Name: Inositol fosfat veya Phosphoinositide etkileşim proteinleri yakınlık Kromatografi Batı Blot veya kütle spektrometresi ile bağlantılı olarak tanımlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Keşfedin inositol fosfat veya fosfoinositid ile etkileşen proteinleri yakınlık kromatografi, Western blot ve kütle spektrometrisi kullanarak tanımlama yöntemini. Bu hassas ve radyoaktif olmayan protokol, hücre biyolojisi ve biyokimya araştırmalarında metabolit düzenleyici fonksiyonlarını anlamak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Doğal Bilimler ve Kanada Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC, RGPIN-2019-04658) tarafından destekleniyordu; Erken kariyer araştırmacılar için NSERC Discovery fırlatma eki (DGECR-2019-00081) ve McGill Üniversitesi tarafından.

Yazarın ifşa etmesi gereken bir şey yok.

IPS veya 'e bağlanan proteinlerin tanımlanması, bu metabolitlerin hücresel fonksiyonunu anlamak için önemlidir. Batı leke veya kütle spektrometresi ile bağlantılı benzeşme kromatografi, IP veya PI etkileşimi olan proteinlerin belirlenmesi ve dolayısıyla düzenleyici fonksiyonları hakkında öngörüler elde etmek için bir fırsat sunar. IPS veya kimyasal olarak etiketlenmiş [örn., INS (1, 4, 5) P3 kimyasal olarak biotin bağlı] ve streptavidin yoluyla agaroz boncuklar için çapraz bağlı veya streptavidin tarafından yakalanan man...

İnositol fosfat (IPS) ve phosphoinositides (PIS) gen ifadesi1,2,3, vezikül kaçakçılığı kontrolü gibi hücresel süreçlerin düzenlenmesi yoluyla ökaryote biyolojisinde merkezi bir rol oynamaktadır 4, sinyal dönüştürücü5,6, metabolizma7,8,9, ve geliştirme8,10. Bu metabolitlerin düzenleyici fonksiyonu proteinlerle etkileşim ve böylece protein fonksiyonunu düzenleyen yeteneğinden sonuçlanır. Proteinler tarafından bağlayıcı üzerine, IPS ve protein konformasyonu11değiştirebilir, katalitik aktivite12, veya etkileşimler13 ve dolayısıyla hücresel fonksiyonunu etkiler. IPS ve, Nucleus2,3,14,15, endoplazmik retikulum16,17, Plasma gibi birden fazla alt hücreli bölmeler halinde dağıtılır membran1 ve sitsol18, proteinlerle ilişkili3,19 veya Rnas20.
Membran ile ilişkili PI (4, 5) P2 fosfolipase C tarafından pedi (1, 4, 5) P3, hangi fosforilize edilebilir veya IP kinazları ve fosfatlar tarafından dephosphorylated, sırasıyla. IPS, proteinlere bağlanan ve düzenleyici fonksiyonları destekleyen çözünebilir moleküllerdir. Örneğin, INS (1, 4, 5) Metazoan P3 IP1 reseptörleri bağlayıcı tarafından ikinci bir haberci olarak hareket edebilir, hangi reseptör Konformasyonel değişiklikleri ve böylece CA serbest bırakmak2 + hücre içi mağazalardan11. INS (1, 3, 4, 5) P4 histon deasetilaz kompleksine bağlanır ve protein kompleksi montajı ve aktivite13düzenler. IPS düzenleyici fonksiyon diğer örnekler kromatin organizasyon21, RNA taşıma22,23, RNA düzenleme24ve transkripsiyon1,2,3 kontrolü içerir . Buna karşılık, genellikle plazma membranı veya organel membranlara protein alımı ile ilişkilidir25. Ancak, 'in gelişmekte olan bir özelliği, membran olmayan bir ortamda proteinleri ile ilişkilendirmek için yeteneğidir3,15,19,26. Bu nükleer reseptör steroidojenik faktör olduğunu, hangi transkripsiyonel kontrol fonksiyonu Pi tarafından düzenlenir (3, 4, 5) P319, ve poli-A polimeraz hangi enzimatik aktivite nükleer PI tarafından düzenlenir (4, 5) P226. IP 'ler ve için bir düzenleyici rol Maya22,27, mammalin hücreleri19,23, Drosophila10 ve Worms28dahil olmak üzere birçok organizmalarda gösterildi. Önemli olan bu metabolitlerin Tripanozomlar içinde rolüdür, bu da erken ökaryotik soydan uzaklaşır. Bu metabolitler tripanosoma brucei transkripsiyonel kontrol1,3, geliştirme8, organel Biyogenez ve protein trafiği önemli bir rol oynar29,30 , 31 , 32ve aynı zamanda patojenler T. cruzi33,34,35, Toxoplasma36 ve Plasmodium geliştirme ve enfeksiyon kontrol dahil edilir 5 , 37. bu nedenle, tripanosomlar içinde IPS ve rolünü anlamak bu moleküller için yeni biyolojik fonksiyon aydınlatmak ve Roman uyuşturucu hedeflerini belirlemek için yardımcı olabilir.
Protein ve IP veya PI bağlamanın özgüllüğü, protein etkileşimindeki etki alanlarına ve Inositol13'ün fosforilasyon durumuna bağlıdır,38, Ayrıca, lipid parçası ile etkileşimler de19oluşur. Çeşitli IPS ve ve onların değiştirme kinazlar ve fosfatları metabolit kullanılabilirliği ve bolluk, inositol fosforilasyon durumu ve protein etkilenir protein fonksiyonunu kontrol etmek için esnek bir hücresel mekanizma sağlar etkileşimin benzeşimi1,3,13,38. Bazı protein alanları iyi karakterize olmasına rağmen39,40,41, örn., pleckstrin Homoloji Domain42 ve SPX (SYG1/Pho81/XPR1) Domains43 ,44,45, bazı proteinler IPS veya ile bilinmeyen mekanizmalar tarafından etkileşimde. Örneğin, T. brucei 'nin baskıcı aktivatör proteini 1 (RAP1) standart Pi-bağlayıcı etki alanlarına sahip değildir, ancak Pi (3, 4, 5) P3 ile etkileşime girer ve antijenik varyasyona katılan genlerin kontrol transkripsiyonu3. Trypanosome, Maya veya memelilerin hücrelerinden IP veya Pi etkileşen proteinlerin benzeşme Kromatografi ve kütle spektrometresi analizi, bilinen IP veya PI bağlama etki alanları olmadan çeşitli proteinleri tespit etti8,46, 47. Data, bu metabolitleri bağlayan ek karakterize olmayan protein alanları önerir. Bu nedenle, IPS veya ile etkileşim proteinlerin tanımlanması, bu küçük moleküller için protein-metabolit etkileşimi ve yeni hücresel düzenleyici fonksiyonların roman mekanizmaları ortaya çıkarabilir.
Burada açıklanan yöntem, IPS veya 'e bağlanan proteinleri belirlemek için Batı blo, veya kütle spektrometresi ile birleşen benzeşme Kromatografi kullanır. Bu ya da çapraz bağlı streptavidin agaroz boncuk ya da alternatif olarak, streptavidin-konjuik manyetik boncuklar üzerinden yakalanan konjuik olan biyotinlenmiş IPS veya kullanır (Şekil 1). Bu yöntem, hassas, radyoaktif olmayan, Liposome içermeyen basit bir iş akışını sağlar ve proteinlerin hücre endoglikozidazları veya arıtılmış proteinleri3 'ü (Şekil 2) bağlamasını tespit etmek için uygundur. Yöntem, etiket içermeyen8,46 veya karmaşık biyolojik örneklerden IP veya PI bağlama proteinlerini tanımlamak için amino asit etiketli nicel Kütle Spektrometrisi47 ile birleştiğinde kullanılabilir. Bu nedenle, bu yöntem birkaç Yöntemler hücresel proteinleri ile IPS veya etkileşimi incelemek için kullanılabilir bir alternatiftir ve bu metabolitlerin tripanosomlar ve belki de diğer Ökaryotlar düzenleyici işlevini anlamada yardımcı olacaktır.

<table><tbody><tr><td>Aseton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650501</td><td>Keton</td></tr><tr><td>Asetonitril</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004</td><td>Çözücü&nbsp;</td></tr><tr><td>Amonyum bikarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6141</td><td>İnorganik tuz</td></tr><tr><td>Santrifüjü Avanti J6-MI</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J6-MI</td><td>Büyük hacimler için santrifüj (örn., 1L)</td></tr> <tr><td>Santrifüj şişeleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1408</td><td>1L kültür Kontrol Boncuklarının santrifüjlenmesi için şişeler</td></tr><tr><td></td><td>Echelon</td><td>P-B000-1ml</td><td>Afinite kromatografi reaktifi - kontrol</td></tr><tr><td>D-(+)-Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Şeker, Hücreleri canlı tutmak için PBS'ye eklenir</td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1610610</td><td>İndirgeyici ajan</td></tr><tr><td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>65305</td><td>Biyotin ligandlarına bağlanmak için Streptavidin boncukları</td></tr><tr><td>EDTA içermeyen Proteaz İnhibitörü</td><td>Kokteyli Roche</td><td>11836170001</td><td>Proteaz inhibitörleri</td></tr><tr><td>Elektroforez çalışan tampon</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td>25 mM Tris, 192 mM glisin, %0.1 SDS, pH 8.3</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL Konik Santrifüj Tüpleri</td><td>Corning Yaşam Bilimleri</td><td>430052</td><td>10 mL kültürleri santrifüjlemek için</td></tr><tr><td>Formik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>106526</td><td>Asit</td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td>Amino asit</td></tr><tr><td>HMI-9 hücre kültürü ortamı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ME110145P1</td><td>T. brucei kan dolaşımı formları</td></tr> <tr><td>için hücre kültürü ortamıImperial Protein Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>24615</td> SDS/PAGE Ins(1,4,5)<td>P3'te protein tespiti için Coomassie boyama</td></tr><tr><td>Boncuklar</td><td>Echelon</td><td>Q-B0145-1ml</td><td>Afinite kromatografi reaktifi&nbsp;</td></tr><tr><td>Anında&nbsp; Yağsız&nbsp; Kuru&nbsp; Milk</td><td>Thomas Scientific</td><td>C837M64</td><td>Western blotting için bloke edici reaktif</td></tr><tr><td>İyodoasetamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6125</td><td>Sistein proteinleri veya peptitler için alkilleyici reaktif</td></tr><tr><td>Lab&nbsp; Rotator</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159Z92</td><td>Bağlanma tahlilleri için</td></tr><tr><td>LoBind Mikrosantrifüj Tüpleri</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-698-793</td><td>Kütle spektrometresi için düşük proteinli bağlayıcı tüpler</td></tr><tr><td>Nonidet&nbsp; P-40 (Igepal CA-630)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>21-3277</td><td>Deterjan</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010031</td><td>Fizyolojik tampon</td></tr><tr><td>kemilüminesans için peroksidaz substratı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>32106</td><td>Proteinlerin Western bloting tespiti için substrat</td></tr><tr><td>PhosSTOP Fosfataz İnhibitörü Kokteyl Tabletleri</td><td>Roche</td><td>4906845001</td><td>Fosfataz inhibitörler</td></tr><tr><td>PI (3) P PIP Boncuk</td><td>Echelon</td><td>P-B003a-1ml</td><td>Afinite kromatografi reaktifi &nbsp;</td></tr><tr><td>PI (3,4) P2 PIP Boncuk</td><td>Kademesi</td><td>P-B034a-1ml</td><td>Afinite kromatografi reaktifi&nbsp;</td></tr><tr><td>PI(3,4,5)P3 diC8</td><td>Echelon</td><td>P-3908-1mg</td><td>Afinite kromatografi reaktifi&nbsp;</td></tr><tr><td>PI (3,4,5) P3 PIP Boncuk</td><td>Echelon</td><td>P-B345a-1ml</td><td>Afinite kromatografi reaktifi &nbsp;</td></tr><tr><td>PI(3,5)P2 PIP Boncuk</td><td>Echelon</td><td>P-B035a-1ml</td><td>Afinite kromatografi reaktifi&nbsp;</td></tr><tr><td>PI (4) P PIP Boncuk Kademesi</td><td></td><td>P-B004a-1ml</td><td>Afinite kromatografi reaktifi&nbsp;</td></tr><tr><td>PI(4,5)P2 diC8</td><td>Echelon</td><td>P-4508-1mg</td><td>Afinite kromatografi reaktifi&nbsp;</td></tr><tr><td>PI(4,5)P2 PIP Boncuk</td><td>Echelon</td><td>P-B045a-1ml</td><td>Afinite kromatografi reaktifi&nbsp;</td></tr><tr><td>PI (5) P PIP Boncuk</td><td>Kademesi</td><td>P-B005a-1ml</td><td>Afinite kromatografi reaktifi&nbsp;</td></tr><tr><td>Ponceau S çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7170</td><td>Protein boyama (%5 asetik asit içinde %0,1 [a/h])</td></tr><tr><td>Potasyum hekzasiyanoferrat(III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>702587</td><td>Potasyum tuzu&nbsp;</td></tr><tr><td>PtdIns PIP Boncuk</td><td>Echelon</td><td>P-B001-1ml</td><td>Afinite kromatografi reaktifi&nbsp;</td></tr><tr>Batı lekeleme için <td>PVDF Membran</td><td>Bio-Rad</td><td>1620177</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Soğutmalı santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5910 R</td><td>Küçük hacimler için mikrosantrifüj (örn., 1.5 mL)</td></tr> <tr><td>Sodyum dodesil sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>862010</td><td>Deterjan</td></tr><tr><td>Sodyum tiyosülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72049</td><td>Kimyasal&nbsp;</td></tr><tr><td>SpeedVac Vakum Konsantratörleri</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SPD120-115</td><td>Numune konsantrasyonu (örn. kütle spektrometresi için)</td></tr> <tr><td>Hücre kültürü için T175 şişeleri&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>159910</td><td>50 mL T. brucei kültür yetiştirmek için</td></tr><tr><td>Tripsin, Kütle Spektrometresi Sınıf</td><td>Promega</td><td>V5280</td><td>Protein sindirimi için</td></tr><tr><td>tripsin Üre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td>Denatüre edici reaktif</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-418</td><td>Reaksiyonları karıştırmak için</td></tr><tr><td>Western blotting transfer tamponu</td><td>Bio-Rad</td><td>1610734</td><td>25 mM Tris, 192 mM glisin,% 20 metanol ile pH 8.3</td></tr><tr><td>Whatman&nbsp; Wester transferi için 3 mm kağıt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA3030861</td><td>Kağıdı</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol (14.2 M)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710</td><td>İndirgeyici ajan</td></tr><tr><td>2x Laemmli Numune Tamponu</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td>Protein yükleme tamponu</td></tr><tr><td>4&ndash; %20 Mini-PROTEAN&nbsp; Protein elektroforezi için TGX Prekast Protein Jelleri</td><td>Bio-Rad</td><td>4561094</td><td>Jel</td></tr><tr><td>4x Laemmli Numune Tamponu</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0747</td><td>Protein yükleme tamponu</td></tr></tbody></table>

inositol fosfat veya phosphoinositide etkileşim proteinleri yakınlık kromatografi batı blot veya kütle spektrometresi ile bağlantılı olarak tanımlanması

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

İnositol Fosfatlar ve fosfoinositidler, gen ifadesi, vezikül kaçakçılığı, sinyal iletimi, metabolizma ve gelişim dahil olmak üzere Ökaryotlar içinde çeşitli hücresel süreçleri düzenler. Bu metabolitler proteinlere bağlayarak, böylece protein konformasyonu, katalitik aktivite ve/veya etkileşimleri değiştirerek bu düzenleyici aktivite gerçekleştirin. Burada açıklanan yöntem, Inositol fosfatlar veya fosfoinositidler ile etkileşimde bulunan proteinleri belirlemek için kütle spektrometresi veya Batı blomlamaya bağlı benzeşme Kromatografi kullanır. İnositol fosfatlar veya fosfoinositidler kimyasal olarak biotin ile etiketlenmiştir, bu da agaroz veya manyetik boncuklar için conjuated streptavidin aracılığıyla yakalanan. Proteinlerin metabolite bağlanması onların yakınlık tarafından izole edilir, sonra elüe ve kütle spektrometresi ya da Batı lekeleme tarafından tanımlanır. Yöntem hassasiyet ile protein ve metabolit etkileşimi analizini destekleyen, hassas, radyoaktif olmayan, Liposome-ücretsiz ve özelleştirilebilir basit bir iş akışı vardır. Bu yaklaşım, kompleks biyolojik örneklerde veya arıtılmış proteinleri kullanarak protein-metabolit etkileşimlerini belirlemek için etiketsiz veya amino asit etiketli nicel kütle spektrometresi yöntemlerinde kullanılabilir. Bu protokol tripanosoma bruceiproteinleri analizi için optimize edilmiştir, ancak ilgili protozoon parazitleri, Maya veya memeliyen hücrelere adapte edilebilir.

RAP1 ve PI Analizi (3, 4, 5) yakınlık Kromatografi ve Batı lekesi ile P3 etkileşimi Bu örnek, RAP1 tarafından t. brucei lysate veya rekombinant t. brucei RAP1 proteini tarafından bağlama çözümlemek için bu yöntemin uygulama gösterilmektedir. Hemagglutinin (HA) ifade eden T. brucei kan akışı formları Lysates-RAP1 etiketli bağlayıcı olarak kullanıldı. RAP1 varyant yüzey glikoprotein transkripsiyonel kontrol dahil olan bir protein (VSG) genler3,</su...

Bu protokol, inositol fosfatlar veya fosfoinositidler bağlayan proteinlerin tanımlanması üzerinde duruluyor. Bu etanol veya manyetik boncuklar için streptavidin üzerinden immobilize olan biyotinlenmiş inositol fosfatlar veya fosfoinositidler ile benzeşme Kromatografi kullanır. Inositol fosfat veya fosfoinositide bağlayıcı proteinler Batı lekesi veya kütle spektrometresi ile tanımlanır.

Inositol fosfat veya Phosphoinositide etkileşim proteinleri yakınlık Kromatografi Batı Blot veya kütle spektrometresi ile bağlantılı olarak tanımlanması

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

İnositol fosfat ve fosfoinositititler ökaryotlarda gen ekspresyonu, protein ticareti, sinyal transdüksiyonu ve hücre gelişimi gibi çeşitli düzenleyici işlevlere sahip metabolitlerdir. Proteinlere bağlanarak bu düzenleyici işlevi yerine getirirler, bu nedenle protein konformasyonunu, katalitik aktiviteyi veya protein etkileşimlerini değiştirirler. İnositol fosfat veya fosfoinosititlere bağlanan proteinlerin tanımlanması, bu metabolitlerin düzenleyici işlevlerini nasıl yerine getirtiklerini anlamak için gereklidir.Bu protokol, hassas, radyoaktif olmayan, liposome ücretsiz basit bir iş akışı vardır ve ticari olarak kullanılabilir reaktifler kullanır. Bu yöntemde, biyotinylated inositol fosfat veya fosfoinositititler ile bitmiş bir kromatografi, etkileşimproteinleri izole etmek için kullanılır, daha sonra batı leke ile tanımlanır, veya kütle spektrometresi. Kan akımı formları için, HMI-9 medya orta günlük fazT T.brucei hücreleri büyümek, ile takviye 10%FBS, 37 derece Santigrat, ile 5%Karbondioksit.Hücre yoğunluğunu mililitre başına 800, 000 ve 1,6 milyon hücre arasında tutun. Hazır olduğunuzda, hücreleri 1600 kez G'de ve oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj edin. Supernatant atın ve yavaşça pbs-G önceden ısıtılan 10 mililetre hücreleri yıkamak için 37 santigrat derece de ısıtılan pelet yeniden askıya.Yıkamayı tamamlamak için hücreleri 1600 kez G ve oda sıcaklığında beş dakika santrifüj edin. Bu yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın. Sonra pbs-G bir mililitre pelet resuspend.Bu süspansiyonu bir nokta beş mililitrelik tüpe aktarın, sonra 1600 kez G'de beş dakika santrifüj edin. Supernatant atın, ve lysis tampon sıfır noktası beş mililitre pelet resuspend, bir nokta beş X proteaz inhibitör kokteyl ile takviye, ve hücreleri lyse buz üzerinde önceden soğutulmuş olan bir X fosfataz inhibitörü kokteyl. 1400 kez G ve 10 dakika boyunca dört santigrat derecede lysate santrifüj.Bu supernatant toplamak sonra, hangi çıkarılan parazit proteinleri içerir, bağlayıcı tahliller için yeni bir nokta beş mililitre tüp içine. Batı leke analizi için toplam lysate% 5 ayırın. Agarose boncuklar için konjuge inositol fosfatveya fosfoinositititler 50 mikrolitre toplamak ve bağlayıcı tampon 500 mililitre ekleyin.Bir dakika lığına 1000 kat G'de santrifüj. Supernatant atın ve boncukları dengelemek için bağlama tampon 50 mikrolitre resuspend. Konjuge olmayan boncukları kontrol etmek için kullanın ve spesifik olmayan etkileşimleri kontrol etmek için fosforilasyonsuz formlar da dahil olmak üzere farklı fosfat konfigürasyonlarına sahip boncuklar kullanın.Daha sonra, hücre lysate veya saflaştırılmış proteinler e 50 mikrolitre IP veya PI boncuk ekleyin. Boncuk hacmini toplam lysate%10 içinde tutun. Gerekirse, bağlama reaksiyonunun hacmini ayarlamak için bağlama arabelleği kullanın.50rpm dönerken, dört santigrat derece ya bir saat veya bir gecede için reaksiyon kuluçka. Bundan sonra, karışımı 1000 kez G'de santrifüj edin ve bir dakika boyunca dört derece santigrat derecede. Supernatant çıkarın ve pelet tutmak, batı leke analizi için supernatant% 5 tutmak için emin olun.Sonra yıkama tampon bir mililitre ekleyin ve dokunun veya reçin yeniden askıya almak için tüp girdap. Reaksiyonu 1000 kez G'de ve dört santigrat derecede bir dakika için santrifüj edin ve süpernatant'ı atın. Toplam beş yıkama için bu işlemi tekrarlayın.Bundan sonra, boncuklar için 710 milimolar 2-mercaptoetanol ile takviye 2X Laemmli tampon 50 mikrolitre ekleyin. Karıştırmak için dokunun veya girdap, ve proteinleri seyreltmek. Sonra, 95 derecede beş dakika ısı, ve bir dakika için 10,000 kez G santrifüj.Supernatant toplamak ve ya eksi 80 santigrat derece eluate dondurmak, ya da batı leke analizi devam edin. Burada sunulan yöntem, PI'lerin T.brucei lysate'den represör-aktivatör protein 1 veya rekombinant T.brucei repressor-aktivatör protein 1 proteini ile bağlanmasını analiz etmek için kullanılır. RAP1 kanonik PI bağlayıcı etki alanlarından yoksun olduğundan, bağlayıcı tahliller fosforile olmayan veya inositol halkasının farklı konumlarında fosforilasyon adedi olan pi'ler ve konjuge olmayan agarose boncuklarla gerçekleştirilir.Batı analizi RAP1'in tercihen PI(3, 4, 5)P3 boncuklara bağladığını, ancak aynı zamanda PI(4, 5)P2 boncuklarına daha az bağladığını göstermektedir. Ancak, başka bir veya agarose boncuk bağlamak vermedi. RAP1'in doğrudan PI'lere bağlanıp bağlanmadığını test etmek için, C ölümcül etiketli 6XHis rekombinant RAP1 proteini E.Coli'den homojenliğe doğru ifade edilir ve saflaştırılır.Batı lekeleme pi konsantrasyonu artan gösterir (3, 4, 5)P3, ama PI(4, 5)P2, PI (3, 4, 5)P3 boncuk ile rekombinant RAP1 etkileşimini inhibe. Reaksiyona T.brucei saflaştırılmış PIP5Pase enziminin eklenmesi pi(3, 4, 5)P3 bağlanmasını rekombinant RAP1 ile geri yükledi. Bunun nedeni serbest PI(3, 4, 5)P3'ün PIP5Pase defosforilasyondur ve bu nedenle bu metabolitin fosforilasyon paterninin RAP1 bağlamamız için gerekli olduğunu gösterir.İns'e bağlanan T.brucei proteinleri (1, 4, 5)P3 daha sonra kütle spektrometresi ile afinite kromatografisi ile tanımlanır. SDS-PAGE analizi, Ins(1, 4, 5)P3 boncuklarından elde edilen proteinlerdeki zenginleşmeyi, kontrol agarose boncuklarından elde edilen proteinlere kıyasla göstermektedir. Eluted proteinlerin kütle spektrometresi analizi 250'den fazla protein tespit edilmiştir ve bunların 84'ü Ins(1, 4, 5)P3 boncuklarla zenginleştirilmiştir.İns(1, 4, 5)P3'e bağlı proteinlerin zenginleşmesi, kontrol boncuklarıyla karşılaştırıldığında, SDS-PAGE tarafından saptanan protein sinyali ile ilişkilidir. Bu protokoldeki kritik bir adım, belirli olmayan etkileşimlerden belirli bir ayrım yapmak için uygun denetimlerin kullanılmasıdır. Konjuge olmayan agarose boncuklar ve inositol fosfat veya fosfoinosititlerle konjuge boncuklar kullanarak fosforilasyonsuz formlar da dahil olmak üzere çeşitli fosfat konfigürasyonları kullanmanızı öneririz.Bu yöntem, Trypanosoma cruzi, leishmania veya plazmodyum gibi diğer tek hücreli protozoon parazitlerine uygulanabilir. Ayrıca kolayca maya veya memeli hücreleri de dahil olmak üzere diğer organizmalar, adapte edilebilir. Bu yöntem, inositol fosfat veya fosfoinosid ile proteinlerin dinamik etkileşimlerini belirlemek için SILAC gibi kantitatif kütle spektrometresi ile birleşebilir.Ayrıca subsellüler fraksiyonu ile kombine edilebilir, Bu metabolitlere bağlamak organel özgü proteinleri tanımlamak için. Bu yaklaşım, T.brucei, memeli hücreleri ve mayainin inositol fosfat ve fosfoinositititlerine bağlanan proteinlerin belirlenmesine yardımcı olmuştur. Fosfoinosititides'e bağlanan yeni protein alan adlarının belirlenmesine yardımcı oldu.Bu metabolitlerin düzenleyici işlevini, gen ekspresyonundaki rollerini, hücre gelişimini ve ökaryotlarda sinyal iletimini anlamanın yolunu açmıştır. Bu protokoldeki bazı reaktifler zehirli veya yanıcıdır. Kişisel koruyucu ekipman kullanın ve gerektiğinde, bir duman başlık içinde çalışmak.

identification-inositol-phosphate-or-phosphoinositide-interacting

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

İnositol pyrophosphates kanser, diyabet ve obezitenin insan patolojilerin önemli bir rol oynar; ancak, etki mekanizması tam bir anlaşmazlık meselesidir. Piyasada bulunan inositol pyrophosphates eksikliği detaylı çalışmalar sorunlu vermektedir. Burada inositol pyrophosphates miligram üretmek ve izole etmek için basit bir protokol.

Kalite İnositol Pyrophosphates hazırlanması

Fosfoinosititler nispi bolluk hızlıca, çeşitli uyarılara cevap olarak değişen lipidleri işaret ediyor. Bu makalede, ekstre etme ve Deaçillendirme ardından 3 H, miyo -inositol ile metabolik etiketlenmesi hücreleri tarafından fosfoinositidlerde bolluğunu ölçmek için bir yöntem tarif edilir. Çıkarılan glisero-inositides daha sonra yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile ayrılmıştır ve akış sintilasyon ile nicelendirilir.

Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi-birleştiğinde Akış Parıldama tarafından Radyoetiketleme ve Fosfoinosititler Hücresel Düzeylerinin Quantification

PI (4,5) P2 çeşitli hücresel fonksiyonlarını düzenler, ancak hücre plazma zarı kendi nano örgütü tam olarak anlaşılamamıştır. Etiketleme PI pleckstrin homoloji alanı ile kaynaşmış bir çift renkli flüoresan sonda ile (4,5) P2, biz nanometre ölçeğinde (4,5) p plazma membranında 2 dağılımını PI incelemek için yeni bir yaklaşım tarif .

Roman Floresan Probları Plazma Membran Fosfatidilinositol 4,5-bisfosfatın tek molekül Süper çözünürlüklü görüntüleme

Burada, pH modülasyonuna dayalı etiketsiz bir yöntem kullanarak protein-fosfoinositid etkileşimlerini incelemek için bir mikroakışkan platform bağlamında desteklenen bir lipid çift katmanı sunmaktayız.

PIP-on-a-chip: Protein-fosfoinositid Etkileşimlerinin Etiketsiz Bir Çalışması

Etiket, zenginleştirmek ve protein kinaz CK2 hücre lysate veya doku homogenate gibi karmaşık bir biyolojik örnekten yüzeylerde belirlemek için bu iletişim kuralını hedefidir. Bu yöntem CK2 Biyoloji benzersiz özelliklerini bu amaç için kaldıraç görevi yapar.

Kimliği roman CK2 kinaz yüzeylerde çok yönlü bir biyokimyasal yaklaşım kullanarak

Biz güçlü biyokimyasal yaklaşımlar kullanarak yeni bir kinaz protein karakterize: farklı hücre hatları ve dokularda adanmış spesifik antikor ile Batı Blot analizi, coimmunoprecipitation deneyler ile etkileşimler, Batı tarafından tespit kinaz aktivite Fosho spesifik antikor ve γ [32P] ATP etiketleme kullanarak Blot.

Yeni kinaz proteinin sağlam biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak moleküler düzeyde karakterize edilmesi

Açıklanan ilgi ve etiket-free kütle spektrometresi belirli bir protein in immünafinite zenginleştirme kullanarak bir nükleer hücre altı fraksiyonu protein etkileşim ortakları tanımlamak için bir proteomik iş akışıdır. İş akışı hücre altı fraksiyonu, immünoprepitasyon, filtre destekli numune hazırlama, çevrimdışı temizleme, kütle spektrometresi ve aşağı akım biyoinformatik boru hattını içerir.

Büyük Ölçekli Nükleer Etkileşimom Profilleme için Etiketsiz İmmünoprekütle Spektrometresi İş Akışı

Burada bitkilerdeki inositol polifosfatları tespit etmek ve ölçmek için son derece hassas bir yöntem olan[3H]-myo-inositol etiketli fidelerin güçlü aniyon değişimi yüksek performanslı sıvı kromatografisini tanımlıyoruz.

SAX-HPLC kullanılarak Farklı Bitki Türlerinden Çözünür, Radiolabeled Inositol Polifosfatların Ekstraksiyonu ve Niceliği

Memeli hücre ekstraktlarından inositol pirofosfatların mutlak kantitasyonu için kılcal elektroforez elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometrisi için bir prosedür tanımlanmıştır.

İnositol Pirofosfatların Kapiler Elektroforez Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometrisi ile Mutlak Kantitasyonu

Mevcut protokol, geliştirilmiş bir tek moleküllü pull-down (SiMPull) testi kullanarak protein fosforilasyonunu ölçmek için numune hazırlama ve veri analizini açıklamaktadır.

Protein Fosforilasyonunun Miktarının Belirlenmesi için Optimize Edilmiş Tek Moleküllü Bir Pull-Down Testi

Burada, endojen fosfoprotein fosfatazların ve bunların hücre ve dokulardan etkileşen proteinlerinin zenginleştirilmesi ve kütle spektrometrisine dayalı proteomiklerle tanımlanması ve nicelleştirilmesi için bir protokol sunuyoruz.

Fosfoprotein fosfatazları ve bunların interaktörlerini tanımlamak için kütle spektrometrisine dayalı bir yaklaşım

Keşfedin inositol fosfat veya fosfoinositid ile etkileşen proteinleri yakınlık kromatografi, Western blot ve kütle spektrometrisi kullanarak tanımlama yöntemini. Bu hassas ve radyoaktif olmayan protokol, hücre biyolojisi ve biyokimya araştırmalarında metabolit düzenleyici fonksiyonlarını anlamak için kullanılır.

Inositol fosfat veya Phosphoinositide etkileşim proteinleri yakınlık Kromatografi Batı Blot veya kütle spektrometresi ile bağlantılı olarak tanımlanması (Video) | JoVE Journal

Inositol fosfat veya Phosphoinositide etkileşim proteinleri yakınlık Kromatografi Batı Blot veya kütle spektrometresi ile bağlantılı olarak tanımlanması

Daha fazla video keşfet