hücre tabakasından yaklaşık 50 m uzakta, moleküler tabakanın yüzeyine yerleştirin.</li>
	<li>CF'nin uyarılması için, uyarıcı elektrotpurkinje hücre tabakasının altına yerleştirin (adım 5.3, 5.4).</li>
	<li>Filtre K+tabanlı veya Cs+tabanlı dahili çözelti 0,45 μm filtre ile. Bir kayıt elektrotunu 8 μL dahili çözeltiile doldurmak için bir mikro yükleyici kullanın.</li>
	<li>ACSF'ye sokmadan önce kayıt elektrobuna zayıf bir pozitif basınç uygulayın. Direnci 2-4 MΩ olmalı ve sıvı bağlantı potansiyeli düzeltilmelidir.</li>
	<li>Kayıt elektrotu ile bilgisayarın sağlıklı, parlak hücre gövdesine yaklaşın. Purkinje hücresinin yüzeyini hafifçe itin, pozitif basınç uygulamayı bırakın, bir sonraki giga-ohm mührü oluşturana kadar negatif basınç uygulayın. Sonra negatif basınç kullanarak tüm hücre yapılandırmasını kurun.</li>
	<li>Membran potansiyelini -70 mV'da tutun ve giriş direncini, seri direncini ve giriş kapasitansını sürekli olarak izlemek için 0,1 Hz'de -2 mV darbe (süre, 100 ms) uygulayın. Seri direnç telafisini kullanmayın. Seri direnci %15'ten fazla değiştiğinde verileri atın.</li>
</ol>5. LTD'nin indüksiyonu
<ol><li>Bir darbe (süre, 0.1 ms) ile moleküler tabaka uyarın. 50 ms'lik çift darbe liansi (interspike interval (ISI) uygulayarak PF-uyarıcı postsinaptik akımları (EPSC) tanımlayın. PF-EPSC, stimülasyon yoğunluğunu artırmak için eşleştirilmiş nabız kolaylaştırılması ve genlikte kademeli bir artış göstermelidir.</li>
	<li>0.1 Hz.'de tek bir darbe uygulayarak PF-EPSC'nin test yanıtını kaydedin. Voltaj bağımlı iyonik kanal üzerinden akım kirlenmesini önleyin.</li>
	<li>Purkinje hücre tabakasının altındaki CF'yi uyarın ve CF aktivasyonu nun ortaya çıkan EPSC'yi tanımlayın (çift darbe liyakat uygulayarak). CF-EPSC eşleştirilmiş nabız depresyon ve stimülasyon yoğunluğundaki artışa göre bir all-or-none şekilde göstermelidir. LTD indüksiyonu için tek bir uyarıcı kullanılmalıdır.</li>
	<li>
LTD-indükleme protokolü 1
	<ol>
<li>Akım kelepçesi koşullarında K+bazlı dahili solüsyon içeren bir elektrot kullanarak, tek bir PF-uyarıcı ve tek bir CF-uyarıcıaynı anda 1 Hz 5 dakika (300 darbe)(Şekil 1A)uygulayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
LTD-indükleme protokolü 2
	<ol>
<li>Akım kelepçesi koşullarında elektrot içeren K+bazlı dahili solüsyon kullanarak, ikinci PF-uyarıcı 1 Hz 5 dakika(Şekil 1B)ile tesadüfi olduğu için çift PF uyaran (50 ms ISI) ve tek CF-uyarıcı uygulayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
LTD-indükleme protokolü 3
	<ol>
<li>Voltaj-kelepçe koşullarında Cs+bazlı iç solüsyon içeren bir elektrot kullanarak, 1 Hz'de 3 dk soma'ya çift PF-stimul (50 ms ISI) ve tek bir depolarize voltaj adımı (-70-0 mV, 50 ms) uygulayın, böylece ikinci PF-uyarıcı depolarizasyon gerilim adımının başlangıcına eşdeğerdir (Şekil 1C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
LTD-indükleme protokolü-4
	<ol>
<li>Voltaj-kelepçe koşullarında Cs+bazlı iç solüsyon içeren bir elektrot kullanarak, PF-uyaranlarını (100 Hz'de 5x) ve tek bir depolarize voltaj adımını (-70-0 mV, 50 ms) soma 0,5 Hz'de 3 dk boyunca uygulayın (Şekil 1D ).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Eccles, J. C., Ito, M., Szentagothai, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEccles%2C+JC+%22The+Cerebellum+as+a+Neuronal+Machine%22">The Cerebellum as a Neuronal Machine</a>. , Springer. New York. (1967).</li>
<li>Marr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+theory+of+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">A theory of cerebellar cortex.</a> Journal of Physiology. 202 (2), 437-470 (1969).</li>
<li>Albus, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+cerebellar+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mathematical+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Theory of cerebellar function.</a> Mathematical Biosciences. 10 (1), 25-61 (1971).</li>
<li>Maekawa, K., Simpson, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Climbing+fiber+responses+evoked+in+vestibulocerebellum+of+rabbit+from+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Climbing fiber responses evoked in vestibulocerebellum of rabbit from visual system.</a> Journal of Neurophysiology. 36 (4), 649-666 (1973).</li>
<li>Ito, M., Shiida, T., Yagi, N., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+influence+on+rabbit+horizontal+vestibulo-ocular+reflex+presumably+effected+via+the+cerebellar+flocculus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Visual influence on rabbit horizontal vestibulo-ocular reflex presumably effected via the cerebellar flocculus.</a> Brain Research. 65 (1), 170-174 (1974).</li>
<li>Ghelarducci, B., Ito, M., Yagi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impulse+discharge+from+flocculus+Purkinje+cells+of+alert+rabbits+during+visual+stimulation+combined+with+horizontal+head+rotation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Impulse discharge from flocculus Purkinje cells of alert rabbits during visual stimulation combined with horizontal head rotation.</a> Brain Research. 87 (1), 66-72 (1975).</li>
<li>Robinson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+gain+control+of+vestibulo-ocular+reflex+by+the+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Adaptive gain control of vestibulo-ocular reflex by the cerebellum.</a> Journal of Neurophysiology. 39 (5), 954-969 (1976).</li>
<li>Gilbert, P. F. C., Thach, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje+cell+activity+during+motor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Purkinje cell activity during motor learning.</a> Brain Research. 128 (2), 309-328 (1977).</li>
<li>Ito, M., Sakurai, M., Tongroach, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Climbing+fibre+induced+depression+of+both+mossy+fibre+responsiveness+and+glutamate+sensitivity+of+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Climbing fibre induced depression of both mossy fibre responsiveness and glutamate sensitivity of cerebellar Purkinje cells.</a> Journal of Physiology. 324, 113-134 (1982).</li>
<li>Ito, M., Kano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+depression+of+parallel+fiber-Purkinje+cell+transmission+induced+by+conjunctive+stimulation+of+parallel+fibers+and+climbing+fibers+in+the+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Long-lasting depression of parallel fiber-Purkinje cell transmission induced by conjunctive stimulation of parallel fibers and climbing fibers in the cerebellar cortex.</a> Neuroscience Letters. 33 (3), 253-258 (1982).</li>
<li>Ekerot, C. F., Kano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+depression+of+parallel+fibre+synapses+following+stimulation+of+climbing+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Long-term depression of parallel fibre synapses following stimulation of climbing fibres.</a> Brain Research. 342 (2), 357-360 (1985).</li>
<li>Sakurai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+modification+of+parallel+fibre-Purkinje+cell+transmission+in+in+vitro+guinea-pig+cerebellar+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Synaptic modification of parallel fibre-Purkinje cell transmission in in vitro guinea-pig cerebellar slices.</a> Journal of Physiology. 394, 462-480 (1987).</li>
<li>Hirano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depression+and+potentiation+of+the+synaptic+transmission+between+a+granule+cell+and+a+Purkinje+cell+in+rat+cerebellar+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Depression and potentiation of the synaptic transmission between a granule cell and a Purkinje cell in rat cerebellar culture.</a> Neuroscience Letters. 119 (2), 141-144 (1990).</li>
<li>Linden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+long-term+depression+of+AMPA+currents+in+cultured+cerebellar+purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A long-term depression of AMPA currents in cultured cerebellar purkinje neurons.</a> Neuron. 7 (1), 81-89 (1991).</li>
<li>Linden, D. J., Connor, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Participation+of+postsynaptic+PKC+in+cerebellar+long-term+depression+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Participation of postsynaptic PKC in cerebellar long-term depression in culture.</a> Science. 254 (5038), 1656-1659 (1991).</li>
<li>Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+long-term+depression%3A+characterization%2C+signal+transduction+and+functional+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cerebellar long-term depression: characterization, signal transduction and functional roles.</a> Physiological Reviews. 81 (3), 1143-1195 (2001).</li>
<li>Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+organization+of+cerebellar+long-term+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The molecular organization of cerebellar long-term depression.</a> Nature Reviews Neuroscience. 3, 896-902 (2002).</li>
<li>Ito, M., Jastreboff, P. J., Miyashita, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+effects+of+unilateral+lesions+in+the+flocculus+upon+eye+movements+in+albino+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Specific effects of unilateral lesions in the flocculus upon eye movements in albino rabbits.</a> Experimental Brain Research. 45 (1-2), 233-242 (1982).</li>
<li>Nagao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+vestibulocerebellar+lesion+upon+dynamic+characteristics+and+adaptation+of+vestibulo-ocular+and+optokinetic+responses+in+pigmented+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of vestibulocerebellar lesion upon dynamic characteristics and adaptation of vestibulo-ocular and optokinetic responses in pigmented rabbits.</a> Experimental Brain Research. 53 (1), 36-46 (1983).</li>
<li>Watanabe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+events+correlated+with+long-term+adaptation+of+the+horizontal+vestibulo-ocular+reflex+in+the+primate+flocculus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Neuronal events correlated with long-term adaptation of the horizontal vestibulo-ocular reflex in the primate flocculus.</a> Brain Research. 297 (1), 169-174 (1984).</li>
<li>van Neerven, J., Pompeiano, O., Collewijn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+GABAergic+and+noradrenergic+injections+into+the+cerebellar+flocculus+on+vestibulo-ocular+reflexes+in+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of GABAergic and noradrenergic injections into the cerebellar flocculus on vestibulo-ocular reflexes in the rabbit.</a> Progress in Brain Research. 88, 485-497 (1991).</li>
<li>Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+motor+learning+in+the+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanism of motor learning in the cerebellum.</a> Brain Research. 886, 237-245 (2000).</li>
<li>De Schutter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+long-term+depression+might+normalize+excitation+of+Purkinje+cells%3A+a+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Cerebellar long-term depression might normalize excitation of Purkinje cells: a hypothesis.</a> Trends in Neurosciences. 18 (7), 291-295 (1995).</li>
<li>Hansel, C., Linden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+depression+of+the+cerebellar+climbing+fiber-Purkinje+neuron+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Long-term depression of the cerebellar climbing fiber-Purkinje neuron synapse.</a> Neuron. 26 (2), 473-482 (2000).</li>
<li>Safo, P., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+dependence+of+the+induction+of+cerebellar+LTD%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Timing dependence of the induction of cerebellar LTD.</a> Neuropharmacology. 54 (1), 213-218 (2007).</li>
<li>Schonewille, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reevaluating+the+role+of+LTD+in+cerebellar+motor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Reevaluating the role of LTD in cerebellar motor learning.</a> Neuron. 70 (1), 43-500 (2011).</li>
<li>Karachot, L., Kado, T. R., Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus+parameters+for+induction+of+long-term+depression+in+in+vitro+rat+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Stimulus parameters for induction of long-term depression in in vitro rat Purkinje cells.</a> Neuroscience Research. 21 (2), 161-168 (1994).</li>
<li>Hartell, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cerebellar+long-term+depression+requires+activation+of+glutamate+metabotropic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Induction of cerebellar long-term depression requires activation of glutamate metabotropic receptors.</a> Neuroreport. 5, 913-916 (1994).</li>
<li>Aiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficient+cerebellar+long-term+depression+and+impaired+motor+learning+in+mGluR1+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mGluR1 mutant mice.</a> Cell. 79, 377-388 (1994).</li>
<li>Steinberg, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+in+vivo+mutations+of+the+AMPA+receptor+subunit+GluR2+and+its+interacting+protein+PICK1+eliminate+cerebellar+long-term+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted in vivo mutations of the AMPA receptor subunit GluR2 and its interacting protein PICK1 eliminate cerebellar long-term depression.</a> Neuron. 46 (6), 845-860 (2006).</li>
<li>Koekkoek, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+FMR1+in+Purkinje+cells+enhances+parallel+fiber+LTD%2C+enlarges+spines%2C+and+attenuates+cerebellar+eyelid+conditioning+in+Fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Deletion of FMR1 in Purkinje cells enhances parallel fiber LTD, enlarges spines, and attenuates cerebellar eyelid conditioning in Fragile X syndrome.</a> Neuron. 47 (3), 339-352 (2005).</li>
<li>Yamaguchi, K., Itohara, S., Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassessment+of+long-term+depression+in+cerebellar+Purkinje+cells+in+mice+carrying+mutated+GluA2+C+terminus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reassessment of long-term depression in cerebellar Purkinje cells in mice carrying mutated GluA2 C terminus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 10192-10197 (2016).</li>
<li>De Schutter, E., Bower, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+active+membrane+model+of+the+cerebellar+Purkinje+cell+II.+Simulation+of+synaptic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">An active membrane model of the cerebellar Purkinje cell II. Simulation of synaptic responses.</a> Journal of Neurophysiology. 71 (1), 401-419 (1994).</li>
<li>Swensen, A. M., Bean, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+mechanisms+of+burst+firing+in+dissociated+Purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ionic mechanisms of burst firing in dissociated Purkinje neurons.</a> Journal of Neuroscience. 23 (29), 9650-9663 (2003).</li>
<li>Fukuda, J., Kameyama, M., Yamaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakdown+of+cytoskeletal+filaments+selectively+reduces+Na+and+Ca+spikes+in+cultured+mammal+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Breakdown of cytoskeletal filaments selectively reduces Na and Ca spikes in cultured mammal neurones.</a> Nature. 294 (5836), 82-85 (1981).</li>
<li>Arancillo, M., White, J. J., Lin, T., Stay, T. L., Silltoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+Purkinje+cell+firing+properties+during+postnatal+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of Purkinje cell firing properties during postnatal mouse development.</a> Journal of Neurophysiology. 113, 578-591 (2015).</li>
<li>Ishikawa, T., Shimuta, M., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+sensory+integration+in+single+cerebellar+granule+cell+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Multimodal sensory integration in single cerebellar granule cell in vivo.</a> eLife. 4, e12916(2015).</li>
<li>Tempia, F., Minlaci, M. C., Anchisi, D., Strata, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+current+mediated+by+metabotropic+glutamate+receptors+in+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic current mediated by metabotropic glutamate receptors in cerebellar Purkinje cells.</a> Journal of Neurophysiology. 80, 520-528 (1998).</li>
<li>Wang, S. S., Denk, W., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coincidence+detection+in+single+dendritic+spines+mediated+by+calcium+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Coincidence detection in single dendritic spines mediated by calcium release.</a> Nature Neuroscience. 3, 1266-1273 (2000).</li>
<li>Kuroda, S., Schweighofer, N., Kawato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+signal+transduction+pathways+in+cerebellar+long-term+depression+by+kinetic+simulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Exploration of signal transduction pathways in cerebellar long-term depression by kinetic simulation.</a> Journal of Neuroscience. 21 (15), 5693-5702 (2001).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+cerebellar+engrams+in+short-term+and+long-term+motor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Distinct cerebellar engrams in short-term and long-term motor learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), E188-E193 (2014).</li>
<li>Inoshita, T., Hirano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+long-term+depression+in+the+cerebellar+flocculus+during+adaptation+of+optokinetic+response%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Occurrence of long-term depression in the cerebellar flocculus during adaptation of optokinetic response.</a> eLife. 27, 36209(2018).</li>
<li>Belmeguenai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+plasticity+complements+long-term+potentiation+in+parallel+fiber+input+gain+control+in+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intrinsic plasticity complements long-term potentiation in parallel fiber input gain control in cerebellar Purkinje cells.</a> Journal of Neuroscience. 30 (41), 13630-13643 (2010).</li>
<li>Ohtsuki, G., Piochon, C., Adelman, J. P., Hansel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SK2+channel+modulation+contributes+to+compartment+specific+dendritic+plasticity+in+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SK2 channel modulation contributes to compartment specific dendritic plasticity in cerebellar Purkinje cells.</a> Neuron. 75, 108-120 (2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Dört protokol arasındaki farklar
LTD-inducing protokolleri 1 ve 2, Cjs 300 kez 1 Hz serebellar LTD stimülasyon frekansı ikna etmek için yeterli dir. Cf stimülasyon frekansı fizyolojik bir aralıkta gibi görünüyordu, uyarı yetişkin farelerde karmaşık başak atış hızı olduğu bildirilmiştir çünkü (P60) 1.25 Hz36olduğu bildirilmiştir . Ancak, CF stimülasyon tek başına PF-CF sinaps uzun vadeli plastisite neden olmadı, protokol1 ve 2 kullanılan gibi(Şekil 4</...

Serebellar korteksin ayrıntılı nöronal ağların sinaptik organizasyonu, bilgisayarları oluşan, moleküler tabaka internöronlar (sepet ve stellat hücreleri), Golgi hücreleri, granül hücrelerinden PFs, yosunlu lifler ve tırmanma lifleri (CFs), aydınlatılmış edilmiştir uyarma / inhibisyon ve divergence / yakınsama açısından, ve iyi organize devre diyagramı beyincik bir "nöronal makine"1olduğunu ileri sürmüştür , bu "makine" amacı hakkında daha önce hiçbir fikrim olmamasına rağmen. Daha sonra Marr, PC'lere yapılan PF'lerin üçlü kat bir çözümleme ağı2oluşturduğunu ileri sürüler. Ayrıca her CF elemental hareket2için bir serebral talimat ilettiğini önerdi. O PFs ve CF eşzamanlı aktivasyonu PF-PC sinaps aktivitesini artırmak ve PF-PC sinaps uzun vadeli potentiation (LTP) neden olacağını varsaydı. Öte yandan, Albus PFs ve CF senkron aktivasyon PF-PC sinaps3LTD sonuçlandı varsayılır. Yukarıdaki çalışmaların her ikisi de serebellum benzersiz bir bellek cihazı olarak yorumlamak, hangi serebellar kortikal ağ içine dahil Marr-Albus modeli öğrenme makinesi modelioluşumuna yol açar.
Bu teorik tahminlere göre, iki satır lık kanıt sinajik plastisitenin beyincikte varlığını göstermektedir. İlk kanıt satırı flocculus anatomik organizasyonu tarafından önerildi; Burada vestibüler organ kökenli MF yolları ve retina kökenli CF yolları 4' tebirleşir. Bu eşsiz yakınsama deseni, flocculus'ta meydana gelen bir sinaptik plastisitenin vestibulo-oküler refleksin dikkat çekici adaptasyonuna neden olduğunu göstermektedir. İkinci olarak, flocculus'taki PK'ların yanıtının kaydedilmesi ve flocculus'un lezyonunun da desteklediği yukarıdaki hipotez5,6,7. Ayrıca, bir maymunun el hareketi8 adaptasyon sırasında PC deşarj desen sinaptik plastisite hipotezi, özellikle Albus's LTD-hipotezimaj 3destekledi.
Doğrudan sinaptik plastisite doğasını belirlemek için, tekrarlanan konjonktif stimülasyon (Cjs) PFs bir paket ve cf özellikle in vivo PC innerve PF-PC sinapsların iletim etkinliği için LTD ikna gösterilmiştir9, 10,11. Bir serebellar dilim12 ve kültürlü bilgisayarları kullanarak sonraki in vitro keşiflerde, co-kültürlü granül hücre stimülasyon ve zeytin hücresi stimülasyon13 veya iyontophoretically uygulanan glutamat ve somatik birlikte depolarizasyon14,15 LTD neden oldu. LTD-indüksiyonun altında yatan sinyal iletim mekanizması da in vitro preparatlar kullanılarak yoğun bir şekilde araştırılmıştır16,17.
VOR ve OKR adaptasyonları genellikle serebellar motor öğrenme gen manipülasyon etkilerinin kantitatif değerlendirilmesi için kullanılmıştır, vestibüle-serebellar korteks VOR adaptif öğrenme temel kökeni olduğu kanıtlanmıştır çünkü18 ,19,20 ve OKR19,21 LTD-indüksiyon başarısızlığı ve davranışsal motor öğrenme bozukluğu arasındaki korelasyon, LTD motor önemli bir rol oynadığını kanıt olarak alınmıştır öğrenme mekanizmaları22. Bu görüşler topluca motor öğrenme LTD hipotezi veya Marr-Albus-Itohipotezi 23,24,25,26olarak adlandırılır .
Göz hareketinin adaptif öğrenme benzer protokoller kullanılarak ölçülür, çeşitli deneysel koşullar dilimhazırlanmasındaLTD ikna etmek için kullanılmıştır 27,28,29,30,31 . Son zamanlarda, Schonewille ve ark.26 bazı gen manipüle fareler normal motor öğrenme gösterdi bildirdi, ama serebellar dilimleri LTD göstermedi, ve bu nedenle LTD motor öğrenme için gerekli olmadığı sonucuna vardı. Ancak, LTD indüksiyon sadece oda sıcaklığında protokol bir tür kullanılarak denendi. Bu nedenle, yaklaşık 30 °C'de kayıt koşullarında çeşitli LTD-indükleme protokolleri kullandık ve LTD'nin bu protokolleri fizyolojik sıcaklıklarda kullanarak genle manipüle edilen farelerde güvenilir bir şekilde indüklendiğini doğruladık32.
Ancak, konjonktif stimülasyontemel özellikleri ile ilgili bazı sorular kalır. İlk karmaşık başak şekli ve LTD genliği arasındaki ilişkidir. İkinci olarak, PF-stimülasyon ve somatik depolarizasyon ile birlikte, kullanılan uyaran ların sayısıgerekli olup olmadığı zor du. Bu çalışmada, bu sorular yabani tip (WT) fareler kullanılarak araştırılmıştır.

<table><tbody><tr><td>Amplifikatör</td><td>Moleküler Cihazlar-Akson</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat cam kılcal</td><td>Sutter</td><td>BF150-110-10</td><td></td></tr><tr><td>Sayısallaştırıcı</td><td>Moleküler Cihazlar-Axon</td><td>Digidata1322A</td><td></td></tr><tr><td>Elektrot çektirme</td><td>Sutter</td><td>Modeli P-97</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>FUJIFILM Wako Saf Kimyasal</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>İzolatör</td><td>A.M.P.I.</td><td>ISOflex</td><td></td></tr><tr><td>Doğrusal dilimleyici</td><td>Dosaka EM</td><td>PRO7N</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>NIKON</td><td>Eclipse E600FN</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltik pompa</td><td>Gilson</td><td>MP1 Tek Kanallı Pompa</td><td></td></tr><tr><td>Pikrotoksin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>Saf su yapıcı</td><td>Merck-Millipore</td><td>MilliQ 7000</td><td></td></tr><tr><td>Deney yazılımı</td><td>İstatistik için moleküler prob-Axon</td><td>pClamp 10</td><td></td></tr><tr><td>Yazılımı</td><td>KyensLab</td><td>KyPlot 5.0</td><td></td></tr><tr><td>Stimülatör</td><td>WPI</td><td>DS8000</td><td></td></tr><tr><td>Sıcaklık kontrolörü</td><td>Warner</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoksin</td><td>Tocris</td><td>1078</td><td></td></tr></tbody></table>

erişkin serebellar dilimlerde uzun süreli depresyon İndüksiyonunun değerlendirilmesi

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Sinaptik plastisite öğrenme ve bellek için bir mekanizma sağlar. Serebellar motor öğrenme için, paralel liflerden (PF) Purkinje hücrelerine (PC) sinaptik iletimlerin uzun süreli depresyonu (LTD) motor öğrenmenin temeli olarak kabul edilir ve hem LTD hem de motor öğrenme nin eksiklikleri çeşitli genle manipüle edilmiş hayvanlar. Motor öğrenme yeteneğinin değerlendirilmesi için optokinetik refleks (OKR), vestibüler-göz refleksi (VOR) ve rotarod testi gibi yaygın motor öğrenme setleri kullanıldı. Ancak, GluA2 karboksi sonlandırıcı modifiye knock-in fareler elde edilen sonuçlar, PF-LTD olmamasına rağmen, VOR ve OKR normal adaptasyon gösterdi. Bu raporda, LTD indüksiyon uymuş sadece oda sıcaklığında stimülasyon protokolü bir tür kullanılarak denendi. Böylece, serebellar LTD indüklemek için koşullar yakın fizyolojik sıcaklıkta çeşitli protokoller kullanılarak aynı knock-in mutantlar araştırıldı. Son olarak, LTD'nin bu gen letimli farelerde indüklenebileceği stimülasyon protokolleri bulduk. Bu çalışmada, LTD-indüksiyonu değerlendirmek için bir dizi protokol önerilmiştir, bu da LTD ile motor öğrenimi arasındaki nedensel ilişkinin daha doğru bir şekilde incelenmesine olanak sağlayacaktır. Sonuç olarak, gen leilgili farelerde LTD değerlendirilirken deneysel koşullar çok önemlidir.

Bu çalışmada serebellar LTD.'yi ikna etmek için dört protokol kullanılmıştır. İlk iki protokolde (protokol 1 ve 2), pf-stimülasyon ve CF-stimülasyon un birleşimi akım kelepçesi koşullarında uygulandı. Diğer iki protokolde (protokol 3 ve 4), somatik depolarizasyon gerilim-kelepçe koşullarında CF-stimülasyon yerine geçildi. Konjonktif stimülasyon sırasında gerilim-iz veya akım izleri karşılaştırıldı (Şekil 2).
1 PF-stimülasyon ve 1 CF-stimülasyon akım-kelepçe koşull...

Bazı gen manipüle hayvanlarda, tek bir protokol kullanarak serebellar Purkinje hücrelerinde LTD neden başarısız olabilir, ve LTD ve motor öğrenme arasında bir tutarsızlık olabilir. Gen lemanlı hayvanlarda LTD indüksiyonu değerlendirmek için birden fazla protokol gereklidir. Standart protokoller gösterilir.

Erişkin Serebellar Dilimlerde Uzun Süreli Depresyon İndüksiyonunun Değerlendirilmesi

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Belirli bir protein fonksiyonu gen manipülasyonu ile değiştirildiğinde, tahriş edici yetmezlik ve motor koşu bozukluğu koordinasyonu LTD ve motor öğrenme arasındaki nedensel ilişki için gerekli bir koşul olarak kabul edilir. Burada, gen lemanlı hayvanlarda telafi mekanizmaları ile indüklenebilecek LTD'yi değerlendirmek için birden fazla protokolün kullanıldığını gösteriyoruz. Beyin hasat önce, soğuk ve buz üzerinde ACSF iki 50 mililitrelik gagaları oksijen.Çözelti sıcaklığı dört santigrat derecenin altına ulaştığında, buz gibi gagalardan birine bir milimolar tetrodotoxin 50 mikrolitre ekleyin. Beyin hasat için, baş tutun ve orta hat boyunca yüzeysel deri kesmek için oftalmolojik makas kullanın. El ile kafatası yüzeyini ortaya çıkarmak için deri geri ve her iki göz üzerinde bir çizgi boyunca kafatası kesmeden önce göz ve kulaklar sadece üzerinde büyük spinocerebellar delikten yatay olarak kafatası boyunca kesmek için makas kullanın.Beynin ortasındaki beyni kesmek ve beyincik de dahil olmak üzere beynin kaudal kısmını kafatasından izole etmek için neşter kullanın. Acsf buz soğuk kabında örnek batırın ve beher beyin bloğu karıştırmak değil, böylece kabarcık boru ayarlayın. En az yedi dakika sonra, beyin bloğu almak ve herhangi bir aşırı ACSF absorbe etmek için filtre kağıt bir parça kullanmak için bir spatula kullanın.Uygun bir tıbbi yapıştırıcı ile agar bir iki şer metrelik bir parça üzerine doku ventral tarafı aşağı monte edin. Mümkün olduğunca Purkinje hücrelerinin dendritik düzleme paralel olarak beyin dokusunun sağ yarımkürekesmek için bir bıçak kullanın. Kesme ve yarımkürenin diğer tarafında kaldırmak ve üstün ve inferior colliculi arasında beyin kesti.Omuriliği kesin ve kesilmiş beyincik sağ tarafını agar bloğu ile önceden soğutulmuş numune tepsisine yapıştırın. Daha sonra, numune tepsisini yatırarak, eti onarmak ve fazla tutkalları temizlemek için numunenin üzerine ACSF dökün. Beyin örneğini dilimlemek için, serebellumun dorsal tarafı nın ön tarafta olduğu numuneyi yönlendirin ve tetrodotoksin le takviye edilmiş buz gibi kesme ACSF'yi tamamen serebelluma batırın.Kesme çözeltisi içine bir gaz tüpü yerleştirin ve bir oksijen-karbondioksit gazı karışımı ile köpürme başlatmak. İnce cımbız ve büyüteçler kullanarak, araknoid mater kaldırmak ve serebellar peduncle çıkarmak. Beyin sapı ve agar bloğu çıkardıktan sonra, serebellumun dorsal yüzeyinin vibratomun jiletine bakması ve ilk kesme yerini ayarlaması için tepsiyi 180 derece döndürün.Vibratom genliğini 5,5'e, frekansı 85 Hertz'e, hızı üçe dörte, dilim kalınlığını 300 mikrometreye ayarlayın. Serebellar dilimler elde edilir gibi, 26 derece santigrat su banyosunda bir akrilik kuluçka için bölümleri aktarmak ve tamamen en az bir saat taze oksijenli ACSF örnekleri batırmak için bir naylon ağ kullanın. Tüm hücre yama kıskacı raporlama için, dakikada iki mililitre akış hızı nda toksin çözeltisi ile 30 derece santigrat kayıt odası perfüzyon önce üç dakika boyunca ultasonication tarafından ACSF bir mikromolar picrotoksin eritin.Birkaç dakika sonra, kayıt odasına bir serebellar dilim aktarın ve platin ağırlığı ve naylon iplikleri ile doku düzeltmek. Sonra taze ACSF ile uyarıcı bir elektrot doldurun. Paralel lifleri uyarmak için, Purkinje hücre tabakasıyaklaşık 50 mikrometre moleküler tabaka yüzeyinde uyarıcı elektrot yerleştirin.Tırmanma lifleri uyarılması için, Purkinje hücre tabakasının altına uyarıcı elektrot yerleştirin ve 0,45 mikrometre filtrelenmiş potasyum veya sezyum bazlı iç çözelti sekiz mikrolitre ile bir kayıt elektrot doldurmak için bir mikroyükleyici kullanın. Elektrot ACSF'ye batırmadan önce kayıt elektrobuna zayıf pozitif basınç uygulayın. Elektrot direnci 2-4 megaohm olmalı ve sıvı bağlantı potansiyeli düzeltilmelidir.Bir Purkinje hücresinin sağlıklı parlak hücre gövdesine kayıt elektrotuyla yaklaşın ve Purkinje hücresinin yüzeyini hafifçe itin. Sonra pozitif basınç uygulayarak durdurmak ve bir gigaohm mühür oluşana kadar negatif basınç uygulayın. Daha sonra eksi 70 milivolt membran potansiyelini korumak ve 0.1 hertz eksi iki milivolt 100 milisaniye darbeler uygulayarak, giriş direnci, seri direnç ve giriş kapasitans sürekli izleme, bütün bir hücre yapılandırması kurmak için negatif basınç kullanın.Uzun süreli depresyon indüksiyonu için, 0.1 milisaniyelik darbe ile moleküler tabakayı uyarmak ve paralel lif uyarıcı post-sinaptik akımları tanımlamak için bir çift darbe uyarıcı uygulayın. Bir eşleştirilmiş nabız kolaylaştırılması ve stimülasyon yoğunluğundaki artışa göre genlik kademeli artış gözlenmelidir. Test yanıtını kaydetmek için tek bir 0.1 hertz darbesi uygulayın ve uyarılmış genlik 200 pikoamp civarında olacak şekilde uyarıcının yoğunluğunu ayarlayın.Purkinje hücre tabakasının altındaki tırmanma lifleri teşvik ve tırmanma lif aktivasyonu tarafından ortaya çıkarılan paralel lif uyarıcı post-sinaptik akımları belirlemek için, bir çift darbe uyarıcı uygulayın. Eşleştirilmiş nabız depresyonu stimülasyon yoğunluğundaki artışla ilişkili olarak tamamen veya hiçbiri gözlenmemelidir. Bu temsili deneyde, dilim hazırlanmasında mevcut kelepçe koşullarında bir paralel lif stimülasyonu ve bir tırmanma lifsi stimülasyonu kullanılmıştır.Konjonktif stimülasyontarafından ortaya çıkarılan karmaşık başak şekli, sadece tırmanış lifi stimülasyonu nun ortaya çıkardığı ilk dik başakletve ardından iki ila üç başakletin ortaya çıkardığına benzerdi. Benzer şekilli karmaşık bir başak, 50 milisaniye sonra konjonktif ikinci paralel ve tırmanma lif stimülasyonu ile paralel bir lif stimülasyonu takip edildiğinde gözlenmiştir. Sezyum bazlı iç solüsyon kullanılarak gerilim kelepçesi koşullarında yapılan bu testte, 50 milisaniye sonra ikinci bir paralel lif stimülasyonu ve somatik depolarizasyon uygulaması ile paralel lif stimülasyonu takip edilmiştir.Somatik depolarizasyon üzerine eksi 70 ile sıfır milivolt arasında bir içe akım ortaya çıktı ve kuyruk akımı da repolarizasyondan sonra uyarıldı. Son olarak, voltaj kıskacı koşullarında somatik depolarizasyon ile aynı anda 100 hertz beş paralel lif uyaranları verildi. Yine de depolarizasyon sırasında tekrarlayan içe akım nesli ortaya çıkarılmış ve repolarizasyon dan sonra kuyruk akımı indüklenmiştir.Gen leğenli hayvanlarda serebellar LTD ile motor öğrenme arasındaki ilişkiyi değerlendirmek için, rahat fizyolojik koşullar altında LTD'yi ikna etmek için birden fazla protokol kullanılmalıdır. Motor öğrenme sonrası gen leğenli hayvanlarda serebellar LTD görselleştirilmişse, aralarındaki nedensel ilişki daha doğrudan incelenebilir.

assessment-long-term-depression-induction-adult-cerebellar

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu makale, sıçan ve transgenik farelerin hipokampal dilimler sinaptik değişiklikler, beynin yaşlanma ve Alzheimer hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıklar, yaşa bağlı ile ilgili çalışma için hazırlamak için prosedürler sıralanıyor.

Yaşlanma ve Amiloid Patoloji sırasında sinaptik değişiklikler Çalışması Sıçanlar ve Transgenik Farelerde akut Hipokampal Dilimleri hazırlanması

Bu yöntem, Organotipik serebellar kültürlerin üretimi ve farklı serebellar hücre tiplerinin canlılığı belli apoptotik uyaranların etkisi açıklanmıştır.

Organotipik Serebellar Kültürler: Apoptotik Zorluklar ve Tayin

Bu videoda, motor kontrol için gerekli olan paralel lifler, tırmanan lifler ve Purkinje hücreleri arasındaki sinaptik etkileşimleri araştırmak için bir fare serebellar beyin dilimi kullanıldı. Tırmanan liflerin uyarılması, Purkinje hücrelerinde uzun süreli depresyona (LTD) neden oldu, sinaptik kuvveti zayıflattı ve paralel lif stimülasyonuna yanıtın azalmasına neden oldu.

Bir Fare Beyin Diliminde Serebellar Purkinje Nöronlarında Uzun Süreli Depresyonun İndüksiyonu

Çalışmalar, katodal transkraniyal doğru akım stimülasyonunun ilaca dirençli nöbetler üzerinde baskılayıcı etkiler yaratabileceğini göstermiştir. Bu çalışmada, farelerin beyin dilimi hazırlığında nöbet benzeri aktivitenin doğru akım stimülasyonu ve çoklu elektrot dizisi kaydının değerlendirildiği bir in vitro deney düzeneği tasarlanmıştır. Doğru akım stimülasyon parametreleri değerlendirildi.

Fare Beyin Dilim Hazırlık içinde nöbet benzeri Faaliyet doğrudan akım Stimülasyon ve Multi-elektrot Dizi Kaydı

Bu iletişim kuralı bir en iyi duruma getirilmiş Nuygulanmasını gösteren-metil-D-glucamine (NMDG) koruyucu kurtarma yöntemi beyin dilim hazırlık. Bir tek medya formülasyon güvenilir bir şekilde sağlıklı beyin dilimleri her yaştan ve çeşitli deneysel uygulamalar için hayvanlardan elde etmek için kullanılır.

En iyi duruma getirilmiş bir Nkullanarak akut beyin dilimleri hazırlanması-metil-D-glucamine koruyucu kurtarma yöntemi

Bu iletişim kuralı oksijen seviyesini geri dönüşümlü arabellek küçük bir hacim ve etkinlik bağımlı sinaptik plastisite batık akut Hipokampal dilimler halinde kayıt metodolojik açıdan istikrar açıklar.

Sinaptik plastisite akut Hipokampal dilimleri bir küçük hacimli geri dönüşüm-, perfüzyon- ve batma-tipi oda sistemi içinde tutulan kayıt

Burada fare serebellum ve miyelin kılıf immünhistokimya tarafından myelination ve remyelination merkezi sinir sisteminde mekanizmaları araştıran için uygun boyama dilim kültürler organotypic hazırlamak için bir yöntem mevcut.

Hazırlık ve Immunostaining Myelinating Organotypic serebellar dilim kültürlerin

Organotipik dilim kültürleri nörogelişimsel veya dejeneratif /rejeneratif süreçleri incelemek için güçlü bir araçtır. Burada, fare serebellar dilim kültürlerde Purkinje hücrelerinin nörogelişimsel ölüm modelleri bir protokol açıklar. Bu yöntem nöroprotektif ilaç keşfinde araştırma yada yararlı olabilir.

Organotipik Serebellar Dilim Kültürlerde Purkinje Hücre Sağkalım

Bu doku hipoksik hasarı azaltmak için buz gibi NMDG-aCSF ile transkardiyal perfüzyon ve dilim kesme yararlanır yetişkin ve yaşlanma fare hipokampi akut dilim hazırlanması için bir protokoldür. Elde edilen dilimler saatlerce sağlıklı kalır ve uzun süreli yama kıskaçları ve alan kayıtları için uygundur.

Yetişkin ve Yaşlanan Farelerden Hipokampal Dilimlerde Hipoksinin En Aza Indirilmesi

Burada, tekrarlanan hafif travmatik beyin hasarının (r-mTBI) hipokampustaki sinaptik plastisite üzerindeki etkilerini incelemek için uyanık bir kapalı kafa travması modelinin nasıl kullanılabileceği gösterilmiştir. Model, hastalarda r-mTBI'nın önemli özelliklerini çoğaltır ve in vitro elektrofizyoloji ile birlikte kullanılır.

Hafif Travmatik Beyin Hasarının Uyanık Kapalı Kafa Travması Modelini Kullanarak Sinaptik Plastisitedeki Değişikliklerin Değerlendirilmesi

Öğrenin, gen manipülasyonu yapılmış hayvan modellerinde Purkinje hücrelerinde uzun süreli depresyon indüksiyonunu değerlendirmek için çoklu elektrofizyolojik protokolleri. Bu yöntem, sinaptik plastisite ve motor öğrenme mekanizmalarını incelemeye yardımcı olur.

Erişkin Serebellar Dilimlerde Uzun Süreli Depresyon İndüksiyonunun Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet