Name: Salispheres veya Monolayers olarak In vitro büyüme için ınsan tükürük bezlerinden tükürük epitelyal hücrelerin yalıtım (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Keşfedin, insan tükürük bezinden salisfer veya monolayer olarak primer epitel hücreleri izolasyonu. Bu yöntem, viral çoğalma ve doku rejenerasyonu araştırmaları için in vivo benzeri modeller sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz birincil hücreler kültür için yer metodolojileri önemli rehberlik sağlamak için James P. Bridges teşekkür etmek istiyoruz. Matthew J. Beucler sağlık eğitim hibe T32-ES007250 Ulusal Enstitüleri tarafından destekleniyordu. Bu çalışma Ayrıca Ulusal Sağlık Bursları R01-AI121028 ve R21-DE026267 tarafından William E. Miller 'a verilir.

Bu protokoller ve çalışmalar Cincinnati Üniversitesi 'nde (Federal kapsamlı güvence #00003152, ıRB protokol 2016-4183) Kurumsal Inceleme Kurulu tarafından gözden geçirildi ve onaylanmıştır. Tükürük dokusu yaygın olarak birçok baş ve boyun cerrahi prosedürlerinde rezeke edilir ve genellikle malign süreç tarafından yer almaz. Genellikle, hasta (Şekil 1a) kaldırıldıktan sonra 2-4 h içinde taze rezeke tükürük bezi dokusu kullanılır.
1. reakajın hazırlanması
<ol><li>
Bronşiyal epitelyal hücre büyüme ortamı (BEGM)
	<ol>
<li>Üretici tarafından sağlanan Kitten bileşenler ekleyin ( malzeme tablosunabakın).</li>
		<li>Bileşenlerin tam transferini sağlamak için her tüpü temel medyadan bir kez yıkayın. Sonra% 4 serum son konsantrasyon yapmak için kömür aldı fetal Sığır serum ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kırmızı kan hücresi (RBC) liziz tamponu
	<ol>
<li>10X stok yapmak, eklemek 40,15 g NH4Cl, 5,0 g NaHCO3, ve 0,186 g ethylenediaminetetraasetic asit (EDTA) ve son hacmine kadar getirmek 200 ml kullanarak DH2O. Sonra filtre sterilize ve 4 °C ' de saklayın.</li>
		<li>Steril dH2O önce kullanım için 1 bir çalışma konsantrasyonu seyreltildi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dissociation çözüm
	<ol>
<li>Bir 100 ml şişe dispase çözüm için (bkz: malzeme tablosu) eklemek 0,15 g kolajenaz türü III. Kolajenaz tamamen çözülür sonra filtre sterilize yeni çözüm ve aliquot. -20 °C ' de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. doku sindirim
<ol><li>100 mm 'lik doku kültürü plakasını kullanarak, dokuyu, otoklav sterilize edilmiş Diseksiyon makas ve cerrahi forseps (Şekil 1B,C) kullanarak ince parçalara% ~ 1-2 mm 'lik bir boyutta yerleştirin. Parçaları arasında bağ dokusu doğru ayırma ve daha fazla adımda kolaylığı sağlamak için kesilmelidir.</li>
	<li>Kıyılmış dokuya dispase/collagenase çözeltisi 6 mL ekleyin. Sonra yaklaşık 30 dk 1 h için 37 °C ' de inkübe.</li>
	<li>5 mL serolojik pipet 15-20 kez pipetleme ile dokusu bozar.</li>
	<li>37 °C ' de 30 dakika ila 1 saat arasında inküye yapın.</li>
	<li>2,3 ve 2,4 iki-üç kez daha veya doku bir bulamaç benzer ve kolayca pipet açma (Şekil 1D) geçebilirsiniz adımları yineleyin. Not: Doku örneğinin başlangıç boyutu ve doku kıyma ne kadar hassas bir adım 2,3 ve 2,4 tekrarlamak için gereken kaç kez belirleyecektir. Tipik olarak, yaklaşık 1 cm x 1 cm boyutunda doku alırsınız. Ayrıca, bir standart ters doku kültürü mikroskop kullanarak doku ayrışma izleyebilirsiniz doku hücre dağılma ilerlemesini izlemek için. Küçük hücreler kümeleri salispheres olarak tükürük hücrelerinin ilk büyüme için idealdir.</li>
</ol>3. Bodrum membran matrisli kaplama kuyuları
Not: Bodrum membran matrisi (BMM), kullanılacak gün önce 4 °C ' de bir gecede çözülür. Çözülmüş bir kez, BMM sürekli buzda veya 4 °C ' de hızlı bir şekilde (yani, bir jel formu) sıcak sıcaklıklarda korunmalıdır. Ayrıca, örnekler soğuk numuneler BMM "eritmek" ve plastik çanak hücreleri açığa olacak gibi BMM kaplama önce buz üzerinde soğutulmuş olsaydı bakım alınmalıdır.
<ol><li>Yavaşça BMM pipet ( malzeme tablosunabakın) her iyi içine kaplanmış. BMM 'ye eşit ve yavaşça kuyu üzerinde dağıtın. Not: genellikle, altı-kuyu plakasının her bir kuyusu için 500 μL kullanıyoruz, ancak bu hacim 12-Well veya 24-Well gibi plakaların diğer varyantları için veya kalın veya daha ince Hidrojeller için istenilen şekilde ayarlanabilir.</li>
	<li>37 °C ' de kaplı plakaları, BMM 'nin yeniden katılaşma süresi için en az 15 dakika önce kullanın.</li>
</ol>4. sindirilmemiş doku, RBC lizis ve hücre kaplama filtreleme
<ol><li>Transfer doku homojenatı adım 2,5 için 15 ml konik tüp. Kalan hücreleri aktarmak için 6 mL Dulbecco fosfat tamponlu tuz (DPBS) ile bir kez yıkayın.</li>
	<li>Sindirilmemiş dokusu kaldırmak için bir 70 μm naylon kafes hücre süzgeci ile bir 50 mL konik tüp içine homojenlik filtre. Santrifüjler 500 x g'de 5 dakika boyunca gergin hücreler.</li>
	<li>1 adet çalışma çözeltisi yapmak için steril dH2O 'DA 10X RBC lizis tamponunu seyreltin.</li>
	<li>Süpernatant aspirate. Sonra 10 ml 1x RBC liziz tampon hücre Pelet pelletini. 37 °C ' de 5 dak.</li>
	<li>20-25 mL DPBS ekleme RBC liziz tamponu nötralize ve tükürük hücrelerinin liziz en aza indirmek için. 500 x g'de 5 dakika Santrifüjü. Not: RBC liziz tampon ile tedavi sonra, hücre peleti beyaz olmalıdır. Pelet kırmızı renk tüm RBC tamamen lysed olduğunu gösterir. Tüm RBC tam liziz için gerekirse 4,4 ile 4,5 arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>Süpernatant aspirate. İyi başına Begm 1-2 ml içinde Pelet resuspend sonra BMM kaplı kuyuları üzerine yer resuspended hücreler. 37 °C ' de Inküye yapın.</li>
	<li>Bir kez BMM üzerinde kaplama, hücreler küresel yapıları veya "salispheres" bir 2-3-gün dönemi boyunca oluşturur. Hücreler için salispheres olarak muhafaza edilebilir yaklaşık 5-7 gün önce BMM hücreleri erişmek ve plastik uymak ve bir monolayer olarak büyümek izin düşürmeye başlar.</li>
</ol>5. BMM üzerinde salispheres ve bakım subculturing
<ol><li>Kuyular medya aspirate, daha sonra 1 mL dispase/collagenase çözeltisi her iyi ekleyin ve ~ 15 dakika veya BMM çoğunlukla çözünmüş kadar 37 °C ' de inküye.</li>
	<li>Kalan hücreleri elde etmek için hücreleri bir kez DPBS ile 15 mL konik boruya aktarın ve kuyuları yıkayın. 500 x g'de 5 dakika Santrifüjü.</li>
	<li>Süpernatant aspirate. 2 ml tripsin içinde Pelet resuspend sonra 15 dakika için 37 °c ' de inkübe.</li>
	<li>% 10 serum içeren tüm ortamları kullanarak tripsin nötralize. 500 x g'de 5 dakika Santrifüjü.</li>
	<li>Süpernatant aspirate. Kalan medyayı, tripsin ve serumu kaldırmak için DPBS 'deki hücreleri yeniden resuspend. 500 x g'de 5 dakika Santrifüjü.</li>
	<li>Süpernatant aspirate. Resuspend BEGM ve plaka üzerine resuspended hücreler üzerine katılaştırılmış BMM kaplı kültür yemekleri. Resuspended hücreler de doğrudan hücre kültürü üzerine kaplı olabilir bir monolayer olarak proliferasyon için yemekler tedavi. Bir monolayer olarak tükürük hücrelerinin büyümesi ile ilgili daha fazla bilgi için Bölüm 6 ' ya bakın. BMM veya plastik üzerinde yetiştirilen hücreler her 2 – 3 günde bir taze BEGM ile beslenmelidir.</li>
	<li>% 5 CO2Ile 37 °c ' de tutulan nemlendirilmiş bir kuluçin hücrelerinin kültürü.</li>
</ol>6. tedavi plastik doku kültürü yemekleri üzerinde salispheres subculturing
Not: hücreleri plastik üzerinde bir tek tabakalı olarak koruyarak, bu adımda başlayın. Aşağıdaki protokol 100 mm 'lik bir çanak içinde büyüyen hücrelere uygulanır.
<ol><li>Medyayı aspirate. Kalan medyayı kaldırmak için DPBS ile bir kez yıkayın.</li>
	<li>2 mL tripsin ekleyin, ardından 37 °C ' de 15 dakika veya hücreler tamamen ayrılıncaya kadar inküye yapın.</li>
	<li>% 10 serum içeren herhangi bir komple medyanın 4 mL 'ini kullanarak tripsin nötralize edilmesi. Hücreleri 15 mL Konik Tüpe aktarın.</li>
	<li>Kalan hücreleri toplamak için yaklaşık 5 mL DPBS ile plakayı bir kez yıkayın. 500 x g'de 5 dakika Santrifüjü.</li>
	<li>Süpernatant aspirate. 6-10 mL DPBS içinde resuspend hücreler kalan medya kaldırmak için.</li>
	<li>500 x g'de 5 dakika Santrifüjü.</li>
	<li>Begm süpernatant ve pelletini aspirate. Tedavi plastik doku kültürü yemekleri üzerine plaka hücreleri. Her 2-3 gün taze BEGM ile yem.</li>
	<li>% 5 CO2Ile 37 °c ' de tutulan nemlendirilmiş bir kuluçin hücrelerinin kültürü.</li>
</ol>7. hücrelerin ağaloprezervasyon
Not: hücrelerin Cryopreservation, ya salisphere veya tek tabakalı yetiştirilen hücrelerden kaynaklanan tek bir hücre süspansiyondan gerçekleştirilebilir.
<ol><li>Mevcut hücrelerin toplam miktarını hesaplamak için bir hematokytometer üzerindeki hücreleri saymak.</li>
	<li>500 x g'de 5 dakika Santrifüjü.</li>
	<li>Süpernatant aspirate. % 10 dimetil sülfoxid (DMSO) ile Begm içinde Pelet resuspend. Hücreler konsantrasyonu 2 x 10 6 hücreler/ ml 10 x 106 hücreler/ml olmalıdır.</li>
	<li>Steril kriyojenik depolama tüpleri içine aliquot hücreleri. Tüpleri yalıtılmış bir köpük rafına yerleştirin ve hücreleri yavaşça dondurmak için-80 °C ' de bir gecede inküye yapın.</li>
	<li>Ertesi gün, uzun süreli depolama için sıvı nitrojen yerleştirin tüpler. Not: hücreler 37 °C ' de hızla çözülür. Çözülür üzerine, hücreler 500 x g ve DMSO-kaplama önce kaldırıldı medya içeren pelleted olmalıdır.</li>
</ol>

<ol><li>Kessler, A. T., Bhatt, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+the+Major+and+Minor+Salivary+Glands%2C+Part+1%3A+Anatomy%2C+Infectious%2C+and+Inflammatory+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Imaging+Science%22%5BJournal%5D)">Review of the Major and Minor Salivary Glands, Part 1: Anatomy, Infectious, and Inflammatory Processes.</a> Journal of Clinical Imaging Science. 8, 47(2018).</li>
<li>Holmberg, K. V., Hoffman, M. P. Anatomy, Biogenesis and Regeneration of Salivary Glands. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHolmberg%2C+KV+%22Monographs+in+Oral+Science%22">Monographs in Oral Science</a>. Ligtenberg, A. J. M., Veerman, E. C. I. 24, S. KARGER AG. 1-13 (2014).</li>
<li>Vissink, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+and+Treatment+of+the+Consequences+of+Head+and+Neck+Radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oral+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Prevention and Treatment of the Consequences of Head and Neck Radiotherapy.</a> Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 213-225 (2003).</li>
<li>Gualtierotti, R., Marzano, A., Spadari, F., Cugno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Main+Oral+Manifestations+in+Immune-Mediated+and+Inflammatory+Rheumatic+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Main Oral Manifestations in Immune-Mediated and Inflammatory Rheumatic Diseases.</a> Journal of Clinical Medicine. 8, 21(2018).</li>
<li>Tsukamoto, M., Suzuki, K., Takeuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten-year+observation+of+patients+with+primary+Sj%C3%B6gren%27s+syndrome%3A+Initial+presenting+characteristics+and+the+associated+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Rheumatology.+Dis%22%5BJournal%5D)">Ten-year observation of patients with primary Sjögren's syndrome: Initial presenting characteristics and the associated outcomes.</a> International Journal of Rheumatology. Dis. , (2018).</li>
<li>Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+xerostomia+in+patients+with+head+and+neck+cancer%3A+A+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: A literature review.</a> Cancer. 107, 2525-2534 (2006).</li>
<li>Morrison, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+primary+human+cell+model+for+the+study+of+human+cytomegalovirus+replication+and+spread+within+salivary+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Development of a primary human cell model for the study of human cytomegalovirus replication and spread within salivary epithelium.</a> Journal of Virology. , (2018).</li>
<li>Pomeroy, C., Englund, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomegalovirus%3A+epidemiology+and+infection+control%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Infection+Control%22%5BJournal%5D)">Cytomegalovirus: epidemiology and infection control.</a> American Journal of Infection Control. 15, 107-119 (1987).</li>
<li>Maimets, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+In+Vitro+Expansion+of+Salivary+Gland+Stem+Cells+Driven+by+Wnt+Signals%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-Term In Vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals.</a> Stem Cell Reports. 6, 150-162 (2016).</li>
<li>Varghese, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+gland+cell+aggregates+are+derived+from+self-organization+of+acinar+lineage+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Salivary gland cell aggregates are derived from self-organization of acinar lineage cells.</a> Archives of Oral Biology. 97, 122-130 (2019).</li>
<li>Maruyama, C., Monroe, M., Hunt, J., Buchmann, L., Baker, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+human+and+mouse+salivary+glands%3A+A+practice+guide+for+salivary+researchers%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">Comparing human and mouse salivary glands: A practice guide for salivary researchers.</a> Oral Diseases. , (2018).</li>
<li>Lin, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-contamination+of+the+human+salivary+gland+HSG+cell+line+with+HeLa+cells%3A+A+STR+analysis+study%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">Cross-contamination of the human salivary gland HSG cell line with HeLa cells: A STR analysis study.</a> Oral Diseases. 24, 1477-1483 (2018).</li>
<li>Tran, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Culture+of+Polarized+Human+Salivary+Epithelial+Cells+for+Use+in+Developing+an+Artificial+Salivary+Gland%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Primary Culture of Polarized Human Salivary Epithelial Cells for Use in Developing an Artificial Salivary Gland.</a> Tissue Engineering. 11, 172-181 (2005).</li>
<li>Pringle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Mouse+Salivary+Gland+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2011).</li>
<li>Nam, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Primary+Epithelial+Cells+Derived+from+Human+Salivary+Gland+Contributing+to+in+vivo+Formation+of+Acini-like+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+and+Cells%22%5BJournal%5D)">Characterization of Primary Epithelial Cells Derived from Human Salivary Gland Contributing to in vivo Formation of Acini-like Structures.</a> Molecules and Cells. 41, 515-522 (2018).</li>
<li>Vissink, A., Jansma, J., Spijkervet, F. K. L., Burlage, F. R., Coppes, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Sequelae+of+Head+and+Neck+Radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oral+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy.</a> Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 199-212 (2003).</li>
<li>Cannon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+measures+study+of+weekly+and+daily+cytomegalovirus+shedding+patterns+in+saliva+and+urine+of+healthy+cytomegalovirus-seropositive+children%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Repeated measures study of weekly and daily cytomegalovirus shedding patterns in saliva and urine of healthy cytomegalovirus-seropositive children.</a> BMC Infect. Dis. 14, (2014).</li>
<li>Pringle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Salivary+Gland+Stem+Cells+Functionally+Restore+Radiation+Damaged+Salivary+Glands%3A+Hyposalivation+Cell+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22STEM+CELLS%22%5BJournal%5D)">Human Salivary Gland Stem Cells Functionally Restore Radiation Damaged Salivary Glands: Hyposalivation Cell Therapy.</a> STEM CELLS. 34, 640-652 (2016).</li>
<li>Maria, O. M., Maria, O., Liu, Y., Komarova, S. V., Tran, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel+improves+functional+properties+of+human+submandibular+salivary+gland+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Matrigel improves functional properties of human submandibular salivary gland cell line.</a> International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43, 622-631 (2011).</li>
<li>Srinivasan, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Salivary+Human+Stem%2FProgenitor+Cells+Undergo+Microenvironment-Driven+Acinar-Like+Differentiation+in+Hyaluronate+Hydrogel+Culture%3A+Differentiation+of+Salivary+Stem%2FProgenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22STEM+CELLS+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture: Differentiation of Salivary Stem/Progenitor Cells.</a> STEM CELLS Translational Medicine. 6, 110-120 (2017).</li>
<li>Foraida, Z. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin-PLGA+hybrid+electrospun+nanofiber+scaffolds+for+salivary+epithelial+cell+self-organization+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Elastin-PLGA hybrid electrospun nanofiber scaffolds for salivary epithelial cell self-organization and polarization.</a> Acta Biomaterialia. 62, 116-127 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa etmek için hiçbir şey rapor.

Tükürük disfonksiyon, Sjögren sendromundan muzdarip olanlar için yaşam kalitesinin yanı sıra tükürük bezlerine bitişik kanserler için radyasyon terapisi3,4,5, 16 yaşında. Bu hastalar tedavi etmek için bir önerilen terapi fonksiyonel tükürük kök hücreleri veya organoids içinde vitro, daha sonra etkilenen doku9yerine hasarlı tükürük bezi içine eklenebilir büyümek etmektir...

Memelilerde, tükürük bezleri 3 çift büyük tükürük bezi halinde düzenlenmiştir: parotis, submandibular ve dil altı bezleri. Ayrıca dilde bulunan ve ağız boşluğu boyunca dağınık küçük bezleri bir dizi var1. Büyük bezleri üretilen tükürük toplu hacminin sorumludur2. Salgılanmış faktörler aracılığıyla antimikrobiyal koruma sağlamaya ek olarak, tükürük, özofagus2' den geçerken gıda çiğneme ve yağlama sürecinde önemlidir. Bu nedenle, tükürük bezi disfonksiyon yeterli tükürük üretmek mümkün olmayan hastalarında diş boşlukları veya oral kandidiyasis3gibi maladies gelişmekte daha eğilimli olduğu bir tıbbi sorunu temsil eder. Ayrıca, düşük tükürük sonuçları yaşam kalitesi üzerinde önemli bir etkiye sahip yemek ve sindirme daha fazla zorluk.
Tükürük bezi disfonksiyon öncelikle Sjögren sendromu muzdarip hastalarda bulunur, otoimmün bozukluk, ya da ışınlama terapisi geçirmiş olan baş ve boyun kanseri olan hastalarda3,4,5, 6' ya kadar. Otoimmünite veya radyasyon tedavisinin bir sonucu olarak bezler içinde hasarlı salgını acini kendi kendine yenilenmez, bu da geri dönüşümsüz hasar6ile yaşayan bir hasta ile sonuçlanır. Tükürük bezleri çalışma da dikkat veya viral patogenezi mekanizmaları ile ilgilenen araştırmacılar topladı. İnsan sitomegalovirüs (HCMV) gibi bazı patojenler, daha sonra tükürük7,8üzerinden yeni bir ana bilgisayara doğmakta olan virüsü iletimi için izin veren tükürük bezleri içinde ısrarla çoğaltır. Böylece, çeşitli tıbbi sorunları çözmek ve anlamak için tükürük bezi dokusunun sağlam ve tekrarlanabilir in vitro modellerini geliştirmek için karşılanmamış bir ihtiyaç vardır.
Murine tükürük bezi sisteminin birkaç modeli, tükürük bezlerini oluşturacak farklı epitelyal hücreleri anlamak ve karakterize etmek için bir başlangıç noktası olarak kullanılmıştır9,10. İnsan ve murine tükürük bezleri arasında açık ve önemli farklar var11. Fare submandibular ve parotis boyutu1,2,11çok benzer iken en önemlisi insan parotis bezi submandibular bezi ile ilgili olarak daha büyük. Ölümsüzleştirilmiş insan submandibular hücre hatları var iken, ölümsüzleştirilmiş hücrelerin doğru birincil doku ve ikincil endişeleri fenotipi korumak değil büyük endişeleri vardır ölümsüzleştirilmiş hücreler aslında türetilmemiş tükürük epitelin kendisi12. Bu nedenlerle bir ilgi ve insanlardan birincil tükürük dokusu çalışması için bir ihtiyaç vardır.
Burada, primer epitelyal hücreleri doku kültürü için insan tükürük bezlerinden yalıtmak için bir protokol açıklanmaktadır. Protokollerimiz Pringle ve al. ve Tran ve Al 'ın eserlerine dayanmaktadır. genellikle prosedürlerini kolaylaştırmak için yapılan değişikliklerle13,14. İlk olarak, Tran ve al. ' nin Protokolü, tükürük dokusunu enzikatik olarak sindirmek için uzun bir beş saatlik kuluçka çağrısı yaparken, modifiye protokolüm, Pringle ve Al 'da benzer şekilde bir saatlik kuluçka gibi az başarılı olmuştur. İkinci olarak, doku sindirimi için farklı enzimler kullanıyoruz, özellikle de orijinal Tran ve el protokolünde kullanılan tripsin kullanmayın, ancak bunun yerine dispaz ve collagenase karışımı kullanın. Biz yeni bir çalışma olarak ilk sindirim adımlarında tripsin önlemek için tercih düşük hücre viability tripsin sonuçları tarafından tükürük dokusunun ilk sindirim, muhtemelen nadir bir kök hücre nüfus kaybı tarafından önerilen15. Son olarak, biz kültür Bodrum membran matris (BMM) yüzeyinde salispheres aslen bronş epitelyal hücrelerin yayılması için formüle ticari olarak kullanılabilen bir medya kullanarak. Protokollerimiz, parotis, submandibular ve altdilde bezlerden gelen tükürük hücrelerini izole etmek için kullanılabilir. Bu hücreler, tükürük asiner epitelyal hücrelerine benzer bir fenotip bulundurduğunu gösteren tükürük amilaz ve diğer tükürük spesifik genlerini ifade ederler7. Bu metodolojisi kullanarak > 50 primer insan dokusu örneklerinden tükürük kültürlerini başarıyla üretiyoruz. Dahası, birincil tükürük hücreleri kolayca daha sonraki bir tarihte kullanılmak üzere kriokonservirovannogo olabilir.

<table><tbody><tr><td>100 mm kültür kapları</td><td>Thermo Scientific</td><td>172931</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konik tüpler</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konik tüpler</td><td>Thermo Scientific</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>Bronşiyal Epitel Hücre Büyüme Ortamı</td><td>Lonza</td><td>CC-3171</td><td>Üreticinin talimatlarına göre mermi kiti ekleyin. 20 mL kömürden sıyrılmış serum ile takviye edin.</td></tr><tr><td>Hücre süzgeci 70 & mikro; m naylon örgü</td><td>Fisher</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Kömür soyulmuş fetal sığır serumu</td><td>Gibco</td><td>12676-029</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz tip III</td><td>Worthington</td><td>LS004182</td><td>4 &� C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Kriyojenik Tüp</td><td>Fisher</td><td>5000-0020</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Hücre Uygulamaları</td><td>07923</td><td>%0.15 (a/a) stok yapmak için kollajenazı çözün. Süzün, sterilize edin ve ardından -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Diseksiyon makası</td><td>Fisher</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco fosfat tamponlu salin</td><td>Corning</td><td>55-031-PC</td><td></td></tr><tr><td>Genel Kimyasallar</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PathClear Bodrum membran özü</td><td>Cultrex</td><td>3432-005-01</td><td>4 °C'de çözün; Kullanmadan en az 24 saat önce C. Daima buz üzerinde tutun.</td></tr><tr><td>Altı kuyulu kültür yemekleri</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi forseps</td><td>Fisher</td><td>22-079-742</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA çözeltisi</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr></tbody></table>

salispheres veya monolayers olarak in vitro büyüme için ınsan tükürük bezlerinden tükürük epitelyal hücrelerin yalıtım

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

Tükürük bezleri insan hastalığının birden fazla yönü ile ilgilenen araştırmacılar için önemli bir ilgi alanı vardır. Araştırmacıların bir amacı, Radyasyon terapileri veya Sjögren sendromu ile ilişkili patolojiler nedeniyle hasar görmüş bezlerin fonksiyonunu geri yüklemek. Araştırmacıların ikinci hedefi, virüslerin glandüler doku içinde çoğaldığı mekanizmaları tanımlamaktır, böylece yatay iletim için önemli olan tükürük sıvılarına erişim sağlayabilirler. Bu hedefler yukarıda bahsedilen yanı sıra ilgili araştırma alanları ile ilgilenen araştırmacılar tarafından kullanılabilecek sağlam ve erişilebilir bir in vitro tükürük bezi modeli için ihtiyaç vurgulayın. Burada, epitelyal hücreleri insan tükürük bezlerinden yalıtmak ve onları in vitro yaymak için basit bir protokol tartışıyoruz. Protokollerimiz, bireysel çalışmaların ihtiyaçlarını karşılamak için daha da optimize edilebilir. Kısaca, tükürük dokusu mekanik ve enzince tek hücreleri veya hücrelerin küçük kümeleri yalıtmak için ayrılır. Epitelyal hücreler için seçim, epitelyal hücre büyümesini teşvik etmek için optimize edilmiş medyanın varlığında bir Bodrum membran matrisinin üzerine kaplamadan oluşur. Bu ortaya çıkan kültürler üç boyutlu kümeleri olarak muhafaza edilebilir, "salispheres" olarak adlandırılan, ya da tedavi plastik doku kültürü yemekleri bir tek tabakalı olarak büyüdü. Bu protokol, hücresel senescence yapmadan önce 5-8 pasajlar (15-20 nüfus doublings) için yayılabilir ağırlıklı olarak epitelyal hücrelerin heterojen bir nüfusun gelişmesinde sonuçlanır.

İki-üç gün sonra BMM üzerine sindirilmiş doku hücreleri kaplama, hücreler kolayca küme başına 15-20 hücre boyutuna kadar genişletmek için devam edecek küçük kümeleri oluşturacak (Şekil 2a). Hücresel enkaz ve müstakil ölü hücreler genellikle görülür ve taze medya ile duman çekiş ve yenileyici tarafından kaldırılması gerekir. Hücreler yaklaşık 3-10 gün boyunca salispheres olarak çoğalırlar devam edecektir, ya da sürece BMM tabaka bozulmamış kalır. Bazen, BMM kı...

Birincil insan tükürük bezi türevi epitelyal hücreleri izole etmek ve yetiştirmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu hücreler onları tükürük epitelyal orijinli olmak ile tutarlı gen ifade desenleri sergiler ve Engelbreth-Holm-Swarm tümör hücrelerinden türetilen Bodrum membran matrisleri üzerinde salispheres olarak veya tedavi kültür yemekleri monolayers olarak yetişebilir.

Salispheres veya Monolayers olarak In vitro büyüme için ınsan tükürük bezlerinden tükürük epitelyal hücrelerin yalıtım

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...

Birincil hücresel modeller veya organoid benzeri yapılar üretmek biyolojideki birçok güncel soruyu yanıtlamanın anahtarıdır. Örneğin, yatay iletim için önemli bir site olduğu gibi tükürük bezi çoğaltma kolaylaştırmak için insan virüsleri tarafından kullanılan mekanizmalar oldukça uzun bir süre ilgi oldum. Bu protokolde tanımlanan salya temelli sistemin gelişimi, bu tür sorulara cevap verme arayışımızda çok önemli bir ilerlemedir.Bu teknik bize farklı hasta örnekleri çeşitli birincil hücreleri oluşturmak için izin verir. Hücreler in vitro deneyler için yaygın olarak kullanılan birçok hücre tipi gibi modellenmiş veya dönüştürülmüş değil gibi hücresel modeller in vivo tipi durumu daha anımsatır. Bu protokolü fare nin birincil submandibular bezinden benzer hücreler üretmek için kullandık ve protokol benzer hücresel yapılara sahip diğer organlar için de yararlı olacaktır.Hastadan alındıktan sonra 2-4 saat içinde, bir kültür plakası üzerinde, otoklavlı sterildiksiyon makası ve cerrahi forceps kullanarak tükürük bezi dokusunu 1-2 milimetre büyüklüğünde ince parçalara ayırın. Kıyma doku dispase / Kollajenaz çözeltisi altı mililitre ekleyin. Sonra 37 derecede yaklaşık 30 dakika ile bir saat

isolation-salivary-epithelial-cells-from-human-salivary-glands-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Farenin tükürük bezi kök hücrelerin izolasyonu için optimize edilmiş bir protokol açıklanmıştır. Yöntemi, enzimatik ve mekanik sindirim istihdam ve hücrelerin kök hücre özelliklerini içeren salispheres izolasyonu izin verir.

Fare Tükürük Bezi Kök Hücre İzolasyonu

Insan derisi canlı yetişkin epitelyal kök hücreleri izole bir hızlı, sağlam bir şekilde açıklanmıştır. Bu yöntem cilt kollajen matriks enzimatik sindirim, saç folikülleri ve hücre kültürü için, tek bir hücre süspansiyonları ya da doku parçalarının izolasyonu koparma kullanır.

İnsan Cilt Yetişkin Epitel Kök Hücre İzolasyonu ve Kültür

Basit bir metodu ile ilişkili epitel hücreleri üzerindeki doku fibroblastlann etkileri analiz etmek için tarif edilmiştir. Bu yöntem, üç boyutlu bir doku kültürü kombinasyonu 3D izole sonra hücrelerin analizi kolaylaştırabilir. Tekniği tümör hücreleri üzerindeki tümör-stroma etkileri ile ilişkili sistematik çalışma izin veren, habis potansiyeli değişen hücreleri için de geçerlidir.

Üç boyutlu Karışık-hücre Sfero Co-kültürden Meme Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

Bu video, tükürük bezlerinden türetilen üç boyutlu sferoidler olan tükürük kürelerinin kültürlenmesi için protokolü sunar. Tükürük küreleri, baş ve boyun kanserinin, etkilenen insan hastaların tükürük bezlerinden tükürük üretimi üzerindeki etkisini değerlendirmek için daha fazla kullanılabilir.

Tükürük Bezi Dokusundan Tükürük Kürelerinin Kültürlenmesi: İnsan Tükürük Bezi Kaynaklı Epitel Hücrelerinden Tükürük Küreleri Geliştirmek İçin Bir Yöntem

Genetik bütünü içinde epitel hücreleri manipüle etmek için bir...

Tükürük Bezi Organ Kültürleri Genetik Modifikasyon ve Rekombinasyon

Morfoloji ve tükürük bezlerinin fonksiyonel belirteçleri görselleştirmek için üç boyutlu organotypic kültürler kullanarak radyasyon aşağıdaki doku hasarı mekanizmaları yeni anlayış sağlayabilir. Burada açıklanan bölüm, kültür, ışınlama, leke ve görüntü 50 – 90 μm kalınlığında tükürük bezi bölümleri önce ve iyonlaştırıcı radyasyon maruz aşağıdaki bir protokoldür.

Submandibular ve parotis tükürük bezlerinden Organotipik kültürlerin radyasyon tedavisi anahtar In vivo özellikleri

Lakrimal bezi (LG), α-pürüzsüz Kas aksini (αSMA) ifade eden iki hücre türüne sahiptir: miyoepitelyal hücreler (MECs) ve perikayt. MECS ektodermal orijinli, birçok glandüler dokularda bulunan, perikayt endodermal kökeni vasküler pürüzsüz Kas hücreleri iken. Bu protokol, murine LGs 'den MECs ve perikaytları yalıtır.

Yetişkin Murine lacrimal ve submandibular bezlerden Myoepitelyal hücrelerin izolasyonu

Burada geleneksel yönteme Kaya inhibitörü Y-27632 eklenerek insan dişeti epitel hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için değiştirilmiş bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem daha kolay, daha az zaman alıcıdır, kök hücre özelliklerini geliştirir ve hem laboratuvar hem de klinik uygulamalar için daha fazla sayıda yüksek potansiyelli epitel hücresi üretir.

Y-27632 Kullanarak Birincil İnsan Dişeti Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Diş folikülleri epitel popülasyonu ve mezenkimal hücreler içerir. Epitel popülasyonu, farklı bir kültür ortamı sağlanarak heterojen diş folikül hücre popülasyonundan seçilmiştir. Epitel hücreleri hayatta kaldı ve serumsuz bir ortamda koloniler oluşturdu.

Epitel Hücrelerinin İnsan Diş Foliküllerinden İzolasyonu

Bu çalışma, primer insan meme epitel hücrelerini (HMEC'ler) küçük miktarlarda meme dokusundan verimli bir şekilde izole etmek ve büyütmek için daha kolay, zaman kazandıran ve ekonomik bir protokol bildirmektedir. Bu protokol, hem laboratuvar hem de klinik uygulamalar için birincil HMEC'lerin hızlı bir şekilde üretilmesi için uygundur.

Primer İnsan Meme Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Keşfedin, insan tükürük bezinden salisfer veya monolayer olarak primer epitel hücreleri izolasyonu. Bu yöntem, viral çoğalma ve doku rejenerasyonu araştırmaları için in vivo benzeri modeller sunar.

Salispheres veya Monolayers olarak In vitro büyüme için ınsan tükürük bezlerinden tükürük epitelyal hücrelerin yalıtım

Daha fazla video keşfet