Name: Rekombinant Drosophila , lipid karıştırıcılar Için lipozomlar halinde deterjan destekli yeniden yapılanma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Keşfedin Drosophila atlastin proteininin lipozomlara deterjan destekli yeniden yapılandırılması ve FRET tabanlı lipid karıştırma ölçümü. Bu yöntem membran füzyon proteinlerinin fonksiyonlarını in vivo ortamda etkili şekilde çalışmaya olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Michael Stern ve laboratuvarına, atlastin ile ilgili projelerdeki görüşleri ve geribildirimlerine teşekkür ederiz. Bu çalışma ulusal genel Tıp Bilimleri Enstitüsü [R01GM101377] ve nörolojik bozukluklar ve Inme Ulusal Enstitüsü tarafından destekleniyordu [R01NS102676].

1. GST-DAtl-His8 arıtma
<ol><li>
Protein ifadesi ve lysate hazırlığı
	<ol>
<li>BL21 (DE3) E. coli 'yi PGEX4-T32 ' de GST-Datl-His8 yapısı ile dönüştürün ve bir ampikilin plakasını seçin.</li>
		<li>14 mL 'Lik bir kültür tüpünde 5 mL LB + ampisilin (5 μL 100 mg/mL ampisilin) olarak tek bir transformant seçin ve 6-8 h için 200 rpm 'de sallayarak 25 °C ' de inkük et. Not: Sızdırmaz ifade nedeniyle, yüksek sıcaklıklarda inkübe etmek tavsiye edilmez. 25 °C ' de büyüme, bu büyüme döneminde protein toplamayı azaltır.</li>
		<li>5 mL kültürden 1 mL 'Lik LB + ampisilin 200 mL 'yi ınoculate ve 25 °C ' de gecede (~ 15 – 18 h) inkük edilir.</li>
		<li>Ertesi sabah, santrifüjleme ile hücreleri hasat (2.000 x g 10 dk) ve pelletini içinde 5 ml lb.</li>
		<li>Inoculate 4 L LB + ampisilin ve ölçüm OD600 (0.05 – 0.15). Titreyerek 25 °C ' de inküye. Not: Bakteri eklemeden önce OD600 ölçümleri için boş olarak hizmet vermek için bazı medya rezerv.</li>
		<li>Ölçüm OD600 her saat 0.4 – 0.5 arasında bir od ulaşır kadar. Bu noktada, sıcaklığı 16 °C ' ye azaltın.</li>
		<li>0,2 mM ıPTG (800 μL 1 M stokta) ile birlikte, 10 dakika sonra kuluçkörü 16 °C ' ye ulaşır. Bir gecede (~ 15 – 18 saat) 16 °C ' de inküytir. Not: Düşük sıcaklık atlastin toplama azaltarak fonksiyonel protein verimi artırır.</li>
		<li>Ertesi sabah, 4 °C ' de 7.500 x g santrifügleme ile hücreleri hasat.</li>
		<li>200 mL A200 (25 mM HEPES (pH 7,4) ve 200 mM KCl) hücrelerinde yeniden resuspend.</li>
		<li>11.000 x g 'de hücreleri 4 °c ' de 5 dakika santrifüjler.</li>
		<li>(A200 artı 10% gliserol, 2 mm 2-mercaptoethanol, 4% Triton X-100 (TX100), 40mm imidazol ve bir EDTA-ücretsiz proteaz inhibitörü kokteyl tablet) kırma tampon 40 ml Pelet resuspend. Not: Baloncuklar ve köpük üretme önlemek için resuspending sonra TX-100 ekleyin.</li>
		<li>Bir 18 G iğne üzerinden geçmek ve üç kez bir hücre bozucu üzerinden hücreleri çalıştırmak ~ 10.000 psi.</li>
		<li>1 saat için 125.000 x g 'de özü Santrifüjü. Not: İsteğe bağlı olarak pelet 1:2 (w:v) 8 M Urea ve oda sıcaklığında gecede nutate çözülür. Bir denaturant olarak Urea SDS-PAGE analizi için yavaşça çözünebilir peletli protein çözünür. SDS-PAGE ve Coomassie leke analizi için 1 μL tasarruf edin.</li>
		<li>Bakteri ve büyük bakteriyel enkaz kaldırmak için 0,45 μm selüloz nitrat steril membran filtre aracılığıyla ekstresi filtre. Not: Isteğe bağlı olarak, SDS PAGE ve Coomassie leke analizi için 1 μL kaydedin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Benzerliği kromatografi ile protein arıtma
	<ol>
<li>Süzülmüş lysate, ni2 +ile şarj edilmiş immobilize metal benzeşimi Kromatografi (IMAC) reçine sütun üzerine yükleyin, düşük imidazol tampon ile önceden equilibrated (A100 artı 10% gliserol, 2 mm 2-mercaptoetanol, 1% TX-100, 40 mm imidazol) bir hızda 1 ml/ min 4 °C ' de.</li>
		<li>Sütunu 25 mL A100 artı% 10 gliserol, 2 mM 2-mercaptoetanol, 0,1% Anapoe X-100, 40 mM imidazol ile 4 °C ' de 1 mL/dak hızında yıkayın. 40 mM 'den 500 mM 'ye kadar imidazol 30 mL doğrusal gradyan ile proteini elute ve 500 mM 'de son 5 mL yıkama.</li>
		<li>Havuz birlikte zirve fraksiyonları ve 1 h 4 °C ' de şişmiş GSH-Agarose boncuk ile, daha önce suda şişmiş ve% 10 gliserol, 2 mM 2-mercaptoethanol, 0,1% Anapoe X-100 ve 1 mM EDTA ile A100 içinde dengelenmiş. Not: GSH-Agarose boncuklar önceki gün 50 mL su içinde şişebilir ve 4 °C ' de veya RT 'de 1 h 'de bir gecede inküte edilir. Su ve dengeleme tamponunu kaldırmak için, 500 x g 'de 1 dakika frensiz olarak sallanan kova rotorunda santrifüjler. 26 G iğne ile süpernatant aspirate.</li>
		<li>Pellet GSH-agarose boncuk 500 x g frensiz bir sallanan kova rotor santrifüjleme ve 26 g iğne ile aspirasyon ile lysate süpernatant çıkarın.</li>
		<li>Boncukları 10 mL polyprep sütununa aktarın ve 5 mL Dengeleme tamponu ile beş kez yıkayın (A100% 10 gliserol, 2 mM 2-mercaptoetanol, 0,1% Anapoe X-100 ve 1 mM EDTA), 500 X g 'de santrifüpleme yaparak .
</li>
		<li>10 mm azaltılmış glutatyon ile takviyalı 1 – 1,5 ml dengelemesinden tampon ile protein elute. Sıvı nitrojen içinde aliquot elüe protein ve flaş dondurulması. Protein-80 °C ' de süresiz olarak depolanabilir. Not: 7,4 için elüsyon tampon pH ayarlayın.</li>
		<li>Amonye siyah protein assay tarafından protein konsantrasyonu ölçmek9 ve SDS-sayfa ve Coomassie boyama tarafından saflık değerlendirmek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. rekombinant Atlastin lipozomlar içine reanayasası
<ol><li>Ekstrüzyon yöntemiyle Liposome üretim 10 ' dan fazla<ol>
<li>Kloroform (10 mM toplam lipid) lipid karışımı stokları olun. Gerekli lipidler 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glisero-3-fosfokolin (POPC), 1, 2-dioleoyl-sn-glisey-3-phospho-L-serine (DOPS), 1, 2-dioleoyl-sn-glisey-3-fosfoetolidin-N-(7-Nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il) (NBD-DPPE), ve 1, 2- Dipalmitoyl-sn-gliserol-3-fosfoetolin-N-(lissamine rodamin B sülfonil) (RH-dppe). Acceptor lipozomlar POPC oluşur: DOPS (85:15 molar oranı) ve POPC donör lipozomlar: DOPS: RH-PE: NBD-PE (83:15:1.5:1.5 molar oranı). Not: POPC: DOPS lipid karışımları geleneksel olarak in vitro lipid karıştırma işlemleri için kullanılırken, alternatif lipid bileşimleri farklı Deneysel amaçlar için uyarlanabilir. POPC: DOPS lipozomlar çok kararlı ve sigortalı zor, bu nedenle füzyon için çok sıkı bir sistemdir.</li>
		<li>1 Μcı/mL L-α-Dipalmitoyl-Fosfatidilkolin (Kolin metil-3H) lipid karışımlarına, daha sonraki adımlarla sıvı scintilasyon sayımı ile lipid konsantrasyonlarını belirlemek için ekleyin. Bu stokta en az 8 μL rezerve et.</li>
		<li>İstenilen miktarda lipid karışımları, çakmaktaşı cam tüplere aktarın.</li>
		<li>Daha fazla kloroform görülene kadar N2 gazının yumuşak bir akışı altında lipid karışımların kuru.</li>
		<li>30 dakika vakumlama ile bir kurutucu içinde daha fazla lipid filmi kuru.</li>
		<li>Yeterli sulu A100 ekleyin 10% gliserol, 2 mM 2-mercaptoetanol, ve 1 mM EDTA lipid film ve 10 mM konsantrasyon geri getirmek. Oda sıcaklığında 15 dakika hafifçe vortekslenir tarafından lipid filmi resuspend. Flint cam tüpler barındırabilir bir vorteks tavsiye edilir.</li>
		<li>Sıvı azot on kez nemlendirici lipidler dondurmak-çözüyor. Sıvı nitrojen içinde dondurulduktan sonra, solüsyonun 30 s için oda sıcaklığında oturmasına izin vererek lipozomları çözün, daha sonra daha hızlı çözme için suya aktarın. Bu donma-çözülme bisiklet çok amellar veziküller en aza indirir. Dikkat: Onlar 0,5 mL 'den büyük birimler içeriyorsa ve doğrudan suya sıvı azot formu aktarıldığında tüpler çatlak olabilir.</li>
		<li>Mini Extruder kullanarak 100 Nm gözenek boyutu 19 kez Polikarbonat filtreleri ile lipid geçirin.</li>
		<li>Skintilasyon sayımı ile lipozomların toplam lipid konsantrasyonu belirlenmesi Not: Bazı lipid cam tüpler ve mini-Extruder geride bırakılabilir.<ol>
<li>3 mL scintilasyon kokteylinde 4 μL lipid stokları ve lipozomlar ekleyin.</li>
			<li>Stok ve lipozomlar için dakika başına ortalama sayar (CPMA) ölçün. Ve aşağıdaki formül ile lipozomlar konsantrasyonu hesaplayın:<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59867/59867equ01.jpg">
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Lipozomları 4 °C ' de bir haftaya kadar saklayın. Lipozomlar zaman ile toplu olabilir olarak daha uzun depolama tavsiye edilmez, reanayasa verimlilikleri azalan.</li>
	</ol></li>
	<li>Önceden biçimlendirilmiş lipozomlar içine deterjan destekli kuruluş ile Reconstitution
	<ol>
<li>Birlikte karıştırılacak tampon, protein, lipozomlar ve ekstra deterjan miktarını hesaplayın:<ol>
<li>İstenen toplam hacmi belirleyin. Bu hacim, 10% gliserol, 2 mM 2-mercaptoetanol ve 1 mM EDTA ile A100 tampon oluşur. 250 μL 'den küçük birimler 0,5 mL mikrosantrifüj tüplerde iyi karışmaz.</li>
			<li>Yaklaşık 1 mM son lipid konsantrasyonu vermek için gerekli lipozomların hacmini hesaplayın. Birim arabellek biriminden çıkarın.</li>
			<li>İstenen protein lipid molar oranı (genellikle 1:400) vermek için gerekli protein hacmini hesaplayın. Arabellek hacmini buna göre azaltın.</li>
			<li>0.64 – 0.8 arasında etkili bir deterjan için lipid oranı (Reff) hedefleyen lipozomları doyurmak için ne kadar ekstra deterjan eklenmesi gerektiğini belirleyin. Protein ile eklenen deterjan düşünün unutmayın. (Reff <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59867/59867equ02.jpg"> ) denklem ile belirlenir dToplam toplam deterjan konsantrasyonu ve dsu MONOMERIK deterjan konsantrasyonu (0,18 mm TX-100 ve anapoe X-100 deterjan varlığında)4, 11' den itibaren.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Çözümleri birlikte bir 0,5 mL tüpte aşağıdaki sırada karıştırın: tampon, deterjan, protein ve lipozomlar. Hızla lipozomlar ekleyin ve karışımı homojenize 5 s için hemen girdap.</li>
		<li>4 °C ' de 1 h için bir çatlak içinde reaksiyonu kuluçsa.</li>
		<li>Su içinde 0,2 g/ml apolar polistiren adsorban boncuk "bulamaç" olun. Not: Adım 2.2.3 yılında önceki 1 h inkübasyon sırasında polistiren adsorban boncuk "bulamaç" olun.</li>
		<li>Polistiren adsorban boncuk 0,2 g tartmak ve bir mikrosantrifüj tüp transfer.</li>
		<li>Tüp ve karışımı 1 dk için metanol 1 mL ekleyerek boncuklar Degas. gaz edilmiş boncuk batırılır.</li>
		<li>Metanol aspirate ve boncuk su ekleyin. Boncuk 5 dakika su ile karıştırın, sonra su Aspire edelim. Dört kez tekrarlayın, sonra su ile 1 ml hacmine polistiren adsorban boncuk "bulamaç" getirmek ve 0,2 g/ml son konsantrasyon. Not: Boncuklar hala tüpün altına yerleşmeli. Yoksa, tekrar Degas. Boncuk metanol ve su Aspire için 21 G veya daha yüksek iğne kullanın.</li>
		<li>Her numunenin tüm deterjan absorbe etmek için gerekli polistiren adsorban boncuk miktarını hesaplayın. 1 gr polistiren adsorban boncuklar 70 mg TX-100 emer. Her reaksiyon için gerekli polistiren adsorban boncuk Bulamaç hacmi hesaplamak için, reaksiyonda toplam deterjan Böl (adım 2.2.1.4) tarafından 70 mg, ve sonra boncuk Bulamaç konsantrasyonu (0,2 g/ml (adım 2.2.7).</li>
		<li>Transfer hesaplanan miktarı polistiren adsorban boncuk Bulamaç için bir 0,5 ml tüp ve Aspire su. Not: Boncukları aktarmak için 20 – 200 μL ucunun sonunu kesip, boruyu pipetleme işleminden hemen önce yerleştirerek yerleşmiş boncuklar yeniden pelletini.</li>
		<li>Örnekleri eklemek 0,5 ml tüp polistiren adsorban boncuklar içeren ve örnek nutating için 1 h 4 °c ' de kuluçkmak.</li>
		<li>Tekrar iki kez eski boncuk geride bırakarak ve taze boncuklar için örnek transfer tekrarlayın.</li>
		<li>Numuneyi taze boncuklarla dördüncü bir tüpe ekleyin ve gece (~ 15 – 18 saat) 4 °C ' de inküye yapın.</li>
	</ol></li>
	<li>Sabah, 4 °c ' de 16.000 x g 'de 10 dakika santrifüpleme yapılarak polystyren adsorban boncuk ve Pelet çözünmez protein topaklardan numuneyi çıkarın.</li>
	<li>Süpernatant kurtarmak ve sıvı scintıtma sayma ile son lipid konsantrasyonu belirlemek (adım 2.1.9.2 bakın). İsteğe bağlı olarak, protein konsantrasyonu, siyah protein assay tarafından belirlenebilir9. Not: Proteoliposomes atlastin için, enzimatik asdalar taze lipozomlar ile yapılmalıdır. 4 °C ' de uzun depolama veya donma, atlastin aktivitesinde önemli bir kaybına yol açar.</li>
</ol>3. lipid karıştırma Assays
<ol><li>% 10 gliserol, 2 mM β-mercaptoetanol, 1 mM EDTA ve 5 mM MgCl2ile her biri A100 'de 0,15 mm konsantrasyonuna donör ve alıcı proteoliposomları getirin. Her reaksiyon (50 μL) floresans okumaları için uygun düz beyaz 96 iyi plaka bir kuyu eklenmesi gerekir. Bir triplicate ve No-GTP negatif kontrol dahil olmak üzere en az 4 reaksiyonlar hazırlayın.</li>
	<li>Plakayı 37 °C ' de önceden ısıtılmış bir plaka okuyucuya yerleştirin. Ölçüm NBD floresans (Excitation 460 nm ve emisyon 535 Nm) için 5 dk her dk.</li>
	<li>5 mM GTP (5 μL 50 mM GTP) ekleyerek füzyon yaratın.</li>
	<li>1 saat için her dakika NBD floresans ölçmek.</li>
	<li>Proteoliposomları çözmek ve maksimum NBD floresans ölçmek için 5 μL 2,5% w/v n-Dodecyl β-D-maltoside ekleyin. NBD floresans her dakika 15 dakika okuyun.</li>
</ol>4. ıohexol diskontinü gradyan12 Liposome floatation
<ol><li>isteğe bağlı 13. floatasyon ile reanayasanın verimliliğini analiz edin.</li>
	<li>10% gliserol, 2 mM 2-mercaptoetanol ve 1 mM EDTA ile A100 'de% 80 ve% 30 w/v iohexol hazırlayın. Iohexol kolayca çözülür, bu yüzden bu gece 4 °C ' de nutating bir gün önce hazırlanmalıdır.</li>
	<li>80% iohexol ile 150 μL proteoliposomes numunesi ile 150 μL 'i iyice karıştırın ve% 40 iohexol 'e getirin. Bu Ekle 5 x 41 mm2 Ultra-Clear tüp kaçınarak kabarcıklar.</li>
	<li>Layer 250 μL% 30 iohexol stok yavaşça numunenin üstünde bir orta tabaka yapmak için. Herhangi bir kabarcıklar kaçının ve alt katman rahatsız. Orta tabakanın üst kısmında, 2 mM 2-mercaptoetanol ve 1 mM EDTA ile yavaşça 50 μL A100 ekleyin.</li>
	<li>220.000 x g 'de 4 °c ' de yavaş ivme ve mola olmadan sallanan kova rotorunda gradyan Santrifüjü.</li>
	<li>Gradyan katmanları hasat ve SDS-PAGE ve Coomassie leke tarafından analiz, ölçüme densitometri tarafından yapılabilir. Reconstituted protein üst katmana yüzer, protein ve lipid agregaları alt veya Orta katmanda tortu olacak iken.</li>
</ol>5. Trombin proteolizi ile yeniden şekillendirilmiş proteinin oryantasyonu Analizi
Not: Burada bildirilen atlastin yapısı, N-terminal GST etiketinin sonu ve atlastin başlangıcı arasında bir Trombin kesim sitesi vardır. Doğru yönde atlastin bu kesim sitesi proteaz erişilebilir olacak, yanlış yönde protein lipid bilayer tarafından korunacaktır iken.
<ol><li>Proteoliposome oryantasyon atlastin tahlil için, en az 8 μL taze reconstituted proteoliposomes rezerv.</li>
	<li>8 μL proteoliposomes ve 1 μL 1 U/μL Trombin ekleyin. 37 °C ' de 1 saat boyunca inküye yapın.</li>
	<li>1 μL 5 mg/mL EDTA-ücretsiz proteaz inhibitörü kokteyli ile proteaz giderin ve 37 °C ' de 30 dakika boyunca inküye yapın.</li>
	<li>SDS-PAGE ve Coomassie lekesi ile numuneyi analiz edin. Kırpılmış ve uncleaved protein oranı densitometri ile belirlenebilir.</li>
</ol>

<ol><li>Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanics of membrane fusion.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 15, 675-683 (2008).</li>
<li>Orso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homotypic+fusion+of+ER+membranes+requires+the+dynamin-like+GTPase+Atlastin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin.</a> Nature. 460, 978-983 (2009).</li>
<li>McNew, J. A., Sondermann, H., Lee, T., Stern, M., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP-dependent+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">GTP-dependent membrane fusion.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 529-550 (2013).</li>
<li>Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%3A+application+to+energy-transducing+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1231, 223-246 (1995).</li>
<li>Düzgüneş, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Assays+for+Liposome+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Assays for Liposome Fusion.</a> Methods in Enzymology. 372, 260-274 (2003).</li>
<li>Wilschut, J., Duzgunes, N., Fraley, R., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+mechanism+of+membrane+fusion%3A+kinetics+of+calcium+ion+induced+fusion+of+phosphatidylserine+vesicles+followed+by+a+new+assay+for+mixing+of+aqueous+vesicle+contents%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Studies on the mechanism of membrane fusion: kinetics of calcium ion induced fusion of phosphatidylserine vesicles followed by a new assay for mixing of aqueous vesicle contents.</a> Biochemistry. 19, 6011-6021 (1980).</li>
<li>Ellens, H., Bentz, J., Szoka, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton-+and+calcium-induced+fusion+and+destabilization+of+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Proton- and calcium-induced fusion and destabilization of liposomes.</a> Biochemistry. 24, 3099-3106 (1985).</li>
<li>Meers, P., Ali, S., Erukulla, R., Janoff, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+inner+monolayer+fusion+assays+reveal+differential+monolayer+mixing+associated+with+cation-dependent+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Novel inner monolayer fusion assays reveal differential monolayer mixing associated with cation-dependent membrane fusion.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1467, 277-243 (2000).</li>
<li>Schaffner, W., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+sensitive%2C+and+specific+method+for+the+determination+of+protein+in+dilute+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution.</a> Analytical Biochemistry. 56, 502-514 (1973).</li>
<li>MacDonald, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-volume+extrusion+apparatus+for+preparation+of+large%2C+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).</li>
<li>Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+membrane+protein+insertion+into+liposomes+during+reconstitution+procedures+involving+the+use+of+detergents.+1.+Solubilization+of+large+unilamellar+liposomes+%28prepared+by+reverse-phase+evaporation%29+by+Triton+X-100%2C+octyl+glucoside%2C+and+sodium+cholate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate.</a> Biochemistry. 27, 2668-2677 (1988).</li>
<li>Scott, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+Fusion+Assay+to+Monitor+Intracellular+Membrane+Fusion+Machines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines.</a> Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+an+orthomyxovirus+matrix+protein+reveals+mechanisms+for+self-polymerization+and+membrane+association%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association.</a> PNAS. 114, 8550-8555 (2017).</li>
<li>Parlati, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+fusion+of+phospholipid+vesicles+by+the+%CE%B1-helical+core+of+a+SNARE+complex+in+the+absence+of+an+N-terminal+regulatory+domain%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the α-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain.</a> PNAS. 96, 12565-12570 (1999).</li>
<li>Sugiura, S., Mima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+lipid+composition+is+vital+for+homotypic+ER+membrane+fusion+mediated+by+the+dynamin-related+GTPase+Sey1p%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p.</a> Scientific Reports. 6, 20407(2016).</li>
<li>Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+tubular+endoplasmic+reticulum+network+with+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components.</a> Nature. 543, 257-260 (2017).</li>
<li>Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+atlastin+membrane+anchor+forms+an+intramembrane+hairpin+that+does+not+span+the+phospholipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer.</a> Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Buradaki Yöntemler, rekombinant atlastin 'in füzyon aktivitesini arındırmak, reconstituting ve ölçmek için verimli bir yöntem tarif ederler. Bazı kritik adımlarla fonksiyonel atlastin yüksek verim sağlamak için dikkate alınmalıdır. Atlastin ifadesi, toplama işleminden kaçınmak için düşük sıcaklıklarda (16 °C) yapılmalıdır ve bir adet 0.4 – 1.5 mg/mL arasında son bir konsantrasyon hedeflemelisiniz. Çok seyreltilmiş protein bir 1:400 protein lipid oranı en iyi şekilde reconstituted olmayacaktır. Reanayasa verimliliği, bura...

Membran füzyon birçok biyolojik reaksiyonda kritik bir süreçtir. Biyolojik koşullarda, membran füzyon spontan değildir ve bu tür reaksiyonlar katalizleştirmek için özel füzyon proteinleri gerektirir1. ER homotipik membran füzyon, Dynamin ile ilgili GTPase atlastin2' ye göre hayvanlarda aracılık edilir. Homotipik füzyon atlastin rolü periferik er üç yönlü kavşak için temel, hücre boyunca uzatmak tübüllerin büyük bir bağlantılı ağ oluşturmaktadır. Atlastins, büyük bir GTPase, üç sarmal paket orta etki alanı, hidrofobik membran çapa ve kısa sitoplazmik C-Terminal kuyruğu3' ten oluşan bir korunması alan morfolojisine sahiptir. İn vitro çalışmalar rekombinant Drosophila atlastin ile lipozomlar için reconstituted, onun fusogenic özelliklerini korur göstermiştir. İnsan homologlar da dahil olmak üzere diğer atlastins, Fusion in vitro reapitulate mümkün olmamıştır. Biz burada bir GST ve poli-histidin etiketli rekombinant Drosophila atlastin arındırmak için bir metodoloji tarif, lipozomlar için reconstituting, ve füzyon iddia.
Membran füzyon içinde vitro eğitim fusogenik proteinler genellikle bir membran çapa sahip olarak bir meydan okuma sunar. Onları incelemek için, onları model lipid bilayers içine yeniden oluşturmak için gereklidir. Büyük unilamellar veziküller (LUV) lipid protein etkileşimlerini incelemek için yararlı bir araçtır. Biz burada bir sistem protein reanayasası ve füzyon assays için farklı lipid bileşimleri LUVs yapmak için sunuyoruz. Integral proteinlerin luvs içine yeniden oluşturulması da dahil olmak üzere çeşitli yöntemlerle elde edilebilir, organik solvent aracılı reanayasa, mekanik mekanizmalar, veya deterjan destekli sulandırma4. Biz burada bir yöntem sunuyoruz Drosophila atlastin ön biçimlendirilmiş lipozomlar içine deterjan kaldırma. Bu reanayasa yönteminin avantajları yüksek reanayasa verimi ve lipid bilayer içinde atlastin uygun oryantasyonu içerir. Ayrıca, bu yöntem sayesinde, protein kurutulmaz veya organik çözücülere maruz kalmaktadır, böylece yapı ve fonksiyon sürdürüyor. Dezavantajları arasında, deterjanların varlığı tüm proteinler için ideal olmayabilir ve son proteoliposomların lipid bilayer içinde bazı entegre deterjan olabilir. Daha fazla diyaliz daha fazla deterjan ortadan kaldırmak için kullanılabilir. Ancak diyaliz uzun sürebilir ve bu nedenle protein aktivitesinin kaybına neden olabilir.
Atlastin 'in füzyon aktivitesinin değerlendirilmesi, daha önce açıklandığı gibi lipid karıştırma kavramında belirlenir2. Burada, biz N-(7-nitrobenz-2-Oxa-1, 3-diazol-4-il (NBD)/Lissamine Rhodamine-B sülfonil (Rhodamine) etiketli lipidler yoluyla atlastin aracılı füzyon ölçmek için bir yöntem betimlemek. Bu tahlil donör (etiketli) proteoliposomes ve Acceptor (etiketlenmemiş) proteoliposomes füzyon gerektirir. Bir donörün seyreltmesi olarak reaksiyon sırasında bir FRET sürümü ölçülebilir – membran füzyon sırasında lipid karıştırma sonucunda "etiketli" lipozomlar "etiketlenmemiş" liderecede ' den alıcı çifti (Şekil 1)5. Bu tahlil membran füzyon için bir vekil olarak hizmet ederken, membran füzyon ve hemifüzyon arasında ayırt sınırlıdır, bir devlet nerede sadece dış broşürler karışımı. Bu sorunu gidermek için, alternatif olarak NBD 'nin dithionite tarafından dış broşür giderici olduğunu. NBD/Rhodamine lipid karıştırma gibi aynı metodoloji takip, dış broşürün füzyon tarafından herhangi bir NBD FRET serbest Quenching üzerine iç broşür karıştırma8nedeniyle olacaktır.
Alternatif füzyon iç sulu içerik karıştırma adresi tam füzyon sadece5tarafından görülmektedir. Bu örnekler Terbiyum (TB)/dipicolinik asit (DPA) deneyleri ve aminonaphthalene trisulfonik asit (karıncalar)/p-Xylene bis (pyridinium) bromür (DPX) deneyleri. TB/DPA 'da, kapsüllenmiş TB olan lipozomlar havuzu karışık ve kapsüllü DPA ile lipozomlar ile kaynaşıyor; Füzyon üzerine, floresans [TB (DPA)3]3- şelasyon kompleksi6içinde DPA 'dan TB 'ye dahili enerji aktarımı ile artar. Buna karşılık, ANTS/DPX için, ANTS floresans DPX7tarafından söndürülün. Bu sistemler iç içeriği karıştırırken, lipozomların daha derinlemesine hazırlanması, kapsüllenmeyen reaktiflerin kaldırılması ve fluorophorlerin istenmeyen etkileşimi için gereklidir.

<table><tbody><tr><td>10 mL poli-prep kromatografi kolonları</td><td>Biored</td><td>731-1550</td><td></td></tr><tr><td>10 mm x 75 mm Çakmaktaşı cam tüpler</td><td>VWR</td><td>608225-402</td><td></td></tr><tr><td>47 mm çap, 0,45 & mu; M gözenekli Whatman steril membran filtreleri</td><td>Whatman</td><td>7141 104</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyu beyaz plaka</td><td>NUNC</td><td>437796</td><td></td></tr><tr><td>Anapoe X-100</td><td>Anatrace</td><td>9002-931-1</td><td></td></tr><tr><td>Hücre bozucu</td><td>Avestin</td><td>Avestin Emulsiflex C3</td><td></td></tr><tr><td>DOPS (1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfo-L-serin (sodyum tuzu))</td><td>Avanti</td><td>840035P-10mg</td><td>DOPS</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Araştırma organikleri a.ş.</td><td>6381-92-6</td><td>Etilendiamintetraasetik asit</td></tr><tr><td>EDTA içermeyen proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Komple proteaz inhibitörü</td></tr><tr><td>Ekstruder</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z373400&nbsp;</td><td>Liposofast Temel Ekstruder</td></tr><tr><td>GE Akta Prime sıvı kromatografi sistemi</td><td>GE Pharmacia</td><td>8149-30-0006</td><td></td></tr><tr><td>Glutatyon agaroz boncukları</td><td>Sigma aldrich</td><td>G4510-50ml</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>EMD</td><td>GX0185-5</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>36051-31-7</td><td>Guanozin 5 'trifosfat sodyum tuzu hidrat</td></tr><tr><td>HEPES, asitsiz</td><td>Omnipur</td><td>5330</td><td></td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>fluka</td><td>5670</td><td></td></tr><tr><td>İmmobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) reçine sütunu</td><td>GE Healthcare</td><td>17040801</td><td>1 mL HiTrap Şelatlama HP immobilize metal afinite kromatografi kolonları</td></tr><tr><td>Iohexol</td><td>Doğru kimyasal ve bilimsel şirket</td><td>AN 7050 BLK</td><td>Accudenz/Nycodenz</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Araştırma ürünleri uluslararası corp.</td><td>I56000-100.0</td><td>IPTG, dioksan içermeyen</td></tr><tr><td>L-Glutatyon azaltılmış</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251-5g</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Fisher</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Omnisolv</td><td>MX0488-1</td><td></td></tr><tr><td>NBD-DPPE (1,2-dipalmitoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-(7-nitro-2-1,3-benzoksadiazol-4-il) (amonyum tuzu))Avanti</td><td></td> <td>236495</td><td>NBD-DPPE</td></tr><tr><td>n-Dodesil ve beta;-D-maltoside</td><td>Chem-Impex International</td><td>21950</td><td></td></tr><tr><td>Polar olmayan polistiren adsorban boncuklar</td><td>BioRad</td><td>152-3920</td><td>SM2 Biobeads</td></tr><tr><td>Nüklepore iz-aşındırma polikarbonat 19 mm 0.1 & mu; m gözenek zarı</td><td>Whatman</td><td>800309</td><td></td></tr><tr><td>Optima LE80K Ultra santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfatidilkolin, L-&alfa;-dipalmitoil [kolin metil-3H]</td><td>ARC</td><td>ART0284</td><td>Titriasyonlu lipitler</td></tr><tr><td>Plaka okuyucu</td><td>TECAN</td><td>TECAN sonsuz M200 plaka okuyucu</td><td></td></tr><tr><td>POPC (1-palmitoil-2-oleoil-glisero-3-fosfokolin)</td><td>Avanti</td><td>850457C-25mg</td><td>POPC</td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>MP</td><td>151944</td><td></td></tr><tr><td>Rh-DPPE (1,2-dipalmitoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-(lissamin, rodamin B sülfonil) (amonyum tuzu))</td><td>Avanti</td><td>236495</td><td>Rh-DPPE</td></tr><tr><td>Sintilasyon Kokteyli</td><td>Ulusal Teşhis</td><td>LS-272</td><td>Ecoscint XR Sulu veya susuz numuneler için sintilasyon çözeltisi</td></tr><tr><td>Parıldama şişeler</td><td>Beckman</td><td>592928</td><td>Hızlı dönüş kapağı Mini Poly-Q Flakon</td></tr><tr><td>Trombin</td><td>Sigma</td><td>T1063-1kU</td><td>İnsan plazmasından trombin</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Ultra şeffaf santrifüj tüpleri 5 mm x 41 mm</td><td>Beckman</td><td>344090</td><td></td></tr><tr><td>Vorteks 9 ila 13 mm Tüp Tutucu</td><td>VWR</td><td>58816-138</td><td>Çakmaktaşı cam tüpleri</td></tr> <tr><td>girdaplamak için uçVorteks Ekleme Tutucu</td><td>VWR</td><td>58816-132</td><td>Vorteks tüp tutucusu için gerekli</td></tr><tr><td>tutucu Vortexer</td><td>VWR</td><td>2.235074</td><td>Vortex Genie 2 modeli G560</td></tr> <tr><td>ve beta; -merkaptoetanol moleküler biyoloji sınıfı</td><td>Calbiochem</td><td>444203</td><td></td></tr></tbody></table>

rekombinant drosophila , lipid karıştırıcılar için lipozomlar halinde deterjan destekli yeniden yapılanma

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Membran füzyon ökaryotik hücrede önemli bir süreçtir. Özel proteinler füzyon katalizörler için gereklidir. Atlastins, er 'in homottifik füzyon içinde bulunan endoplazmik retikulum (er) yerleşik proteinleridir. Biz detay burada bir glutatyon S-transferase (GST) ve Poly-histidin temizleyerek için bir yöntem benzeşme Kromatografi iki tur tarafından Drosophila atlastin etiketlenmiş. Füzyon reaksiyonları içinde vitro eğitim, lipid bilayer içine yerleştirilmek üzere arıtılmış füzyon proteinlerini gerektirir. Lipozomlar ideal model membranlara sahiptir, lipid bileşimi ve boyutu ayarlanabilir. Bu amaçla, biz önceden biçimlendirilmiş lipozomlar içine Drosophila atlastin için deterjan kaldırma ile bir reanayasa yöntemi açıklanmaktadır. Çeşitli reanayasa yöntemleri mevcut iken, deterjan kaldırma ile reanayasası atlastins ve diğer benzer proteinler için uygun hale getirmek çeşitli avantajları vardır. Bu yöntemin avantajı, reconstituted proteinin yüksek reanayasa verimi ve doğru yönünü içerir. Bu yöntem diğer membran proteinleri ve proteoliposomes gerektiren diğer uygulamalar için uzatılabilir. Ayrıca, membran füzyon ölçümü olarak kullanılan proteoliposomların bir FRET bazlı lipid karıştırma tahlili açıklanmaktadır.

Atlastin reanayasasının verimliliği Şekil 2' de sunulmuştur. Reconstituted proteoliposomes bir ıohexol kesintisiz gradyan içinde süzülmüştü. Unıncorporated protein alt katmanda (B) veya Orta katmanda (M) posalı oldu. Reconstituted protein üst katmanda (T) yüzer. Gradyan örnekleri, SDS-PAGE ve Coomassie boyama tarafından hasat edilmiş ve analiz edilmiştir. Jelin densitometri ile ölçülmesi, ihmal edilebilir kaybeder ile reanayasanın çok yüksek bir verimliliğini gösterir; Toplam proteinin% 96 '...

Biyolojik membran füzyon özel füzyon proteinleri tarafından katalizlenmiş. Proteinlerin fusogenik özelliklerinin ölçülmesi lipid karıştırma özellikleri ile elde edilebilir. Biz rekombinant Drosophila atlastin arındırılması için bir yöntem sunuyoruz, ER homotypic füzyon aracılık bir protein, önceden biçimlendirilmiş lipozomlar için reconstituting, ve füzyon kapasitesi için test.

Rekombinant Drosophila , lipid karıştırıcılar Için lipozomlar halinde deterjan destekli yeniden yapılanma

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Burada ayrıntılı olarak yapılan yeniden yapılanma ve füzyon protokolü, bir model lipid çift katmanlı ve füzyon proteinleri tarafından lipid karıştırma membran bağlı proteinler çalışma için etkili bir yoldur. Burada rekombinant Drosophila atlastin bir deterjan destekli reconstitution tarif, bir ER füzyon proteini, önceden biçimlendirilmiş fosfatidilkolin lipozomlar içine. Atlastin proteolipozomlarının füzyonu fret tabanlı lipid karıştırma testi ile ölçülür.Deterjan destekli reconstitution önemli avantajlarından biri deterjan protein kurutma veya çözücüler maruz kalmamış olmasıdır. Ayrıca burada atlastinin yeniden yapılanma yöneliminin çok etkili olduğunu gösteriyoruz. FRET tabanlı lipid karıştırma testinin bir diğer avantajı da lipozomların herhangi bir boya ile yüklenmesi gerekmemesi ve ekstra çevirmeli adımlara gerek olmamasıdır.Bu prosedürü başlatmak için, metin protokolünde belirtildiği gibi, kloroform lipid karışımı stokları hazırlamak. Lipid karışımları DPPC mililitre başına bir mikrocurie ekleyin, Bu stok en az sekiz mikrolitre rezerv emin olun. İstenilen miktarda lipid karışımlarını çakmaktaşı cam tüplere aktarın.Daha sonra daha fazla kloroform görünür olana kadar yaklaşık 10 dakika boyunca azot gazı nazik bir akışı altında lipid karışımları kuru. Elde edilen lipid filmini 30 dakika vakumlayarak kurutucu bir kurutucuda kurutun. Bundan sonra, yeterli A100 ekleyin 10%gliserol, iki milimolar 2-mercaptoetanol, ve bir milimolar EDTA lipid film geri konsantrasyon getirmek için 10 milimolar.Oda sıcaklığında 15 dakika hafifçe girdap yaparak lipid filmini yeniden askıya alın. Sıvı nitrojen de sulu lipidler dondurun. Lipozomları eritmek için, çözeltinin oda sıcaklığında 30 saniye oturmasına izin verin, daha hızlı erimeiçin suya geri aktarın.Bu donma-çözülme döngüsünü toplam 10 kez tekrarlayın. Bundan sonra, polikarbonat filtreler aracılığıyla lipidler geçmek için bir mini ekstrüzyon kullanın, bir gözenek boyutu ile 100 nanometre, 19 kez. Lipozomların toplam lipid konsantrasyonunu belirlemek için, üç mililitre sintilasyon kokteyline dört mikrolitre lipid stoğu ve lizozom ekleyin.Stok ve lipozomlar için dakika başına ortalama sayıları ölçün ve metin protokolünde belirtildiği gibi lipozom konsantrasyonu hesaplayın. Lipozomları bir haftaya kadar dört santigrat derecede saklayın. İlk olarak, metin protokolünde belirtildiği gibi, 0,5 mililitrelik bir tüpiçinde uygun miktarda tampon, ekstra deterjan ve proteini karıştırın.Hızla lipozomlar ekleyin ve karışımı homojenize etmek için beş saniye boyunca hemen girdap. Reaksiyonu bir saat boyunca dört santigrat derecede bir nutator'da kuluçkaya yatırın. Bu kuluçka sırasında, polistiren adsorbent boncuk 0,2 gram tartmak ve bir mikrosantrifüj tüp aktarın.Tüpe bir mililitre metanol ekleyin ve boncukları gazdan arındırmak için bir dakika karıştırın. Sonra, 21-gauge veya daha yüksek bir iğne ile metanol aspire. Boncukları yıkamaya başlamak için, onlara su ekleyin.Boncuklar beş dakika suyla karışSın, sonra suyu aspire edin. Bu su yıkama işlemini dört kez tekrarlayın. Bundan sonra, mililitre başına 0,2 gram son konsantrasyonile, bir mililitre hacmine polistiren adsorbent boncuk bulamaç getirmek için su ekleyin.Metin protokolünde belirtildiği gibi, her örnekteki tüm deterjanı adsorb etmek için gereken polistiren adsorbent boncuk miktarını hesaplayın. Boncuk bulamacı toplamak için bir pipet ucu kesin. Hesaplanan boncuk bulamacı miktarını 0,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve suyu aspire edin.Örnekleri boncukları içeren tüpe ekleyin ve bir saat boyunca dört santigrat derecede bir nutator da kuluçkaya yatırın. Örnekleri yeni boncuklar içeren yeni bir tüpe aktarın, eski boncukları geride bıraktığından emin olun. Aynı koşulları kullanarak tekrar kuluçkaya yatırın.Boncukları iki kez transfer etme ve kuluçkaya yatırma işlemini tekrarlayın. Bundan sonra, taze boncuk içeren yeni bir tüp için örnek aktarın ve dört santigrat derece bir gecede nutating tarafından kuluçka. Ertesi gün, çözünmez protein agregaları pelet 10 dakika boyunca 16, 000 kez g ve dört derece santigrat de boncuk ve santrifüj gelen örnek kaldırın.Supernatant kurtarmak ve metin protokolünde belirtildiği gibi, sıvı sintillation sayma ile son lipid konsantrasyonunu belirlemek. Başlamak için, gliserol içeren A100 her 0.15 milimolar konsantrasyona donör ve kabul proteolipozomları getirmek, beta-mercaptoetanol, EDTA, ve magnezyum klorür. Floresan okuma için uygun düz bir 96-iyi plaka bir kuyuya her reaksiyon transfer, bir triplicate ve no-GTP negatif kontrol de dahil olmak üzere en az dört reaksiyonlar hazırlamak için emin olun.Plakayı 37 derecede önceden ısıtılmış bir plaka okuyucusuna yerleştirin. NBD floresanını her dakika beş dakika ölçün. Sonra, füzyon ikna etmek için beş milimolar GTP ekleyin.NBD floresanını her dakika bir saat boyunca ölçün, öncekiyle aynı uyarma ve emisyonuyguluyor. Bundan sonra, proteolipozomları eritmek için kuyulara %2,5 n-Dodecyl beta-D-maltoside beş mikrolitre ekleyin ve aynı uyarma ve emisyon kullanarak 15 dakika boyunca her dakika maksimum NBD floresanını ölçün. Bu çalışmada rekombinant Drosophila atlastin saflaştırılır ve önceden oluşturulmuş lipozomlar haline getirilir.Atlastin reconstitution verimliliği bir iohexol kesintili gradyan yüzen repozolipozomlar tarafından belirlenir. Üst, orta ve alt degrade tabakalarının örnekleri hasat edilir ve SDS-PAGE ve Coomassie boyama ile analiz edilir. Jelin densitometri ile ölçülmesi, ihmal edilebilir kaybedilmelerle yeniden yapılanmanın çok yüksek bir verimini gösterir ve toplam proteinin %96'sı üst tabakada yüzen proteolipozomlar olarak bulunur.Proteinin %1'inden azı yeniden oluşturulmaz ve orta tabakada bulunur ve sadece %3'ü yeniden oluşturulmaz veya biraraya ve alt tabakaya tortulanır. Reconstitution sonrası atlastin in oryantasyonu trombin dekolte stoyonları ile ölçülür. Örnekler SDS-PAGE ve Coomassie boyama ile analiz edilir ve densitometri ile ölçülür.Yeniden yapılanan proteinlerin çoğu, sadece% 7 proteaz korunmaktadır, cleaved olduğunu. Kinetik ve atlastin aracılı proteolipozom füzyon ölçüde lipid karıştırma tahlilleri ile analiz edilir. Sıfır zaman noktasında GTP ile füzyona neden olmadan önce beş dakikalık bir kuluçka işlemi gerçekleştirilir.Bir saat sonra, n-Dodecyl beta-D-maltoside proteolipossomes solubilize ve maksimum floresan rezonans transferi sürümü almak eklendi. Koşuda füzyon maksimum maksimum maksimum floresan% 11 olarak görülmektedir. Lipidler kloroformda çözünür.Lipid karışımları hazırlarken, herhangi bir buharlaşma önlemek için, bir kimyasal başlık üzerinde, ve buz üzerinde, hızlı bir şekilde bunu yapmak için emin olun. Bir membran çapasının lipozom şekil ve boyut üzerindeki etkilerini görselleştirmek için atlastin proteolipozomlarını mikroskopi ile analiz etmek mümkündür. Bu yöntem, diğer membran bağlantılı proteinleri ve bir model lipid çift katmanlı nasıl nasıl bir şekilde çalışmak için genişletilmiştir.Bu protokol lipid karışımları ölçmek için titre lipidler kullanır. Radyoaktif maddelerle çalışırken gerekli önlemleri almayı unutmayın.

detergent-assisted-reconstitution-recombinant-drosophila-atlastin

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Lipid membranlar bir prototip voltaj kapılı potasyum kanalı tam sulandırılması için prosedürler açıklanmıştır. Sulandırılmış kanallar biyokimyasal testler, elektrik kayıtları, ligand ve tarama elektron kristalografik çalışmalar için uygundur. Bu yöntemler, başka zar proteinlerinin yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için genel uygulamalar olabilir.

Yapısal ve İşlevsel Araştırmalar için Lipid Membranlar bir Kv Kanal Sulandırma

Opsin ile sulandırılmış büyük unilameller lipozomlarda fosfolipid karıştırmayı ölçmek için floresan bazlı bir test tarif ediyoruz.

Fosfolipid Scramblase Aktivitesinin bir floresan bazlı analiz

Bu makale, lipid-proksimal bir ortamda çeşitli partner faktörlerle in vitro olarak integral membran proteinlerinin etkileşimlerini ve montajlarını değerlendirmek için bir yöntemi açıklamaktadır.

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için İn Vitro

Burada hedef lipid bilayers postfusion bilayer içine bu membran proteinlerinin deterjan ücretsiz teslim etmek için ile ultrafast protokollerinden membran proteinlerinin fusogenic proteoliposomes içine sulandırma ve böyle proteoliposomes füzyonu için mevcut. Bu yaklaşımlardan birleşimini karmaşık çok bileşenli Membran sistemleri hızlı ve kolayca kontrollü montaj sağlar.

Deterjan-Alerjik membran proteinlerinin Ultrafast sulandırma tamamlayıcı-Proteoliposomes ücret Fusogenic kullanarak Lipid Bilayers içine.

Biz bir protokol vitro için zihin ve benim kendi kendine organizasyon deneyleri desteklenen lipid bilayer açık bir odasında üzerinde sağlar. Ayrıca, biz tepki doğumdan tarafından vivo koşulları taklit için PDMS microcompartments lipid kaplı tahlil içine alın anlatan.

Vitro Sulandırma Protein kalıpları üzerinde desteklenen Lipid Bilayers kendi kendini düzenleme

Burada, tanımlanmış proteolipozomlarda tamamen saflaştırılmış bileşenlerle Msp1 ekstraksiyon aktivitesinin yeniden uzlaştırılması için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Msp1 Ayıklama Etkinliğinin Tamamen Saflaştırılmış Bileşenlerle Yeniden Uzlaştırılması

Bu makalede, kapsüllenmiş sitoiskelet proteinleri ile dev unilamellar veziküllerin hızlı üretimi için basit bir yöntem tanıtılmaktadır. Yöntemin, hapsetmede ve sitoiskelet-membran etkileşimlerinde sitoiskelet yapılarının aşağıdan yukarıya doğru resulaştırılmasında yararlı olduğu kanıtlanmıştır.

Yeniden Yapılandırılmış Hücre İskeletinin Dev Unilameller Veziküller İçinde Hızlı Kapsüllenmesi

Bu protokol, floresan mikroskobu kullanılarak yeniden oluşturulmuş, membrana bağlı sitoiskelet ağlarının dinamiklerini incelemek için desteklenen lipid çift katmanlarının oluşumunu ve hücre iskeleti filamentlerinin ve motor proteinlerin eklenmesini açıklar.

Membrana Bağlı Minimal Aktin Kortekslerinin Desteklenen Lipid Çift Katmanlı Üzerinde Yeniden Sulandırılması

Bu yazıda, F-aktin sitoiskeletini dev unilamellar lipid veziküllerine (lipozomlar olarak da adlandırılır) kapsüllemek için deneysel teknikleri ve lipozom zarının iç broşüründe korteks-biyomimik yapan bir F-aktin tabakası oluşturma yöntemini göstereceğiz.

İn Vitro Aktin Hücre İskeletinin Dev Unilameller Veziküller İçinde Yeniden Sulandırılması

Membran proteinlerinin yeniden yapılandırılması ve enzimlerin ve diğer suda çözünür bileşenlerin mikrometre altı ve mikrometre boyutundaki lipid veziküllerinde kapsüllenmesi için bir protokol sunuyoruz.

Nano ve Mikrometre Boyutlu Veziküllerde Denge Dışı Metabolik Ağların İnşası

Keşfedin Drosophila atlastin proteininin lipozomlara deterjan destekli yeniden yapılandırılması ve FRET tabanlı lipid karıştırma ölçümü. Bu yöntem membran füzyon proteinlerinin fonksiyonlarını in vivo ortamda etkili şekilde çalışmaya olanak tanır.

Rekombinant Drosophila , lipid karıştırıcılar Için lipozomlar halinde deterjan destekli yeniden yapılanma

Daha fazla video keşfet