Caenorhabditis elegans 2-Arachidonoylglycerol Quantification için Bir Deuterated Standart Sentezi

Endofanbinoidler çeşitli organizmalarda birden fazla biyolojik süreci düzenleyen lipid mediatörleri korunur. Keşfedilen ilk endokannabinoidler anandamid ve 2-arachidonoylglycerol, 2-AG vardır. Nematod C.elegans biyolojik süreçlerin büyük bir çeşitlilik çalışma için güçlü bir hayvan modelidir.

Son zamanlarda, 2-AG C.elegans kolesterol ticaretinin düzenlenmesinde temel bir rol oynadığını keşfetti. Bu nedenle C.elegans'ta endojen 2-AG'yi incelemek için bir yöntem tasarlamak ve optimize etmek zorunlu hale geldi. Biyolojik numunelerde 2-AG'yi ölçmek için daha önce bildirilen analitik yöntemler genellikle ticari olarak edinilen kısırlaştırılmış standartların kullanımını içerir ve bunları satın almak için gereklidir.

Yine de, onlar pahalı, ve birden fazla çift bağ varlığı nedeniyle, zaman içinde okside almak için duyarlıdır. Standartların en yaygın versiyonu, izotop seyreltme, sıvı kromatografi sivivetografya sıve posterior kütle spektroskopisi ile ölçülme için uygun olan oktavatlı araşidonik asite dayanmaktadır. 2-AG'yi ölçmek için kısırlaştırılan standartların maliyet ve istikrarı ile ilgili zorlukların üstesinden gelmek için, döteryum-5-gliserol'a dayalı analitik bir standart hazırlamak için uygun ve basit bir yöntem kullandık.

Pendeuterated standart hazırlamak için sıra üç adımyordam gerektirir. İhtiyaç duyulana kadar korunan formda tutulabilmesi. Bu çalışmanın temel amacı, analitik olarak nötralizasyon standardının sentezinden nematod örneklerinin hazırlanması ve çıkarılmasına ve son olarak sıvı kromatografisi ve kütle spektroskopisi ile analize kadar C.elegans'ta 2-AG'yi incelemek için tam bir yöntem göstermektir.

Sayısal tahliller için deuterated 1-AG bir deuterated iç standart olarak elde etmek için üç adım protokolü izleyin. Sadece birincil alkolleri korumak için, ilk bir Pasteur pipet kullanarak 10 mililitrelik reaksiyon tüpü nekadar deuterated gliserol 38 miligram ekleyin ve manyetik karıştırıcı ekleyin. Sonra, beş mililitre Hamilton şırınga kullanarak susuz DCM beş mililitre ekleyin ve durağan bir atmosfer vermek için kuru azot ile tüp doldurun.

Distile etil asetat ile dolu sığ bir Dewar şişesi kullanarak bir banyo hazırlayın. Banyo içinde hermetik kapalı reaksiyon tüpünü doldurun ve çözücü dondurulana kadar etil asetat yavaş yavaş sıvı nitrojen ekleyerek soğutun. Dikkat, sıvı şiddetle oda sıcaklığında kaynar ve gözler ve cilt ile temas halinde ciddi yanıklara neden olabilir.

Sonra, hamilton şırıngası kullanarak 54 miligram susuz çarpıştırıcı ekleyin. Dikkat, çarpıştırıcı uçucu ve çok güçlü ve hoş olmayan bir kokusu vardır. 70 miligram terbutile-dimethyl-cetylchloridde ve manyetik karıştırıcı üzerinde eksi 78 derece üç saat boyunca her şeyi karıştırın.

Reaksiyonu bastırmak için iki mililitre salamura ekleyin. Organik özleri her seferinde tutan ayrılmış bir huni kullanarak iki mililitre distile diklorometan ile çözeltiyi üç kez ayıklayın. Sonra, üç organik özler birleştirmek ve sodyum sülfit üzerinde kuru.

Sabit faz olarak silika jel ve%100 heksandan başlayarak %100 heksan etil asetat gradyan ve %100 etil asetat ile bitirerek kolon kromatografisi ile ham karışımı arındırın. Bu esterleşme adımı için, daha önce 10 mililitrelik bir reaksiyon tüpüne Pasteur pippette kullanarak belirtilen ürünün 10 miligramını ekleyin ve manyetik karıştırıcı ekleyin. Beş mililitre Hamilton şırınga kullanarak susuz DCM iki mililitre ekleyin ve durağan bir atmosfer vermek için kuru azot ile tüp doldurun.

Bir buz banyosu kullanarak sıfır dereceye çözeltiyi soğutun. Ad 36 miligram araşidonik asit çok hacimli ayarlanabilir mikropipet kullanarak ve karıştırın. Sonra, 40-metil-aminopyridine 15 miligram ekleyin ve karıştırın.

Çok hacimli ayarlanabilir mikropipet kullanarak 15 miligram diacylpropylcarbodiimid ekleyin ve karıştırın. Reaksiyonu söndürmek için iki mililitre su ekleyin ve ardından çözeltiyi iki mililitre distile DCM ile üç kez ayırıcı bir huni kullanarak ayıklayın. Üç organik özleri birleştirin ve sodyum sülfit üzerinde kuru, sabit bir faz olarak silika jel kullanarak sütun kromatografi ile ham karışımı arındırın sonra% 100 heksan başlayan heksan etil asetat gradyan artan ve bitirme 50% 50 heksan etil asetat.

Son olarak, deprotection adım için, bir Pasteur pipet kullanarak 10 mililitre reaksiyon tüpü için daha önce sentezlenmiş ürünün 15 miligram ekleyin ve manyetik karıştırıcı ekleyin. Beş mililitre Hamilton şırınga kullanarak susuz tetrahidrofuran iki mililitre ekleyin ve durağan bir atmosfer vermek için kuru azot ile tüp doldurun. Sonra bir buz banyosu kullanarak sıfır dereceye çözeltisoğun.

Bir Hamilton şırınga kullanarak THF tetrabutylammonium florür bir azı çözeltisi damla-bilge 150 mikrolitre ekleyin. Bir saat sonra, reaksiyon söndürmek için su iki mililitre ekleyin. İki mililitre distile DCM üç kez bir ayırma hunisi kullanarak çözelti ayıklayın.

Üç organik özleri birleştirin ve sodyum sülfit üzerinde kuru. Beyazlatma işlemi için solucanları 6 santimetrelik ngm plakalarına çevirin. Solucanın 2-3 günden üç güne büyümesine izin verin, böylece tabakta çok sayıda yumurta ve gravid yetişkin vardır.

Bir kez yumurta ve yetişkin bol var, plaka üzerine M9 beş mililitre dökün. Cam pipet kullanarak solucanları 15 mililitrelik bir şahin tüpüne aktarın. Tüpü 2,000 G'de iki dakika santrifüj edin ve solucanları peletleyin.

Solucan peletini bozmadan M9'un çoğunu emme. Üç mililitre beyazlatma çözeltisi ekleyin ve yaklaşık beş dakika veya bozulmamış yetişkin solucan sayısında bir azalma görene kadar ters çevirerek çözeltiyi hafifçe karıştırın. Cesetlerin çoğu eridikten sonra, 2,000 G'de bir dakika lığına santrifüj.

Solucan peletini bozmadan beyazlatma solüsyonunun çoğunu emme. Tüpe 15 mililitre M9 ekleyin ve iyice karıştırın. Bir dakika lığına 2,000 G'de tekrar santrifüj.

Solucan peletini bozmadan M9'un çoğunu emme. Solucan örneği hazırlama için, beyazlatma işlemi ile elde edilen N2 embriyolar 20 derece M9 tampon gecede vardı sağlar. Daha sonra, 2, 000 G.Solucanları M9 tamponu ile bir kez daha yıkayın ve canlı L1 sayısını ölçerek tüpü iki dakika santrifüj ederek senkronize L1'leri hasat edin. Daha önce kurutulmuş OP 50 Escherichia coli bir mililitre ile NGM plakaları içine tohum yaklaşık 10.000 solucanlar.

Solucanlar L4 aşamasına ulaşana kadar plakaları en az 48 saat 20 derecede kuluçkaya yatırın. 50 mililitrelik bir şahin tüpünde soğuk M9 tamponu kullanarak solucanları hasat edin. Bir kez daha yıkayın ve 1.5 mililitrelik bir tüp içine aktarın.

Bir dakika için 2, 000 G santrifüj ile solucanlar pelet. Supernatant çoğu ortadan kaldırın. Sonra, sıvı nitrojen tüp batırın ve eksi 80 derece karıştırın.

N2'ye ait yaklaşık 100 mikrolitre donmuş solucan peletini eritin ve sonra 1,3 mililitre metanol ekleyin. Bundan sonra, dört dakika boyunca örnek sonicate. Sonication sonra, dahili deuterated standart 1, 000 ppb, kloroform 2.6 mililitre ve potasyum klorür 0.5 molar 1.3 mililitre, fosforik asit 0.08 azı bir nihai oranı ekleyin.

Bir dakika için örnekleri girdap ve sonra buz üzerinde 15 dakika boyunca bir ultrasonik su banyosunda sonicate. Bir dakika boyunca tekrar iki kez örnekleri girdap ve faz ayrımı nı sağlamak için 2,000 G'de 10 dakika santrifüj edin. Temiz bir cam tüp içine alt faz toplamak, azot altında kuru, ve asetonitril 100 mikrolitre yeniden askıya.

Endojen 2-AG'nin başarılı bir nicelemesi için, üç adımlı bir yöntem kullanarak doymuş analog sentezlemek gerekiyordu. Daha sonra solucan örneklerine eklendi, yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile ayıklandı ve analiz edildi, kütle spektrometresi ile birleştiğinde. Bir iç standart olarak kullanılan, sentetik deuterated 1-AG endojen metaboliti ölçmek için bir araç oldu.

Yöntem 2-AG geçişleri kullanılarak optimize edildi ve gliserol moleküllerinin kaybolduğu 1-AG deuterated için. 2-C.elegans örneklerinden ag endojen iyotopik seyreltme ile kimyasal olarak sentezlenen deuterize 1-AG ile kütle spektrometresi ile birleşen yüksek performanslı sıvı kromatografisi kullanılarak başarılı bir şekilde saptandı ve ölçüldü. Örnek bir, deuterated standart 1-AG ile hazırlanmış, örnek iki standart olmadan ise.

Örnek bir ve üç deki deutrated standardın orijinal konsantrasyonu 1,000 ppb'nin her biri olduğu için, pik alan oranından örnek bir ve örnek üç için 360 ppb numuneiçin 2-AG'nin endojen konsantrasyonunun hesaplanması mümkündür ve ortalama 350 ppb verir. Oranlar, izole edilmiş iki örnek için sırasıyla 2-AG'nin tepe alanları ile 1-AG'nin deuterated alanları arasında bir kalite olarak hesaplandı. Her ikisi de deuterated standart çıkarma için önceki eklendi.

Kolesterol ticaretinin geliştirilmesinde 2-AG'nin son zamanlarda keşfedilen önemi ve lipidlerin bu süreci nasıl etkilediğine dair bilgi eksikliği göz önüne alındığında, bu endofanabinoid için güvenilir bir tespit yöntemi gerekliydi. Burada rapor edilen basit ve sağlam sentetik bir yöntemin, kısırlaştırılmış analog 2-AG elde etmek için başarılı bir şekilde geliştirilmesi bu protokolün önemli bir adımdı. Monoacylglycerols ölçmek için bildirilen yöntemlerin çoğu genellikle düzenli depolama koşulları altında pahalı ve kararsız ticari olarak mevcut analitik standartların kullanımını içerir, onları düşük bütçeli laboratuvarlar için ulaşılmaz hale.

Ancak, bu yöntem daha erişilebilir başlangıç malzemeleri kullanarak standart bir sentez önererek bu çözer. Sentetik yöntem, daha düşük bir bütçeyle bile en az ekipman ve reaktanlara erişim ile herhangi bir laboratuvarda yapılması için ideal hale, gerekli sofistike koşullar olmadan düz ileri. Özetle, bu yeni prosedür, c.elegans kolesterol ticaretinde bu endofabinoidlerin rolünün açıklamasından sonra ortaya çıkan bazı soruların cevaplanmasına yardımcı olacak 2-AG'yi tespit etmenin ve ölçmenin doğrudan ileri ve tekrarlanabilir bir yolunu açıklamaktadır.