Canlı Hücrelerde Fura-2-Analog Ile Hücre İçi Ca2+ Ölçümü için Yeni Nikotinamid Adenin Dinükleotid Düzeltme Yöntemi
20 Eylül 2019
NADH ve fura-2 analoglarının uyarma ve emisyon dalga boylarının spektral örtüşmesi nedeniyle, canlı hücrelerdeki her iki kimyasaldan gelen sinyal paraziti [Ca2+]'ün kantitatif ölçümü sırasında kaçınılmazdır. Böylece, [Ca2+] ölçmek için NADH sinyal girişiminin yeni bir çevrimiçi düzeltme yöntemi geliştirilmiştir.
UV uyarılabilir çoğul problar, otomatik çoğul sesler nedeniyle, doğal bir sinyal kontaminasyonu var. NADH ile ilgili sorunun çoğu, çoğul bir sonda kullanımını sınırlamaktır. Bir yöntem, nadh gelen dış floresantam düzeltmek için kullanılabilir, gerçek, kirlenmemiş çoğul prob sinyali ayıklamak için.
Prosedürü gösteren jeong Hoon Lee, laboratuvarımdaki araştırma yardımcı doçenti olacak. Miyositlerin tüpün dibine yerleşmelerine izin vererek, süpernatantı aspire edin. Hücreleri iki mililitre taze hazırlanmış bir milimolar fura-2-FFAM seyreltme çözeltisi ile etiketleyin.
Kuluçka sonunda, supernatant çıkarmadan önce dik pozisyonda 30 dakika boyunca 37 derece santigrat su banyosu tüp yerleştirin. Sonra oda sıcaklığında depolamak için oda sıcaklığında kültür orta dört mililitre ekleyin. In situ isobestic fura-2-ffa noktası tanımlama için mikroskop aşamasına seyreltilmiş hücreleri monte ve hücrelerin dibe batmak için üç dakika bekleyin.
Nadh içermeyen 37 santigrat derece kalsiyumsuz çözeltihücre kültürüne bol ve bir hedef hücre bulmak. NADH içermeyen kalsiyumiçermeyen solüsyon ile yeniden profusing önce 60 saniye boyunca saponin çözeltisi bol. Aynı anda fura-2-ff yayılan sinyalleri 450 ve 500 nanometre olarak ölçün, 0,1 nanometre adım la 350 ila 365 nanometre arasında bir uyarma taramayı ve NADH içermeyen kalsiyumsuz çözeltiile yeniden bolca kullanın.
Daha sonra kalsiyumsuz koşullarda sinyallerden kalsiyum doymuş çözeltisi sinyalleri çıkarın. Daha sonra her uyarmada emisyonun standart sapmalarını hesaplayın ve tek tek isobestik noktalar olarak minimum standart sapma değerlerini gösteren uyarma dalga boyu seçin. Arka plan sinyalini tespit etmek ve hücre alanı içindeki sinyali düzeltmek için çok parametrik bir ölçüm sistemi kullanmak için, mikroskop banyosuna boyasız hücreler monte edin ve hücrelerin üç dakika lığına yerleşmesini bekleyin.
Nadh kalsiyumsuz çözeltiyi dakikada 2-3 mililitre hızla yaklaşık beş dakika boyunca banyoya verin ve nesne alanını hedeflenen hücreyi kapsayacak şekilde ayarlayın. Hücreyi alan dışına çıkardıktan sonra hücreserbest penceresinin arka plan sinyallerini ölçün ve sinyalleri uzaklık olarak ayarlayın. Sonra hücreyi ilk konuma döndürün ve hücre arka plan sinyallerini ve hücre alanını ölçün.
R-faktörünü hesaplamak için, boyaiçermeyen hücreleri mikroskoba yeniden monte etmeden ve kalsiyumsuz çözelti ile kullanmadan önce edinilmiş hücre arka planını ve alan sinyallerini kullanın. Masat çözeltisi ile hücre süspansiyonu profusing önce belirtildiği gibi sinyalleri ölçün. Sinyalleri ölçtükten sonra pirüvat çözeltisi ile hücreleri bol ve ardından malate-pirüuvat çözeltisi ve rotenone çözeltisi ile profüzyon.
Daha sonra her sinyal için eğimi hesaplayın. Burada düzeltme öncesi ve sonrası mitokondriyal kalsiyum değişiklikleri gösterilir. Sonuçlar, mitokondriyal kalsiyumda 1.03 artı veya eksi 0.13 mikromolar ve maksimum mitokondriyal kalsiyum ile mitokondriyal kalsiyum konsantrasyonunda önemli değişiklikler olduğunu açıkça ortaya koymaktadır.
Mitokondriyal transmembran potansiyeli iki nanomolar TMRE profüzyonu ile izlendi. Mitokondriyal potansiyeldeki değişim eksi 150 milivoltluk ilk mitokondriyal membran potansiyeline göre hesaplandı ve kalsiyum eklenmesine yanıt olarak NADH'da bir azalma gösterdi ve mitokondriyal membran potansiyeli üzerinde ihmal edilebilir bir etki gösterdi. Mitokondiral pH karboksi SNARF-1 yükleme ile indüklenen mitokondriyal kalsiyum artışı ndan etkilenmedi.
Yanlış isobestic noktaları yanlış R ve NADH düzeltme sayılsa neden olabilir. Bu nedenle, hücre içermeyen arka planı ve hücre alanını her zaman doğru bir şekilde ölçmeye özen tin.0k.000.000.000.000.000.000.000.0 Bu teknik biyoanalitik dökülmelerde mitokondriyal kalsiyum dinamik çalışmalarının hazırlanmasında kullanılır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, canlı hücrelerde kalsiyum konsantrasyonları ölçülürken NADH ve fura-2 analoglarından kaynaklanan sinyal girişimi sorununu ele almaktadır. NADH sinyal kontaminasyonu varlığında [Ca2+] ölçümlerinin doğruluğunu artırmak için yeni bir çevrimiçi düzeltme yöntemi geliştirilmiştir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Floresans ölçümlerinde sinyal girişimi
- Canlı hücrelerde kalsiyum ölçümü
- Düzeltme tekniklerinin geliştirilmesi
Arka Plan
- Uyarılma ve emisyon dalga boylarının spektral örtüşmesi ölçümleri karmaşıklaştırır.
- NADH, floresan mikroskobisinde birden fazla probun kullanımını kısıtlayabilir.
- [Ca2+]'nın doğru ölçümleri hücresel çalışmalarda kritik önem taşır.
Kullanılan Yöntemler
- fura-2 ile floresan ölçümü
- Miyositlerle hücresel analizler
- Sinyal düzeltme teknikleri ve arka plan ölçümü
Temel Sonuçlar
- Mitokondriyal kalsiyum konsantrasyonlarında önemli değişiklikler gözlemlendi.
- NADH girişimini düzeltmek için sistematik bir yaklaşım geliştirildi.
- Teknik, titiz deneysel prosedürlerle doğrulandı.
Sonuçlar
- Çalışma, floresan ölçüm doğruluğunu artırmaya yönelik bir yöntemi başarıyla ortaya koymaktadır.
- Bunun, hücre biyolojisindeki kantitatif analizler için önemli sonuçları vardır.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Hücre içi kalsiyumun doğru ölçümü, özellikle mitokondriyal sinyal yolları için ilaç keşfindeki hedef doğrulamada kritik öneme sahiptir. NADH otofloresansı, fura-2 tabanlı analizlerde önemli girişimlere yol açarak veri güvenilirliğini tehlikeye atmakta ve erken taramalarda yanlış pozitif oranlarını artırmaktadır. Bu NADH düzeltme yöntemi, gerçek kalsiyum sinyallerini izole ederek öngörü güvenini artırmakta ve kardiyovasküler ile metabolik hedef programlarındaki mekanistik risk azaltma süreçlerini desteklemektedir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Hastalık modellerinde terapötik bir hipotez olarak mitokondriyal kalsiyum yönetiminin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: NADH otofloresansını gerçek fura-2 sinyallerinden ayırarak mekanistik belirsizliği azaltır.
- Öngörücü Değer: Kantitatif ve interferanssız kalsiyum akışı ölçümleri aracılığıyla hedef güvenini artırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Temel NADH-düzeltmeli floresansı belirleyerek, valide edilmiş biyolojik sistemleri sonraki bileşik taramalarına hazırlar.
- Tekrarlanabilirlik: İzobestik nokta belirleme yoluyla eksitasyon dalga boyu seçimini standartlaştırır ve analizler arası değişkenliği minimize eder.
- Multiplexing Kapasitesi: Farklı eksitasyon/emisyon setleri kullanarak NADH, kalsiyum ve pH veya membran potansiyelinin eş zamanlı ölçümünü destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalık İlişkisi: Nörodejeneratif ve metabolik bozukluklardaki mitokondriyal disfonksiyon modellerine doğrudan uygulanabilir.
- Translasyonel Süreklilik: Düzeltilmiş fura-2-FF sinyallerini kullanarak, keşif aşamasındaki kalsiyum akışı gözlemlerini preklinik doğrulamaya bağlar.
- Riski Ayarlanmış İlerleme: Mitokondriyal kalsiyum analizlerinde hatalı sinyalleri azaltarak daha güvenilir devam/durdurma kararları alınmasını sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef hipotez testinden öncü bileşik tanımlamaya ve ardından preklinik mekanistik doğrulamaya kadar uzanan keşif sürekliliği içerisinde, özellikle mitokondriyal hedefler için uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Canlı hücre deneylerinde kalsiyuma bağımlı sinyalleri metabolik girişimlerden izole ederek yolak açıklığa kavuşturulmasını destekler.
- Tarama: Arka plan çıkarma ve ofset düzeltme yoluyla deney hazırlığını artırarak bileşik değerlendirmesi için sinyal-gürültü oranını iyileştirir.
- Analitik: 450 nm ve 500 nm'deki düzeltilmiş emisyonu kullanan R-faktörü hesaplaması aracılığıyla kantitatif ratiometrik ölçümlere olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: TMRE kullanarak kalsiyum ve mitokondriyal membran potansiyelinin eş zamanlı izlenmesi yoluyla preklinik çalışmalarla bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: NADH girişimine yatkın hücre tipleri ve floresan problar genelinde uygulanabilir, yeniden kullanılabilir bir düzeltme çerçevesi oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Kalsiyum sinyallendirmesindeki NADH kaynaklı yalancı pozitifleri ortadan kaldırarak hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Sistematik izobestik nokta belirleme ve arka plan çıkarma yoluyla assay standardizasyonunu ve tekrarlanabilirliğini iyileştirir.
- Stratejik Değer: Erken aşama tarama kaskadlarındaki biyolojik gürültüyü azaltarak daha iyi karar verme süreçlerini destekler.
- Portföy Etkisi: Güvenilir ve interferanssız fonksiyonel okumalar aracılığıyla mitokondriyal hedeflerin riskle uyumlu önceliklendirmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Floresan mikroskopi ve rasyometrik prob kullanımı konusunda uzmanlık gerektirir.
- Dalga boyu taramalı eksitasyon (350–365 nm) ve çift emisyon deteksiyonu (450 nm, 500 nm) yapabilen cihaz donanımı gereklidir.
- Arkaplan sinyal ölçümü ve ofset düzeltme protokollerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Yöntemin farklı boyasız hücre hazırlama iş akışlarına uygulanmasında adaptasyon değerlendirmeleri gerektirir.
- Yanlış izobestik nokta seçimini önlemek için hücresiz arkaplan ve hücre alanı sinyallerinin titizlikle ölçülmesine bağlıdır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:04
Title
0:41
Mitochondrial Fluoroprobe Loading
1:22
In Situ Isosbestic Fura-2-FF Point Identification
2:40
Background Signal Detection and Cell Area Correction
3:30
R Factor Measurement
4:12
Results: Representative Intracellular Ca2+ Measurement
5:15
Conclusion
