Name: Otomatik görüntü Işleme kullanarak Fission ve budding yeasts lipid damlacık Içeriğinin Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Öğrenin, otomatik görüntü işleme ile maya hücrelerinde lipid damlacıklarının nicel analizini. Bu yöntem, Schizosaccharomyces pombe, S. japonicus ve Saccharomyces cerevisiae türlerinde yüksek verimli lipid depolama değerlendirmesi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Charles Üniversitesi hibe PRIMUS/MED/26, GAUK 1308217 ve SVV 260310 tarafından desteklenmektedir. Biz mikroskobik ve görüntü analizi boru hattı gelişimi ile ilgili yardım için Ondřej Šebesta teşekkür ederiz. S . cerevisiae suşları için regenex laboratuvarına, ve japonet ve Hironori Niki 'nin laboratuvarına s. multiflorum suşlar için teşekkür ederiz. Ppc1-88 strain Maya genetik kaynak merkezi Japonya tarafından sağlandı. Microskopi, Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu ve Çek Cumhuriyeti 'nin devlet bütçesi tarafından finanse edilen Konfokal ve floresans mikroskopi laboratuvarı 'nda yapılmıştır (Proje No. CZ. 1.05/4.1.00/16.0347 ve CZ. 2.16/3.1.00/21515).

1. çözüm ve medyanın hazırlanması
<ol><li>
Lipid boyama çözeltisi hazırlayın.
	<ol>
<li>Hisse senedi lipid boyama çözeltisi hazırlamak için 10 mg BODIPY 493/503 susuz DMSO (son konsantrasyon 1 mg/mL) on mL içinde çözülür. Tartım sırasında malzemenin kaybını önlemek için 10 mg BODIPY 493/503 şişenin tüm içeriğini çözün. Dikkat: DMSO deriden geçebilir. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyin.</li>
		<li>1 mg/mL BODIPY 493/503 stok çözeltisi ve 900 μL susuz DMSO (son konsantrasyon 0,1 mg/mL) 100 μL 'yi karıştırarak çalışma lipid boyama çözümünü hazırlayın.</li>
		<li>Hisse senedi ve çalışma çözümlerini ve-20 °C ' de depolayın. Not: Çözünmüş BODIPY 493/503,-20 °C ' de birkaç yıl istikrarlı. Ancak, çözümün nem ve ışıkta korunması gerekir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücre sınırı görselleştirme için stok çözüm hazırlamak için, çözülür 25 Cascade mavi dekstran mg (tüm şişe) içinde 2,5 ml deiyonize su (son konsantrasyon 10 mg/ml). Hisse senedi çözümünü ve deposundan-20 °C ' de ışık korumalı.</li>
	<li>Mikroskop slayt kaplama çözeltisi hazırlamak için, 5 mL deiyonize su (son konsantrasyon 1 mg/mL) içinde soya lağı 5 mg çözülür. Ayin solüsyonu ve-80 °C ' de depolar. Not: Saat-80 °c ' de birkaç yıl boyunca lektin çözeltisi kararlı. Şu anda kullanılmakta olan aliquots-20 °C ' de depolanabilir.</li>
	<li>
Yetiştirme medyasını hazırlayın.
	<ol>
<li>S. pombe ve s. japonicus için karmaşık YES ekimi medyası 400 ml hazırlamak Için, bir 500 ml şişe ve Otoklav içinde deiyonize su 340 ml (auxotrofik mutantlar için gerekirse) maya EKSTRESI ve 0,1 g SP takviyeleri 2 g çözülür. Aseptik koşullarda ayrı olarak Otoklavlanmış veya filtre Sterilized glikoz% 20 (w/v) 60 ml ekleyin.</li>
		<li>S. pombe ve s. japonicus için tanımlanan EMM ekimi Orta 400 ml hazırlamak Için, bir 500 ml şişe ve Otoklav içinde deiyonize su 360 ml dekstroz olmadan EMM suyu 4,9 g çözülür. Aseptik koşullarda ayrı olarak Otoklavlanmış veya filtre Sterilized glikoz% 20 (w/v) 40 ml ekleyin. Not: S. pombe ve s. multiflorum ekimi genel kurallar için sırasıyla25 ve26bakın.</li>
		<li>Saccharomyces cerevisiaeiçin karmaşık YPAD yetiştirme ortamının 300 ml hazırlamak için, bir 500 ml şişe ve Otoklav içinde 270 ml deiyonize su, 6 gr pepton ve 30 mg adenin sülfat, 3 g maya özü, çözülür. Aseptik koşullarda 30 ml% 20 (w/v) ayrı Otoklavlanmış veya filtre sterilize glikoz ekleyin.</li>
		<li>S. cerevisiae için tanımlanan minimal orta 300 ml hazırlamak için, bir 500 ml şişe ve otoklav Içinde 270 ml deiyonize su (amino asitler olmadan) Maya nitrojen tabanı 2 g çözülür. Aseptik koşullarda 30 ml% 20 (w/v) ayrı Otoklavlanmış veya filtre sterilize glikoz ekleyin. Not: S. cerevisiae ekimi hakkında genel yönergeler için bakınız27.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. hücre ekimi
<ol><li>
S. pombe veya s. multiflorum 'u üstel veya erken sabit aşamaya yetiştirmek.
	<ol>
<li>Sabah, taze fisyon Maya biyokütle ile Evet orta 5 ml aşılamak. 32 °C ' de birkaç saat boyunca sallama (180 rpm) ile kulbe yapın. Not: Tüm yetiştirmeler için, uygun havalandırma sağlamak için kültür hacmi 10 kat sahip Erlenmeyer şişeler kullanın. Bazı laboratuvarlar 30 °c ' de fisyon mayını büyütmeyi tercih eder, ancak 32 °c ' nin ekimi sıcaklığı hücrelere zararlı etkileri olmadan daha kısa ikiye katlama süreleri ile sonuçlanır, böylece bir deney yapmak için gereken toplam süreyi azaltır25,28 .</li>
		<li>Aynı günün geç öğleden sonra (ekimi en az 6 saat sonra), bir 10 mL final kültürü hacim için taze YES orta ile kültür seyreltir böylece istenilen optik yoğunluğa ulaşır (OD) (veya hücre/mL sayısı) ertesi sabah, ve s ile 32 °C içinde kuluçka (180 rpm). Seyreltme faktörü (kullanım denklem 1) doğru belirlemek için her kullanılan gerinim iki katına zaman bilmek avantajdır. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59889/59889eq01v3.jpg"> Burada vkültürü seyreltme için gerekli Preculture hacmi, vfinal yeni kültürün toplam hacmi (Standart yetiştirmeler IÇIN 10 ml), odfinal istenilen od ulaşmak için Ertesi sabah, odakım Şu anda ölçülen od preculture, t hasat kadar hücre büyüme zamanı, tlag lag faz süresi (Laboratuvar koşullarına bağlıdır, ihtiyacı ampirik olarak tanımlanabilir) ve tdt gerilimin ikiye katlama zamanı. Not: Üstel fazlı hücreler analiz edilecek olduğunda, bu dramatik Hücre fizyolojisi (LD içeriği dahil) birkaç sonraki nesiller için değiştirir gibi precultures sabit aşamaya ulaşmak izin vermeyin.</li>
		<li>Görüntüleme günü sabahı, kültür gerekli olandan biraz daha yüksek OD ulaştı (üstel fazlı hücreler durumunda), taze Evet ile seyreltmesi ve LDs boyama önce en az iki kat daha fazla kez kuluçka devam. Aksi takdirde doğrudan (Bölüm 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
S. cerevisiae 'yi üstel ve sabit aşamaya büyütmeye.
	<ol>
<li>Öğleden sonra, az miktarda taze tomurcuklanan Maya biyokütle ile 10 ml YPAD orta aşılamak ve sallama (180 rpm) ile 30 °c ' de gece inkük.</li>
		<li>Görüntüleme günü sabahı, 10 mL YPAD Orta içinde OD 0,1 için kültür seyreltmek ve gerekli OD (örneğin, OD 1 üstel faz için) büyür. Adım 2.1.2 ' de açıklandığı gibi herhangi bir kültür seyreltme gerçekleştirin. Boyama işlemine devam edin (Bölüm 3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. lipid damlacık boyama
<ol><li>Her örnek için bir mikroskop kapak kayma hazırlamak görüntülenmiş. Yatay olarak konumlandırılmış pipet ucunun uzun tarafını kullanarak, 1 μL slayt kaplama çözümünü temiz bir kapak fişi üzerine yayın. Kaplama çözümünün tamamen kurumasına izin verin ve kapak fişelerini tozsuz bir ortamda saklayın. Not: Cam kaydırakları ve kapakların kullanılması gerekirse önce temizlenebilir. Temizlik prosedürü, bulaşık deterjanı ile yıkanmak, su ile durulama, gecede% 3 hidroklorik asit içinde ıslatılması ve distile suyu ile yıkamadan oluşur. Temizlenmiş slaytlar ve coverfiş kullanım kadar saf etanol depolanır.</li>
	<li>Hücre kültürünün OD veya hücre/mL sayısı, gerektiği gibi ölçün. Karşılaştırılabilir deneysel koşullar sağlamak için tüm test suşları arasında benzer değerlere ulaşmaya çalışın.</li>
	<li>Her hücre kültürünün 1,5 ml 'Lik mikro santrifüj tüpüne pipet 1 mL. Sadece S. cerevisiae için, slayt kaplama solüsyonu 5 μL ekleyin, kısa bir süre girdap ve 30 °c ' de 5 dak.</li>
	<li>Her kültürüne 1 μL lipid boyama çözeltisi ekleyin ve kısaca Vortex. Ardından 10 μL hücre sınırı görselleştirme çözümü ve Vortex kısaca ekleyin. Not: Her iki lekelerin önceden karışık çözümlerini, bu BODIPY 493/503 flüoresan aşındırmasına yol açan şekilde hazırlamaz.</li>
	<li>Santrifüjleme (1.000 x g, 3 dak, RT) ile hücreleri toplayın ve neredeyse tüm süpernatant Kaldır (~ 950 μL). Geri kalan supernatant hücreleri resuspend.</li>
	<li>2 μL pipet yoğun hücre süspansiyonunun bir lağı kaplı kapak slip ve temiz bir mikroskop slayt üzerine yerleştirin. Hücreler bir monolayer oluşturmalıdır. Görüntüdeki eserler en aza indirmek için mümkün olduğunca çabuk mikroskobik (Bölüm 4) ilerleyin; aynı anda iki numune en fazla işlem.</li>
</ol>4. mikroskop ve görüntüleme ayarı
<ol><li>
Görüntüleme koşullarını optimize edin. Not: mikroskobun ayarlanması, numunenin zarar görmesine ve sonuçları eğrilmesine neden olabilecek güçlü ışık kaynaklarına uzun pozlama gerektirir. Bu nedenle, LD ölçümü için daha fazla kullanılamaz özel bir örnek slayt kullanarak görüntüleme koşullarını ayarlayın.<ol>
<li>Faz kontrastı veya diferansiyel parazit kontrastı (DıC) kullanarak hücrelere odaklanın. Not: Faz kontrast veya DıC görüntüleri referans için alınabilir, ancak otomatik görüntü analizi adım sırasında kullanılmaz.</li>
		<li>Tüm hücre hacminin yayılma z-yığını ayarlarını ayarlayın. Toplam dikey uzaklık hücre boyutuna bağlıdır; Optik dilim sayısı, hedefin sayısal Diyaframına bağlıdır (z eksenindeki nokta yayılma fonksiyonu). Odağı merkezi odak düzlemine göre taşımak için ayarlayın. Not: En iyi dilim sayısı genellikle mikroskop kontrol yazılımı tarafından ayarlanır ve el ile hesaplanmalıdır gerekmez. Tipik hücre genişlikleri s. pombeiçin 3-5 μm, s. multiflorumiçin 4-7 μm ve s. cerevisiaeiçin 3-7 μm ' dir.</li>
		<li>Görüntü LDs için, yeşil kanalda ışık yoğunluğu ve pozlama süresini ayarlayın (BODIPY 'nin uyarılması ve emisyon Maxima değeri sırasıyla 493 ve 503 nm 'dir). Not: BODIPY 493/503 çok parlak bir fluorokrom; Ancak, aşırı güçlü ışık yoğunluğu ile hızla ağartabilir alabilirsiniz. Dahası, LDs canlı hücrelerde mobil, böylece pozlama süresini en aza indirmek ve tam yeşil kanal z-yığını ilk yakalama (mavi kanala geçmeden önce) bulanık eserler önlemek için. Ayrıca, doymuş pikselleri önlemek için sinyal yoğunluğu için kameranın doğrusal aralığını dikkate alın.</li>
		<li>Görüntü hücre sınırlarını, mavi kanalda ışık yoğunluğu ve pozlama süresini ayarlamak (uyarma ve emisyon Maxima Cascade Blue dekstran vardır 400 ve 420 nm, sırasıyla). Not: Mavi kanaldaki sinyal yoğunluğu görüntü segmentasyonu için gereklidir, ancak LD ölçümleme için kullanılmaz. Bu nedenle, bu kanalda en iyi ayarları analiz için önemli değildir.</li>
		<li>Mümkünse, standart koşullarda birden fazla numunenin görüntülemelerini kolaylaştırmak için mikroskop kontrol yazılımında otomatik deneysel bir iş akışı oluşturun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Görüntüleme koşulları iyileştirildikten sonra, ölçme için kullanılacak görüntü örnekleri. Hücrelere odaklanın ve bunları yeşil ve mavi kanallarda adım 4,1 ' de açıklandığı şekilde görüntü. Not: Tüm görüntüler, örnekler arasında karşılaştırmaya izin vermek için aynı ayarları kullanarak elde edilmelidir. Sağlam, temsili veriler elde etmek için örnek başına birden fazla görünüm alanı görüntü.</li>
	<li>Mavi ve yeşil kanal z-yığını görüntüleri 16-bit çok katmanlı TIFF dosyaları (yani, görünüm alanı başına iki dosya) olarak kaydedin. İlgili dosya adlarına "yeşil" veya "mavi" sözcükleri ekleyin. Görüntü analizine devam edin (Bölüm 5).</li>
</ol>5. görüntü analizi
<ol><li>
Elde edilen görüntülerin kalitesini görsel olarak kontrol edin.
	<ol>
<li>Imagej29,30 veya diğer uygun görüntü analiz yazılımında mikroskobik görüntüleri açın.</li>
		<li>Satın alma sırasında taşınan önemli sayıda hücre içeren tüm görüntü yığınlarını kaldırın (ve böylece bulanıklık yapıları oluşturulur).</li>
		<li>Mavi kanalda yüksek floresan hücre içermeyen parçacıklar içeren herhangi bir görüntü yığınını kaldırın (örn., mikroskop kaydırağında kir veya kapak kayma, ekimi ortamında kirleri). Not: Mavi kanaldaki çok parlak hücre dışı nesneler hücre algılama yapıları oluşturabilir veya çevresindeki hücrelerin algılanmasını engelleyebilir.</li>
		<li>Ölü hücrelerin büyük bir kısmını içeren herhangi bir görüntü yığınını kaldırın (yani, canlı hücrelere kıyasla artan mavi floresans içeren hücreler). Not: Örnekteki ölü hücrelerin küçük bir kısmı varlığı genellikle bir sorun değildir ve bu hücreler analiz sırasında otomatik olarak atılır, bazı ölü veya ölüyor hücreler bazen segmentasyon algoritması tarafından canlı hücreler olarak tanınabilir ve böylece bildirilen sonuçları eğriltme.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
MATLAB yazılımındaki görüntüleri analiz edin.
	<ol>
<li>Bir ana klasör oluşturun ve tüm MATLAB komut dosyalarını bu konuma kopyalayın.</li>
		<li>Bir alt klasör ("pombe", "cerevisiae" veya "japonicus") oluşturun ve giriş TIFF görüntü dosyalarını bu konuma kopyalayın.</li>
		<li>MATLAB Başlat, açık Script MAIN. m ve çalıştırın. Menüde analiz edilecek maya türleri seçin ve görüntü işleme başlar. Not: Hücre ve LD algılama için gerekli parametrelerin bazıları belirli türler için önceden ayarlanmıştır, diğerleri görüntü işleme sırasında otomatik olarak belirlenir. Önceden ayarlanan değerler ampirik olarak belirlendi ve objektif büyütme, kamera tipi ve hassasiyet ve görüntüleme ayarları gibi çeşitli faktörlere bağlıdır. Gerekirse, kullanıcılar kendi deneysel kurulumunu daha iyi yansıtacak şekilde organizmaya özgü hazır ayarları değiştirmek için komut dosyalarını düzenleyebilir. Yani, hücre tanıma kabul edilebilir nesne boyutları "minArea" ve "maxArea" parametreleri tarafından verilir ve nesne sınırları içinde doldurulmuş birimin en az kesir "Solidity" parametresi tarafından verilir. LD tanıma için, parlaklık eşik "TH" parametresi tarafından verilir (değeri çoğunlukla görüntü bit derinliği ve floresan sinyal yoğunluğu tarafından etkilenir), ve maksimum kabul edilebilir LD boyutu "MaxArea" parametresi tarafından verilir.</li>
		<li>Elektronik tablo Düzenleyicisini veya istatistiksel paketi kullanarak çıktı dosyalarını gerektiği gibi inceleyin ve işleyin; iş akışı, noktalı virgülle ayrılmış CSV dosyaları ve algılanan hücre nesneleri ve LDs ile bölümlenmiş TIFF dosyaları üretir. Not: İş akışı, her hücre nesnesinin birden çok bitişik hücreden oluşabileceği arka plan ve hücre nesnelerine görüntüleri kesebilir. Bu nedenle, "xxxx_cells. csv" dosyalarında çıktı tek hücreli verileri temsil etmez ve yalnızca birim-hücre-birim ölçümleri hesaplamak için kullanılmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Koch, B., Schmidt, C., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Storage+lipids+of+yeasts%3A+a+survey+of+nonpolar+lipid+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae%2C+Pichia+pastoris%2C+and+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Storage lipids of yeasts: a survey of nonpolar lipid metabolism in Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Yarrowia lipolytica.</a> FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 892-915 (2014).</li>
<li>Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+the+fat%3A+lipid+droplets+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Balancing the fat: lipid droplets and human disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).</li>
<li>Lazar, Z., Liu, N., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Holistic+Approaches+in+Lipid+Production+by+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Holistic Approaches in Lipid Production by Yarrowia lipolytica.</a> Trends in Biotechnology. 36 (11), 1157-1170 (2018).</li>
<li>Kim, D. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+a+genome-wide+set+of+gene+deletions+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 1628-1629 (2010).</li>
<li>Giaever, G., Nislow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+deletion+collection%3A+a+decade+of+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The yeast deletion collection: a decade of functional genomics.</a> Genetics. 197 (2), 451-465 (2014).</li>
<li>Meyers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+and+neutral+lipid+composition+of+lipid+droplets+isolated+from+the+fission+yeast%2C+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology+%28Seoul%2C+Korea%29%22%5BJournal%5D)">The protein and neutral lipid composition of lipid droplets isolated from the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe.</a> Journal of Microbiology (Seoul, Korea). 55 (2), 112-122 (2017).</li>
<li>Meyers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Droplets+Form+from+Distinct+Regions+of+the+Cell+in+the+Fission+Yeast+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic+%28Copenhagen%2C+Denmark%29%22%5BJournal%5D)">Lipid Droplets Form from Distinct Regions of the Cell in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 17 (6), 657-659 (2016).</li>
<li>Long, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet+de+novo+formation+and+fission+are+linked+to+the+cell+cycle+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic+%28Copenhagen%2C+Denmark%29%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 13 (5), 705-714 (2012).</li>
<li>Yang, H. J., Osakada, H., Kojidani, T., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet+dynamics+during+Schizosaccharomyces+pombe+sporulation+and+their+role+in+spore+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet dynamics during Schizosaccharomyces pombe sporulation and their role in spore survival.</a> Biology Open. , 8(2016).</li>
<li>Aoki, K., Shiwa, Y., Takada, H., Yoshikawa, H., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+nuclear+envelope+dynamics+via+APC%2FC+is+necessary+for+the+progression+of+semi-open+mitosis+in+Schizosaccharomyces+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+To+Cells%3A+Devoted+To+Molecular+%26+Cellular+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Regulation of nuclear envelope dynamics via APC/C is necessary for the progression of semi-open mitosis in Schizosaccharomyces japonicus.</a> Genes To Cells: Devoted To Molecular & Cellular Mechanisms. 18 (9), 733-752 (2013).</li>
<li>Karolin, J., Johansson, L. B. A., Strandberg, L., Ny, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+and+Absorption+Spectroscopic+Properties+of+Dipyrrometheneboron+Difluoride+%28BODIPY%29+Derivatives+in+Liquids%2C+Lipid+Membranes%2C+and+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Fluorescence and Absorption Spectroscopic Properties of Dipyrrometheneboron Difluoride (BODIPY) Derivatives in Liquids, Lipid Membranes, and Proteins.</a> Journal of the American Chemical Society. 116 (17), 7801-7806 (1994).</li>
<li>Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+fluorescence-based+method+identifies+protein+phosphatases+regulating+lipid+droplet+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism.</a> PloS One. 5 (10), e13692(2010).</li>
<li>Sitepu, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+high-throughput+Nile+red+fluorescence+assay+for+estimating+intracellular+lipids+in+a+variety+of+yeast+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species.</a> Journal of Microbiological Methods. 91 (2), 321-328 (2012).</li>
<li>Rostron, K. A., Lawrence, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nile+Red+Staining+of+Neutral+Lipids+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Nile Red Staining of Neutral Lipids in Yeast.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1560, 219-229 (2017).</li>
<li>Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra-Sánchez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Index+Determination+by+Liquid+Fluorescence+Recovery+in+the+Fungal+Pathogen+Ustilago+Maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), 1-6 (2018).</li>
<li>Gupta, A., Dorlhiac, G. F., Streets, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+lipid+droplets+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of lipid droplets in single cells.</a> The Analyst. , (2018).</li>
<li>Wolinski, H., Bredies, K., Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+lipid+metabolism+in+yeast%3A+from+4D+analysis+to+high+content+screens+of+mutant+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of lipid metabolism in yeast: from 4D analysis to high content screens of mutant libraries.</a> Methods in Cell Biology. , 108-365 (2012).</li>
<li>Campos, V., Rappaz, B., Kuttler, F., Turcatti, G., Naveiras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput%2C+nonperturbing+quantification+of+lipid+droplets+with+digital+holographic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">High-throughput, nonperturbing quantification of lipid droplets with digital holographic microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 59 (7), 1301-1310 (2018).</li>
<li>Ranall, M. V., Gabrielli, B. G., Gonda, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+imaging+of+neutral+lipid+droplets+with+1%2C6-diphenylhexatriene%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">High-content imaging of neutral lipid droplets with 1,6-diphenylhexatriene.</a> BioTechniques. 51 (1), 35-42 (2011).</li>
<li>Schnitzler, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nile+Red+Quantifier%3A+a+novel+and+quantitative+tool+to+study+lipid+accumulation+in+patient-derived+circulating+monocytes+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Nile Red Quantifier: a novel and quantitative tool to study lipid accumulation in patient-derived circulating monocytes using confocal microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 58 (11), 2210-2219 (2017).</li>
<li>Bombrun, M., Gao, H., Ranefall, P., Mejhert, N., Arner, P., Wählby, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+high-content%2Fhigh-throughput+microscopy+analysis+of+lipid+droplets+in+subject-specific+adipogenesis+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A+the+journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Quantitative high-content/high-throughput microscopy analysis of lipid droplets in subject-specific adipogenesis models.</a> Cytometry. Part A the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (11), 1068-1077 (2017).</li>
<li>Capus, A., Monnerat, M., Ribeiro, L. C., de Souza, W., Martins, J. L., Sant’Anna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+high-content+image+analysis+for+quantitatively+estimating+lipid+accumulation+in+oleaginous+yeasts+with+potential+for+use+in+biodiesel+production%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">Application of high-content image analysis for quantitatively estimating lipid accumulation in oleaginous yeasts with potential for use in biodiesel production.</a> Bioresource Technology. 203, 309-317 (2016).</li>
<li>Lv, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+gene+products+that+control+lipid+droplet+size+in+yeast+using+a+high-throughput+quantitative+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta.+Molecular+and+Cell+Biology+Of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Identification of gene products that control lipid droplet size in yeast using a high-throughput quantitative image analysis.</a> Biochimica et biophysica acta. Molecular and Cell Biology Of Lipids. 1864 (2), 113-127 (2018).</li>
<li>Zach, R., Tvarůžková, J., Schätz, M., Ťupa, O., Grallert, B., Převorovský, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+defects+in+fission+yeast+lipid+metabolism+%E2%80%9Ccut%E2%80%9D+mutants+are+suppressed+by+ammonium+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">Mitotic defects in fission yeast lipid metabolism “cut” mutants are suppressed by ammonium chloride.</a> FEMS Yeast Research. 18 (6), 1-7 (2018).</li>
<li>Petersen, J., Russell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+the+Environment+of+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Growth and the Environment of Schizosaccharomyces pombe.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (3), (2016).</li>
<li>Aoki, K., Furuya, K., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schizosaccharomyces+japonicus%3A+A+Distinct+Dimorphic+Yeast+among+the+Fission+Yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Schizosaccharomyces japonicus: A Distinct Dimorphic Yeast among the Fission Yeasts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2017).</li>
<li>Curran, B. P. G., Bugeja, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+investigations+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Basic investigations in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , 1-14 (2014).</li>
<li>Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods in Enzymology. 470 (10), 759-795 (2010).</li>
<li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageJ+ecosystem%3A+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Nakamura, T., Pluskal, T., Nakaseko, Y., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+coenzyme+A+synthesis+in+fission+yeast+causes+defective+mitosis%2C+quiescence-exit+failure%2C+histone+hypoacetylation+and+fragile+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Impaired coenzyme A synthesis in fission yeast causes defective mitosis, quiescence-exit failure, histone hypoacetylation and fragile DNA.</a> Open Biology. 2 (9), 120117(2012).</li>
<li>Furuya, K., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+heterothallic+haploid+and+auxotrophic+mutants+of+Schizosaccharomyces+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Isolation of heterothallic haploid and auxotrophic mutants of Schizosaccharomyces japonicus.</a> Yeast. 26 (4), 221-233 (2009).</li>
<li>Ivnitski-Steele, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Nile+red+as+a+fluorescent+substrate+of+the+Candida+albicans+ATP-binding+cassette+transporters+Cdr1p+and+Cdr2p+and+the+major+facilitator+superfamily+transporter+Mdr1p%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p.</a> Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).</li>
<li>Wolinski, H., Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+analysis+of+lipid+droplet+metabolism+and+dynamics+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 457 (1), 151-163 (2008).</li>
<li>Graml, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+Multiprocess+survey+of+machineries+that+control+and+link+cell+shape%2C+microtubule+organization%2C+and+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A genomic Multiprocess survey of machineries that control and link cell shape, microtubule organization, and cell-cycle progression.</a> Developmental Cell. 31 (2), 227-239 (2014).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Lipid metabolizması ve düzenlenmesi anlayışı hem temel biyoloji, hem de klinik ve biyoteknolojik uygulamalar için önemlidir. LD içeriği, hücrelerin lipid metabolizması durumunun uygun bir şekilde okunmasını, Floresan Mikroskobu ise LD içerik belirlenmesi için kullanılan önemli yöntemlerden biri olarak temsil eder. Sunulan protokol, tek LDs 'nin üç farklı ve morfolojik olarak farklı Maya türlerinde otomatik olarak algılanmasını ve niceliksel açıklamasını sağlar. Bizim bilgi için, hiçbir benzer araçlar, fisyon Mayalar için...

Lipidler hücresel enerji ve karbon metabolizması, membran bileşenlerinin sentezini ve biyoaktif maddelerin üretimini önemli roller oynar. Lipid metabolizması çevresel koşullara, besin mevcudiyeti ve hücre döngüsü aşaması1' e göre ince ayarlı. İnsanlarda lipid metabolizması obezite, tip II diyabet ve kanser2gibi hastalıklara bağlı olmuştur. Endüstride, Mayalar gibi mikroorganizmalar tarafından üretilen lipidler, umut verici bir yenilenebilir dizel yakıt kaynağını temsil eder3. Hücreler sözde lipid damlacıkları (LDs) nötr lipidler depolar. Bu evrimsel olarak koruyucu organları triakilgliserler, steril esterler, bir dış fosfolipid Tek tabakalı ve ilişkili proteinler1oluşur. LDs endoplazmik reticulum kaynaklanan, hücre döngüsü veya büyüme faz dinamikleri uygulamak, ve hücresel lipid homeostazı için önemlidir1. LD numarası ve morfoloji, çeşitli büyüme koşullarında veya mutantların bir panelini taramasında lipid metabolizmasını asırken uygun bir vekil olarak kullanılabilir. Dinamik doğası göz önüne alındığında, bireysel LDs özelliklerini analiz yeteneğine teknikleri lipid metabolizması çalışmaları özellikle ilgi vardır.
Çeşitli maya türleri lipid ile ilgili metabolik yolları ve düzenlemeleri tanımlamak için kullanılan, ya da biyoteknolojide ilginç bileşikler veya yakıtlar üretmek için kullanılan1. Ayrıca, model Mayalar için, gibi tomurcuklanan Maya Saccharomyces cerevisiae veya uzaktan ilgili fisyon Maya mıtosaccharomyces pombe, Genom-geniş silme gerinim kütüphaneler kullanılabilir yüksek verim için kullanılabilir ekranlar4,5. Son zamanlarda ld kompozisyon ve dinamikleri S. pombeaçıklanan6,7,8,9, ve lipid metabolizması ile ilgili mutantlar gelişmekte olan model Maya izole edilmiştir Asoaccharomyces multiflorum10.
LD içerik ve dinamikleri incelemek için sayısız teknikler mevcuttur. Çoğu, Nile Red veya BODIPY 493/503 gibi lipophilik boyalar ile LDs boyama çeşit istihdam. İkincisi daha dar uyarma ve emisyon spektrumunu gösterir ve fosfolipidler (membranların)11' in aksine nötr lipidlere (LDs) doğru özgüllüğü artırmıştır. Fluorimetrik ve akış-sitometri yöntemleri, depolama lipid içeriğini etkileyen genler ve büyüme koşullarını ortaya çıkarmak için çeşitli mantar türlerde başarıyla kullanılmıştır12,13,14,15. Bu yöntemler yüksek verimlilik uygulamaları için uygun olmakla beraber, hücrelerde bireysel LDs 'nin sayılar ve morfolojisi ölçülemez, bu da büyüme koşulları ile genotürleri arasında önemli ölçüde farklılık gösterebilir. Tutarlı Raman saçılma veya dijital holografik microskopi ld düzeyinde veri verim, ancak özel pahalı ekipman16,17,18gerektiren etiket içermeyen yöntemlerdir. Diğer taraftan floresans mikroskobu, LD içeriğiyle ilgili ayrıntılı veriler sağlayabilir, yaygın olarak kullanılabilen enstrümanlar ve görüntü analiz yazılım araçlarını kullanarak. Çeşitli analiz iş akışları var ki, görüntü verilerinden hücre/ld algılamada farklı derece sofistike ve otomasyon özelliğine sahiptir ve büyük LDs19,20 ile Metazoan hücreler gibi değişik hücre türleri için optimize edilmiştir , 21ya da tomurcuklanan17,22,23. Bu yaklaşımlardan bazıları yalnızca 2D (örneğin, maksimum projeksiyon görüntülerde) çalışır, bu da hücresel LD içeriğini güvenilir bir şekilde tanımlamayabilir. Bilgi için, herhangi bir alet ld içerik ve morfoloji fisyon Maya mikroskobik veri belirlenmesi için yok. Otomatik ve sağlam LD seviyesi analizlerinin geliştirilmesi, yüksek hassasiyet ve gelişmiş istatistiksel güç getirir ve çoklu Maya türlerinde ideal olarak nötr lipid içeriği hakkında zengin bilgiler sağlar.
Maya hücrelerinin 3D floresan mikroskopisi görüntülerden LD içerik analizi için bir iş akışı geliştirdik. Canlı hücreler, LDs 'nin görselleştirilmesi ve sırasıyla hücre sınırlarını belirlemek için bodipy 493/503 ve Cascade Blue dekstran ile lekelenecektir. Hücreler cam slaytlar üzerinde immobilize ve standart bir epifluorescence mikroskop kullanarak z-yığını görüntüleme tabi tutulur. Görseller, istatistiksel analizler için yaygın olarak kullanılan (ticari) bir paket olan MATLAB 'de uygulanan otomatik bir boru hattı tarafından işlenir. Ardışık düzen, Görüntü önişleme, segmentasyon (hücreler vs. arka plan, ölü hücrelerin kaldırılması) ve LD kimliği gerçekleştirir. LD boyutu ve floresan yoğunluğu gibi zengin LD düzeyinde veriler, daha sonra büyük elektronik tablo yazılım araçlarıyla uyumlu sekmeli bir formatta sağlanır. İş akışı, azot kaynağının mevcudiyeti S. pombe24' te lipid metabolizmasında etkisini belirlemek için başarıyla kullanıldı. Şimdi, s. pombe, s. multiflorum ve s. cerevisiae'deki iş akışının işlevselliğini, hücresel ld içeriğini etkileyen büyüme koşullarını veya mutantları kullanarak gösteriyoruz.

<table><tbody><tr><td>12 bit monokromatik CCD kamera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG</td><td>Hamamatsu</td><td>&nbsp;</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Adenin hemisülfat tuzu, > % 99</td> <td>Merck</td><td>A9126-25G</td> <td>& nbsp;</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503 (4,4-Difloro-1,3,5,7,8-Pentametil-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3922</td><td>nötr lipid boyama için</td></tr><tr><td>D- (+) - Glikoz, &; %99,5</td> <td>Merck</td><td>G7021</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dekstran, Cascade Blue, 10.000 MW, Anyonik, Lizin Sabitlenebilir</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1976</td><td>hücrelerin negatif boyanması için</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit, & ge; % 99,5</td> <td>Merck</td><td>D4540</td><td>veya daha yüksek saflıkta, moleküler eleklerde susuz tutun</td></tr><tr><td>Dekstroz içermeyen EMM suyu</td><td>Formedium</td><td>PMD0405</td><td>ortamı ayrıca ayrı bileşenlerden de hazırlanabilir</td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ yazılımı</td><td>NIH</td><td>&nbsp;</td><td>veya eşdeğeri; mikroskobik verilerin görsel olarak incelenmesi için</td></tr><tr><td>Yüksek hassasiyetli kapak camları, 22 mm x 22 mm, No 1.5</td><td>VWR</td><td>630-2186</td><td>herhangi bir # 1.5 kapak camı kullanın</td></tr><tr><td>MATLAB için Görüntü İşleme Araç Kutusu, sürüm 10.0</td><td>Mathworks</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Slaytlarda hücre immobilizasyonu için</td> <td>Glycine max (soya fasulyesi)</td> <td>Merck</td><td>L1395'ten</td> lektin</tr><tr><td>MATLAB yazılımı, sürüm 9.2</td><td>Mathworks</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop slaytı, 26 mm x 76 mm, 1 mm kalınlık</td><td>Örgü Cam</td><td>L762601.2</td><td>, mikroskop tablanıza uyan herhangi bir mikroskop slaytı kullanın, hücreleri yüklemeden önce iyice temizleyin</td></tr><tr><td>Otomatik z ekseni objektif hareketine sahip Olympus CellR mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>&nbsp;</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Pentaband filtre seti</td><td>Semrock</td><td>F66-985</td><td>parlak alan, yeşil ve mavi kanallar yeterli</td></tr><tr><td>MATLAB için Sinyal İşleme Araç Kutusu, sürüm 7.4</td><td>Mathworks</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SP takviyeleri</td><td>Formedium</td><td>PSU0101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr>MATLAB<td>&nbsp;</td> <td>çalıştırabilen standart ofis bilgisayarı</td>;<td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MATLAB için İstatistik ve Makine Öğrenimi Araç Kutusu, sürüm 11.1</td><td>Mathworks</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikrobiyoloji için üniversal pepton M66</td><td>Merck</td><td>1070431000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>UPLSAPO 60XO objektif</td><td>Olympus</td><td>&nbsp;</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Maya özü</td><td>Formedium</td><td>YEA03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Amino asitsiz maya azot bazı</td><td>Formedium</td><td>CYN0405</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

otomatik görüntü işleme kullanarak fission ve budding yeasts lipid damlacık içeriğinin analizi

Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

Lipid metabolizması ve düzenlenmesi hem temel hem de uygulamalı yaşam bilimleri ve biyoteknolojinin ilgisini çekmektedir. Bu bağlamda, çeşitli maya türleri lipid metabolik araştırma modelleri veya endüstriyel lipid üretimi için kullanılır. Lipid damlacıkları son derece dinamik depolama organları ve onların hücresel içerik lipid metabolik durumun uygun bir okuma temsil eder. Floresan mikroskopisi, hücresel lipid damlacıkları nicel analizinde tercih edilen bir yöntemdir, çünkü yaygın olarak kullanılabilir donanıma dayanır ve bireysel lipid damlacıkları analizine izin verir. Ayrıca, mikroskobik görüntü analizi, genel analiz verimi büyük ölçüde artan otomatik olabilir. Burada, üç farklı model Maya türü içinde bireysel lipid damlacıkları otomatik algılama ve niceliksel açıklaması için deneysel ve analitik bir iş akışı tarif: fisyon Mayalar şizofrik pombe ve Şizofreyeve tomurcuklanan Maya Saccharomyces cerevisiae. Lipid damlacıkları bodipy 493/503 ile görselleştirilebilir ve hücre sınırlarının tanımlanmanıza yardımcı olmak için kültür medyasına hücre geçirmez floresan dekstran eklenir. Hücreler yeşil ve mavi kanallarda 3D epifluorescence mikroskopiye tabi tutulur ve elde edilen z yığını görüntüleri bir MATLAB boru hattı tarafından otomatik olarak işlenir. Prosedür, büyük elektronik tabloda veya istatistiksel paketlerdeki akış analizleri için uygun olan sekmeli bir formatta hücresel lipid damlacık içeriği ve bireysel lipid damlacık özellikleri üzerinde zengin nicel verileri çıkarır. Hücre lipid metabolizmasını etkileyen çeşitli koşullarda lipid damlacık içeriğinin örnek analizlerini sağlıyoruz.

Tüm prosedür Şekil 1 ' de (tomurcuklanan Maya iş akışı benzerdir), ve aşağıda biz nasıl iş akışı çeşitli koşullarda üç farklı maya türleri ld içeriği incelemek için kullanılabilir örnekler sağlamak için fisyon mayıları özetlenmiştir bilinen hücresel LD içeriğini etkilemek için. Her örnek tek bir biyolojik deneyi temsil eder.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59889/59889fig01v2.jpg"> Şekil 1: dene...

Burada, floresan mikroorganizma ve tomurcuklanan Maya hücrelerinin floresans mikroskopisi görüntülerinin otomatik algılama ve niceliksel tanımı ile ilgili bir MATLAB uygulaması sunuyoruz.

Otomatik görüntü Işleme kullanarak Fission ve budding yeasts lipid damlacık Içeriğinin Analizi

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

Bu protokol, çeşitli maya türlerinde hücresel depolama lipid içeriğinin sayısal küçük ve büyük ölçekli analizlerini kolaylaştırır ve bunu tarafsız ve standart bir şekilde yapar. Bu teknik, mikroskobik görüntülerin hızlı bir şekilde işlenmesine olanak sağlar ve çeşitli mutantlar ve çeşitli koşullar altında yetiştirilen hücreler gibi örnekleri kolayca karşılaştırmak için ayrıntılı nicel çıktılar sağlar. Başlamak için, boyama çözümlerini, kültür ortamını ve hücreleri hazırlamak için eşlik eden metin protokolünü uygulayın.Deneyi çalıştırmadan önce hücrelerin sağlıklı ve istenilen büyüme aşamasında olduğundan emin olun. Ardından, görüntülenecek her örnek için bir mikroskop kapağı hazırlayın. Yatay olarak konumlandırılmış pipet ucunun uzun tarafını kullanarak bir mikrolitre slayt kaplama çözeltisini temiz bir kapak kaymasıüzerine yayın.Kaplama çözeltisinin tamamen kurumasını bekleyin ve kapakları tozsuz bir ortamda saklayın. Daha sonra, hücre kültürlerinin optik yoğunluklarını ölçün ve aynı büyüme aşamasında analiz edilecek kültürler için, karşılaştırılabilir deneysel koşulları sağlamak için tüm test edilmiş kültürler arasında benzer değerlere ulaşmaya çalışın. Sonra, pipet hücre kültürünün bir mililitre 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüp içine.Sadece S.cerevisiae hücreleri için, tüpe de slayt kaplama çözeltisinin beş mikrolitresini ekleyin. Sonra, kısaca tüm mikrosantrifüj tüpleri girdap, ve beş dakika sallayarak 30 santigrat derece onları kuluçka. Daha sonra, her kültür aliquot lipid boyama çözeltisi bir mikrolitre ekleyin ve kısa bir süre onları girdap.Daha sonra, hücre sınır görselleştirme çözeltisi 10 mikrolitre ekleyin ve onları kısa bir süre ikinci kez girdap. Hücreleri oda sıcaklığında üç dakika boyunca 1,000 kez yerçekimi santrifüj ederek toplayın. İpliği bittiğinde, supernatant'tan 950 mikrolitre çıkarın ve bir pipet kullanarak kalan süpernatanttaki hücreleri yeniden askıya alın.Sonra, pipet lektin kaplı bir kapak üzerine yoğun hücre süspansiyon iki mikrolitre. Daha sonra, bir hücre monokatmanı oluşturmak için temiz bir mikroskop slayt üzerine coverslip yerleştirin ve görüntüleme eserler en aza indirmek için mümkün olduğunca çabuk mikroskopi devam edin. Mikroskobun kurulması, numuneye zarar verebilecek ve sonuçları çarpıtabilecek güçlü ışık kaynaklarına uzun süre maruz kalma gerektirir.Bu nedenle, lipid damlacık nicelleştirme için daha fazla kullanılmayacak özel bir örnek slayt kullanarak görüntüleme koşulları ayarlayın. Özel örneği faz kontrastı veya diferansiyel girişim kontrast mikroskop kurulumu aşamasına yerleştirin ve hücrelere odaklanın. Mikroskobun yazılımında, Z-stack ayarlarını tüm hücre hacmine yayılabilecek şekilde ayarlayın.Toplam dikey uzaklık hücre boyutuna bağlıdır ve optik dilimlerin sayısı hedefin sayısal diyafram bağlıdır. Ardından, merkezi odak düzlemine göre hareket etmek için odak ayarlayın. Lipid damlacıklarını görüntülemek için, yeşil kanaldaki ışık yoğunluğunu ve maruz kalma süresini deneysel olarak ayarlayın.BODIPY hızla fotobleached olabilir çok parlak bir florokrom olduğu gibi görüntüleme yaparken dikkatli olun. Ayrıca, aşırı doygunluğu önlemek için pozlama süresini en aza indirin. Mobil lipid damlacıklarının bulanıklaşmasını önlemek için mavi kanala geçmeden önce tam yeşil kanal Z-yığınını yakalayın.Hücre sınırlarını görüntülemek için, mavi kanaldaki ışık yoğunluğunu ve pozlama süresini deneysel olarak ayarlayın. Mümkünse, standart koşullarda birden fazla numunenin görüntülenmesikolaylaştırılmasını kolaylaştırmak için mikroskop kontrol yazılımında otomatik bir deneysel iş akışı ayarlayın ve kullanın. Daha da önemlisi, örnekler arasında uygun karşılaştırma sağlamak için tüm görüntüler aynı ayarlar kullanılarak elde edilmelidir.Görüntüleme koşulları optimize edildikten sonra hücrelere odaklanın ve hem yeşil hem de mavi kanallarda görüntüleyin. Sağlam, temsili veriler elde etmek için örnek başına birden çok görüş alanı görüntüleyin. Mavi ve yeşil kanal Z-stack görüntülerini 16 bit, çok katmanlı TIFF dosyaları olarak kaydedin.İlgili dosya adlarına yeşil veya mavi sözcükleri eklediğinden emin olun. ImageJ'de mikroskobik görüntüleri açın ve edinme sırasında hareket eden önemli sayıda hücre içeren görüntü yığınlarını kaldırın. Bunlar, bireysel Z bölümlerinde farklı konumlarda görünür.Ardından, mavi kanalda yüksek floresan olmayan hücre parçacıkları içeren görüntü yığınlarını kaldırın. Bu genellikle görüntüleme yüzeyindeki kir veya tarım ortamındaki kirlerden kaynaklanır ve çevrelerindeki hücrelerin tespitini etkileyebilir. Ayrıca, ölü hücrelerin büyük bir oranda içeren görüntü yığınları kaldırın.Bu görüntüler canlı hücrelere göre artan mavi floresan hücreleri görüntüler. Örnekte birkaç ölü hücrenin varlığı genellikle bir sorun olmasa da ve bu hücreler analiz sırasında otomatik olarak atılırken, bazı ölü veya ölmekte olan hücreler bazen segmentasyon algoritması tarafından canlı hücre olarak tanınabilir ve böylece bildirilen sonuçları çarpıtabilir. MATLAB'da çözümlemeye başlamak için önce bir ana klasör oluşturun ve tüm MATLAB komut dosyalarını bu konuma kopyalayın.Ardından, çeşitli maya türlerinin adlarını içeren alt klasörler oluşturun ve ilgili TIFF görüntülerini bu konumlara kopyalayın. Şimdi, MATLAB'ı başlatın, ANA komut dosyasını açın. m ve komut dosyası çalıştırın.Menüde, analiz edilecek maya türlerini seçin ve görüntü işlemeye başlayın. Bir elektronik tablo düzenleyicisi veya istatistiksel paket kullanarak çıktı dosyalarını gerektiği gibi inceleyin ve işleyin. İş akışı, yarı kolondan ayrılmış CSV dosyaları ve algılanan hücre nesneleri ve lipid damlacıkları ile segmente TIFF dosyaları üretir.Burada gösterilen karmaşık EVET orta veya tanımlanan EMM orta yetiştirilen yabani tip S.pombe hücreleri vardır. EMM ortamda YES ortamda yetişen hücrelerle karşılaştırıldığında hücre hacmi birimi başına daha az lipid damlacıkları ve daha yüksek boyama yoğunluğu saptandı. Ayrıca EMM ortamda oluşan bireysel lipid damlacıkları daha büyüktü ve toplam boyama yoğunluğu arttı.Bu emm yetiştirilen hücrelerde artan depolanmış lipid içeriği önceki bulgular ile uyum içindedir. Daha sonra, bu görüntüler EVET ortamda yetiştirilen üstel ve erken sabit kültürlerden S.japonicus hücreleri göstermektedir. Sabit faza giren hücreler hücre hacmibirimi başına lipid damlacıklarının belirgin bir şekilde azaldığını gösterirken, hacim normalleştirilmiş lipid damlacık floresans yoğunluğu iki durum arasında biraz azaldı.Erken sabit faz lipid damlacıkları genellikle orta derecede büyük boyutta ve üssel büyüyen hücrelerden damlacıklar ile karşılaştırıldığında orta derecede daha yüksek toplam floresan yoğunluğu vardı. S.cerevisiae hücrelerinde üssel karşı sabit faza kadar yetiştirilen, sabit hücreler katlanarak büyüyen hücrelere göre birim başına biraz daha az lipid damlacıkları içeriyordu. Ancak, hacim normalleştirilmiş damlacık floresan yoğunluğu neredeyse iki katına çıktı.Genel lipid damlacık içeriğindeki bu keskin artış, sabit fazdaki tek tek lipid damlacıklarının çok daha yüksek floresan yoğunluğu ve hacminden kaynaklandı. Bu yordamı takiben, çıktı verileri, özetlenen sonuçların çizimlerini oluşturmak ve lipid damlacık içeriğinde gözlenen herhangi bir farklılık üzerinde istatistiksel testler yapmak için R gibi istatistiksel bir paketiçinde toplanabilir. Prensip olarak, görüntü işleme boru hattı diğer mikroorganizmalardaki lipid damlacık içeriğinin analizi veya diğer nokta benzeri hücre altı yapıları analiz etmek için kullanılabilir.

analysis-lipid-droplet-content-fission-budding-yeasts-using-automated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz maya kullanarak anket-tarama elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi (ESI / MS) gibi çok sayıda lipid türlerinin belirlenmesi için yeni bir nicel lipidomics yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, şu anda, lipidler, hassasiyet ve hız çeşitli moleküler formları çözmek için yeteneği lipid tanımlanması ve ölçülmesi için kullanılabilir yöntemleri aşıyor.

Nicel Değerlendirme Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometresi kullanarak Maya Lipidome

: 1) hücresel lipid damlacıkları izole maya hücreleri ve 2) insan plasenta sunulmuştur için iki teknikleri. Her iki prosedürlerinin merkezinde damlacıkları ihtiva eden elde edilen yüzer tabaka, hali hazırda, göz ile görselleştirilmiştir ekstre edilmiş ve saflık için Western Blot analizi ile tayin edilebilir yoğunluk gradyan santrifüj vardır.

Hücresel Lipid damlacıklar İzolasyonu: Maya Hücreleri ve insan plasentası itibaren iki Arıtma Teknikleri

Burada, triacylglycerols hücrelerdeki yüksek üretilen iş deneylerde kültürlü dinamiklerini incelemek için lipid damlacık dizin (LD dizini) elde etmek için bir protokol açıklayın. LD dizin tahlil BODIPY 493/503 kullanır kolay ve güvenilir bir yöntemdir. Bu tahlil dispendious lipid çekme ya da mikroskobu analiz ihtiyacı yok.

Lipid dizin belirlenmesi mantar patojen Ustilago Maydis sıvı Floresans kurtarma tarafından

Bu protokol, çok renkli 4d (zaman atlama 3D) Konfokal mikroskobu kullanarak mantar tomurcuklanan içinde floresan etiketli hücre içi bölmeler Analizi açıklanmaktadır. Görüntüleme parametreleri, fotodamat kısıtlarken yeterli sinyalleri yakalamak için seçilir. Özel ımagej eklentileri etiketlenmiş yapıların izlenmesini ve niceli olarak analiz edilmesini sağlar.

Maya 4D mikroskopisi

Burada, araştırmacıların mitoz ve Meiosis sırasında yaşayan fisyon Maya hücrelerinde protein davranışları ve nükleer dinamikleri incelemesini sağlayan toksik olmayan bir mikroskopi yöntemi olan canlı hücreli görüntüleme sunuyoruz.

Floresans canlı hücre mikroskobu ile mitotik ve meiotic Fission Maya nükleer dinamiklerinin incelenmesi

Saccharomyces cerevisiae'dekimajör hücresel lipitleri tanımlamak ve ölçmek için tandem kütle spektrometresi ile birleşen sıvı kromatografi kullanılarak bir protokol sayılmaktadır. Bir maya hücresi içindeki majör lipid sınıflarının nicel bir değerlendirme için açıklanan yöntem çok yönlü, sağlam ve duyarlıdır.

Tandem Kütle Spektrometresi Ile Birleşen Sıvı Kromatografi kullanarak Saccharomyces Cerevisiae'nin Hücresel Lipidomukan Analizi

Burada, karaciğer dokusunda lipid damlacık karakterizasyonu için optimize edilmiş bir BODIPY 493/503 floresan tabanlı protokol gösterilmektedir. Ortogonal projeksiyonların ve 3D rekonstrüksiyonların kullanılmasıyla, florofor mikro-veziküler ve makroveziküler steatoz arasında başarılı bir ayrım yapılmasına izin verir ve hepatik steatoz değerlendirmesi için klasik histolojik protokollere tamamlayıcı bir yaklaşımı temsil edebilir.

Hepatik Steatoz Değerlendirmesi için Floresan Boyalı Lipit Damlacıklarının 3D Rekonstrüksiyon ile Analizi

Bu çalışma, sağlam kas hacmi yoluyla kas içi yağ dokusu (IMAT) birikiminin görselleştirilmesi ve ölçülmesinin yanı sıra IMAT'ı oluşturan bireysel adipositlerin ölçümlerinin ölçülmesi için hücreden arındırmaya dayalı metodolojileri açıklamaktadır.

İskelet Kası Yağ İnfiltrasyonunun Decellularizasyona Dayalı Miktar Tayini

Fisyon mayası burada, polimerizasyonlarını görselleştirmek için GFP ile translasyonel füzyon proteinleri olarak FtsZ ve MreB gibi bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini eksprese etmek için heterolog bir konakçı olarak kullanılır. Ayrıca, polimerizasyonu etkileyen bileşikler, bir floresan mikroskobu kullanılarak görüntüleme ile tanımlanır.

Bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini hedef alan antibakteriyel ilaç taramaları için bir platform olarak fisyon mayası

Lipofaji, lipid damlacıklarının bozulmasını içeren seçici bir otofaji şeklidir. Bu süreçteki işlev bozuklukları kanser gelişimi ile ilişkilidir. Bununla birlikte, kesin mekanizmalar henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Bu protokol, otofaji, lipid metabolizması ve kanser ilerlemesi arasındaki etkileşimi daha iyi anlamak için kantitatif görüntüleme yaklaşımlarını açıklar.

Lipofaji Yoluyla Lipid Damlacık Katabolizmasının Düzenlenmesinin Araştırılması

Bu protokol, maya hücresi döngüsü durdurma ve isteğe bağlı salım için iki yöntemi detaylandırır ve hücre döngüsüne bağlı süreçleri incelemek için floresan mikroskobunun kullanımını detaylandırır.

Tomurcuklanan mayada hücre döngüsüne bağlı süreçlerin manipülasyonu ve analizi

Öğrenin, otomatik görüntü işleme ile maya hücrelerinde lipid damlacıklarının nicel analizini. Bu yöntem, Schizosaccharomyces pombe, S. japonicus ve Saccharomyces cerevisiae türlerinde yüksek verimli lipid depolama değerlendirmesi sağlar.

Otomatik görüntü Işleme kullanarak Fission ve budding yeasts lipid damlacık Içeriğinin Analizi

Daha fazla video keşfet