Elektrofizyolojik Alan Kaydı ile Interlamellar Hipokampus CA1'de Uzun Süreli Sinaptik Plastisitenin Araştırılması
11 Ağustos 2019
Biz postitudinal hipokampal beyin dilimleri ve uzunlamasına konumlandırılmış kayıt ve stimülasyon elektrotlar in vivo hücre dışı postinaptik potansiyelleri uyandırmak ve göstermek için kullanılan kayıt ve stimülasyon elektrotlar uzunlamasına interlamellar CA1 boyunca uzun vadeli sinaptik plastisite.
Uzun süreli sinaptik plastisite, özellikle, uzun vadeli potansiyasyon ve uzun süreli depresyon hipokampus enine oryantasyon boyunca yaygın olarak araştırılmıştır. Ayrıca uzunlamasına oryantasyon boyunca bakılmıştır. Ancak, uzunlamasına oryantasyon söz konusu olduğunda, çok az dikkat sinaptik plastisite açısından hipokampus uzunlamasına CA1 eksenine verilmiştir.
Bizim laboratuvardan bir önceki yayın hipokampus CA1 piramidal nöronlar sinaptik plastisite destekleyebilir dernekbağlantıları oluşturduğunu göstermiştir. Bu protokolün daha fazla anlaşılması için, aşağıdaki başvuruile önceki yayına başvurmanız önerilir. Fareyi anestezik etmek için üretan enjekte et.
Tamamen anestezili fareyi 37 dereceye ayarlanmış bir ısıtma yastığına yerleştirin. Gözleri nemlendirmek için göz jeli uygulayın. Göz kıskacını kullanarak farenin kafatasını sıkıca düzeltin.
Göz kıskaçı cerrahi işlemler sırasında deneyci için hareketlilik özgürlüğü verir. İşitsel korteksi içeren deneyler için de özellikle yararlı olabilir. Ancak, çok dikkatli tam stereotaksik koordinatları almak için alınmalıdır.
Neşter ve oksipital kemiğin insaterinin sonundaki deri altı doku ve kasları neşterle ayırın. Leke dura madde pamuklu bez ile kuru. Sonra beyin omurilik sıvısını boşaltmak için sarnı çilesini delersin.
Beyin omurilik sıvısı drenaj tutmak için bir pamuklu bez takın. Kafa derisi üzerindeki deriyi kesin ve çıkarın ve maruz kalan bölgeyi kuru tutun. Bir veniyar kaliper yardımı ile hipokampal bölgeye karşılık gelen noktaları işaretleyin.
Bir mikroskop altında gözlemlerken bir neşter veya yüksek hızlı matkap kullanarak işaretli noktaları boyunca hipokampus sırt bölgesi üzerinde kafatasında bir kesi olun. Fizyolojik salin veya inert yağ uygulayarak maruz beyin dokusu nemli tutun. Uyarım ve kayıt elektrotlarını stereotaksik tutucuda sıkıca düzeltin ve yerleştirin.
CA1 dorsal hipokampus üzerinde stimülasyon ve kayıt elektrotları ayarlayın. Dorsal longitudinal CA1 hipokampal bölge koordinatı bulma bir rehber olarak stereotaksik koordinat fare beyin kullanın. Çok kanallı elektrotlar kullanarak kayıtlar için, ilk kanalı kullanarak CA1 hipokampal bölgesi için stereotaksik koordinatlarınızı bulun.
Geri kalan elektrotları, uyarım ve kayıt elektrotlarının açısının bregma noktasından orta hatta göre 30 ila 60 derece aralığında olduğu şekilde yerleştirin. Bu açı CA1 hipokampal bölgenin uzunlamasına yönelimine karşılık gelir. Kayıt sistemini açın.
Kayıt ve veri toplama için sinirsel yazılımı açın. Mikromanipülörü kullanarak kayıt ve stimülasyon elektrotlarını beynin yüzeyine dokunana kadar yavaşça düşürün. Elektrot beyin yüzeyine dokunduğunda empedansta bir artış gözlemleyin.
Bu ekranda gösterilen kırmızı kanalda görülebilir. Elektrotları CA1 hipokampusu için seçilen stereotaksik koordinatlara karşılık gelen yaklaşık derinliğe yavaşça indirin. Kararlı bir evoke dolu uyarıcı post-sinaptik potansiyel gözlenene kadar stimülasyon verin.
Maksimum uyaran yoğunluğunu algılamak için bir giriş-çıkış eğrisi gerçekleştirin. Temel yoğunluğu ayarlamak ve yüksek frekanslı stimülasyon veya düşük frekanslı stimülasyon çağrıştırmak için uyarıcı yoğunluğunu ayarlamak için giriş-çıkış eğrisini kullanın. Yüksek frekanslı stimülasyon veya düşük frekanslı stimülasyon dan sonra bir saat için yerel tam potansiyeli kaydedin.
Veri aktarın ve seçtiğiniz yazılımı kullanarak analiz edin. Zaten hazırlanmış dilimleme çözeltisinin 400 ml'lik kısmı ayrı bir şişeye ve yaklaşık 20 dakika oksijene dönüşür. Oksijenli dilimleme çözeltisinin 200 ml'lik kısmı zayıf.
Para film kapak ve bir çamur yapmak için yaklaşık 20 dakika boyunca 80 derece dondurucuya aktarın. Bir beyin dilimi tutma odasında dilimleme çözeltisi kalan 200 ml yoksul ve sürekli köpüren ile 32 santigrat derece su bot u tutun. Soğutulmuş dilimleme solüsyonu ve bir kabın içinde yaklaşık 50 ml'yi yok edin.
Anestezili farenin kafasını kes. Farenin kafatası kapsayan deri kesin ve oksipital kemik orta hat boyunca kafatası parçası kesti. Kafatasını künt pletimle aç.
Yavaşça bir spatula ile beyin dışarı kepçe ve kabın soğutulmuş dilimleme çözeltisi yer. Orta hattaki iki beyin yarıküresini neşter bıçağıyla ayırın. Hipokampusu nazikçe bir spatula ile korteksten ayırarak izole edin.
İzole hipokampusun septal ve temporal ucunu kesin. Dilimleme plakasına az miktarda tutkal uygulayın. Uzunlamasına CA1 hipokampal dilim için, yapıştırıcı ile dilimleme plakasına hipokampus CA3 bölge takın.
Kontrol görevi göreceksiniz enine dilim için, vibratom dilimleme plakahipokampus ventral ucunu takın. Dilimleme odasına yerleştirin. Vibratom parametrelerini ayarlayın.
Bağlı hipokampusu vibratomla dilimleyin. İyi bir uzunlamasına CA1 hipokampal beyin dilimi CA1 bir tabaka olacak, ve dentat girus iki tabaka. Ayrıca, tabaka oriens ve CA1 bölgenin stratum radyatum mevcut olacaktır.
Alternatif olarak, bir enine hipokampal beyin dilimi intisat gyrus CA3 ve CA1 bölgeleri intisat olacaktır. Beyin dilimlerini su robotundaki beyin dilimi tutan odaya aktarın. 32 santigrat derece sıcaklıkta 20 dakika kuluçka ve geri kazanım için oda sıcaklığına getirmek.
ACS serf'ini dakikada 2 ml hızla kayıt odasına sürekli olarak aşındırın. Beyin dilimini kayıt odasına aktarın, beyin diliminin pozisyonunu künt pİşplerle ayarlayın ve bir hap ile yerinde tutun. Veri toplama için yazılımı açın.
Uzunlamasına beyin dilimi. Uzunlamasına dilimler için, stimülasyon ve kayıt elektrotunu stratum oriens'e yerleştirin. Aynı tabakadan kayıt ile beyin diliminin septal veya temporal tarafında stimülasyon elektrodu yerleştirin.
Alternatif olarak, stimülasyon ve kayıt elektrot stratum radiatum konum, beyin diliminin septal veya temporal tarafında stimülasyon elektrodu yerleştirin. Kontrol olarak enine dilimler için, stimülasyon elektrotunu CA3 Schaffer kollateral yol bölgesine ve kayıt elektrotunu CA1 bölgesine yerleştirin. İzolatör uyarıcı jeneratörü açın ve stimülasyon verin.
Kayıt elektrot derinliğini, sinaptik sonrası dolu bir uyarıcı uyarıcı olana kadar ayarlayın. Maksimum uyaran yoğunluğunu algılamak için bir giriş-çıkış eğrisi gerçekleştirin. Yüksek frekanslı stimülasyon veya düşük frekanslı stimülasyon çağrıştıran temel kayıt için uyarıcı yoğunluğunu ayarlamak için giriş-çıkış eğrisini kullanın.
Yalnız süreli potansiyasyon veya uzun süreli depresyon indükleyen parametreler için ekli PDF'ye bakın. Uyarılmış uyarıcı post-sinaptik potansiyel in vivo yüksek frekanslı stimülasyon yanıt olarak artmıştır. Bu uzunlamasına hipokampal CA1 uzun vadeli potentiation desteklediğini gösterir.
Longitudinal hipokampal CA1 beyin dilimleri için, yüksek frekanslı stimülasyon yanıt artış stratum oriens ve stratum radiatum hem septal ve temporal tarafında gözlendi. Bu, uzunlamasına hipokampal CA1 bölgesi boyunca indüklenen sinaptik plastisitenin doğrusal veya yöne özgü olmadığını göstermektedir. Uzun süreli depresyon için zaten kurulmuş protokoller kullanılarak, uzun süreli depresyon hem in vivo hem de in vitro indüklenen oldu.
Sonuç olarak, size uzunlamasına hipokampal CA1 bölgesinde hem in vivo hem de in vitro uzunlamasına sinaptik plastisiteyi nasıl araştıracağını gösterdik. Protokolün daha fazla bilgi pdf kendi laboratuvarlarında uzunlamasına hipokampal CA1 bölge boyunca uzunlamasına sinaptik plastisite soruşturma size yardımcı olmak için bu video eşlik bulunabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, uzunlamasına beyin kesitleri ve in vivo kayıtlar kullanarak hipokampusun CA1 bölgesinin boylamsal eksenindeki uzun süreli sinaptik plastisiteyi incelemektedir. Araştırma, sinaptik değişiklikleri anlamak için hücre dışı postsinaptik potansiyellerin aydınlatılmasına odaklanmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Elektrofizyoloji
- Sinaptik Plastisite
Arka Plan
- Uzun süreli sinaptik plastisite, öğrenme ve bellek için kritik öneme sahiptir.
- Önceki çalışmalar temel olarak hipokampusun transvers oryantasyonuna odaklanmıştır.
- Longitüdinal CA1 sinaptik plastisitesi üzerine yapılan araştırmalar sınırlıdır.
- CA1 piramidal nöronlarının asosiyatif bağlantıları plastisiteyi destekleyebilir.
Çalışmanın Amacı
- CA1 bölgesinin boylamsal ekseni boyunca sinaptik plastisiteyi incelemek.
- Postsinaptik hücre dışı potansiyellerin in vivo uyarılmasını araştırmak.
- Sinaptik değişikliklerin altında yatan mekanizmaların anlaşılmasını geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Çalışmada boylamsal hipokampal beyin kesitleri ve in vivo kayıtlar kullanılmıştır.
- Fareler, deneysel prosedürler için üretan ile anestezi uygulanarak uyutulmuştur.
- Veri toplamak amacıyla elektrotlar, stereotaksik koordinatlar kullanılarak dikkatlice yerleştirilmiştir.
- Kayıtlar için yüksek ve düşük frekanslı stimülasyon protokolleri uygulanmıştır.
- Veriler, dalga formu ve potansiyel değerlendirmesi için nöral yazılımlar kullanılarak analiz edilmiştir.
Ana Sonuçlar
- Stabil uyarılmış eksitatör postsinaptik potansiyeller kaydedildi.
- Çalışma, longitudinal CA1 aksı boyunca uzun süreli sinaptik değişim mekanizmalarını doğrulamıştır.
- Elektrofizyolojik kayıtlar, stimülasyon sırasında anlamlı sinaptik aktiviteye işaret etmektedir.
- Girdi-çıktı eğrileri, değişen stimülasyon yoğunluklarının artmış sinaptik yanıtlara yol açma kapasitesini göstermiştir.
Sonuçlar
- Bu araştırma, CA1 nöronlarının yeterince incelenmemiş boylamsal sinaptik plastisitesine ışık tutmaktadır.
- Çıkarımlar, öğrenme ve bellekteki nöronal mekanizmaların anlaşılmasına kadar uzanmaktadır.
- Elde edilen sonuçlar, sinaptik dinamikleri ve plastisiteyi araştıran gelecekteki çalışmalara bilgi sağlayabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Hipokampal CA1 ağlarındaki boylamsal sinaptik plastisiteyi anlamak, MSS hedef doğrulamasıyla ilgili nöral devre fonksiyonlarına dair mekanistik içgörüler sağlar. Bu çalışma, asosyasyonel CA1-CA1 bağlantısallığını karakterize ederek transvers-lamellar odaklı modellerdeki bir boşluğu doldurmakta ve hipokampus bağımlı bilişsel süreçleri içeren hipotezlerin risk azaltma süreçlerini desteklemektedir. Çift yönlü elektrofizyolojik yaklaşım, hastalıkla ilişkili sistemlerde hedef etkileşiminin ve yolak modülasyonunun değerlendirilmesine olanak tanır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Boylamsal hipokampal devreleri ve NMDA reseptörüne bağımlı plastisite mekanizmalarını içeren terapötik hipotezleri sorgular.
- Operasyonel Değer: Bozulmamış ağlarda, katmana ve yöne özgü elektrofizyolojik okumalar yoluyla fonksiyonel hedef doğrulamasını sağlar.
- Öngörücü Değer: Preklinik modellerde LTP-yetkin ağ durumlarını LTD-yetersiz ağ durumlarından ayırt ederek portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Tekrarlanabilir hücre dışı alan potansiyeli ölçümleri için valide edilmiş boylamsal hipokampal dilimler hazırlar.
- Kantitatif Çıktı: Doz-yanıt ve stimülasyon frekansı profillemesine uygun stabil uyandırılmış eksitatuar postsinaptik potansiyeller üretir.
- Platformun Yeniden Kullanımı: Standartlaştırılmış dilim hazırlama ve elektrot yerleşimi, çalışmalar arası karşılaştırılabilirliğe ve boylamsal veri takibine olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlişkisi: Nöropsikiyatrik ve nörodejeneratif hastalık modellerindeki hipokampusa bağımlı bilişsel alanlarla uyumludur.
- Mekanistik Süreklilik: Keşif aşamasındaki plastisite analizları ile hedef kaynaklı sinaptik etkilerin preklinik doğrulaması arasında köprü kurar.
- Risk Ayarlı Kararlar: İnterlamellar CA1'de LTD'nin yokluğu, biyobelirteç seçimini ve modülatör tarama için go/no-go (devam/durdur) kriterlerini belirler.
Pipeline ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hastalıkla ilişkili bir hipokampal alt sistemde sinaptik modülasyona dair elektrofizyolojik kanıtlar sunarak, keşiften preklinik aşamaya uzanan sürekliliğe uyum sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Giriş-çıkış eğrileri ve LTP indüksiyonu kullanarak, boylamsal CA1 yolak katılımı ve NMDA reseptör bağımlılığına ilişkin hipotezleri test eder.
- Tarama: Septal-temporal eksenler boyunca bileşik etkilerinin karşılaştırılmasına olanak tanıyan, analizle standartlaştırılmış alan potansiyeli çıktıları sağlar.
- Analitikler: Çıktılar; LTP büyüklüğünü, stimülasyon eşiklerini ve LTD yokluğunu içerir ki bunlar hedef modülasyon değerlendirmesi için kantitatif metriklerdir.
- Translasyonel Araştırma: Türler arası korunan CA1 mikrodevreleri ve NMDA reseptör bağımlılığı aracılığıyla preklinik çalışmalarla bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Tek bir çalışma uygulamasının ötesinde, boylamsal hipokampal sorgulama için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hipokampal boylamsal sinyallezmedeki mekanistik belirsizliği çözerek hedef doğrulama sürecindeki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Tanımlanmış elektrot yerleşim kriterleri ile in vivo ve in vitro alan kaydı için standartlaştırılmış, tekrarlanabilir protokoller sunar.
- Stratejik Değer: LTP kapasiteli ağları belirleyerek ve plastisite odaklı taramalardaki yanlış negatifleri azaltarak devam/dur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Hastalıkla ilişkili sistemlerdeki çift yönlü plastisite profillerine dayanarak bileşiklerin riskle uyumlu önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Stereotaktik cerrahi, hipokampal anatomi ve elektrofizyolojik sinyal yorumlama konularında uzmanlık gerektirir.
- Stabil kayıt sistemlerine, mikromanipülatörlere ve giriş-çıkış eğrisi oluşturma ile LTP/LTD indüksiyonu yapabilen yazılımlara bağlıdır.
- Kesit oryantasyonu, stimülasyon parametreleri ve bazal kayıt süresinin ekipler arası standart hale getirilmesini gerektirir.
- Diğer modellere adaptasyon, longitudinal CA1 homologlarının ve assosiyatif bağlantı korunumuyla doğrulanmasını gerektirir.
- Pratik sınırlamalar arasında elektrot açısına (orta hattan 30–60 derece) karşı teknik hassasiyet ve in vivo hazırlık sırasında serebrospinal sıvı drenajı yer almaktadır.
