Name: Hemolymph toplama ve Metarhizyum blastosporların omurgasız patoloji çalışmalarına doğru Rhipicephalus Microplus ticks içine inoculation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Keşfedin, Rhipicephalus microplus kene larvalarına Metarhizium blastospor enjeksiyonu ve hemolimf toplama tekniklerini. Bu yöntem, omurgasız patoloji ve bağışıklık yanıtı çalışmalarında fungal patojen etkileşimlerini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmada Brezilya 'dan Coordenacão de Aperfeiçoamento de pessoal de nível Superior (CAPES), Finance Code 001 tarafından finanse edilmiştir. CAPES A.F. Marciano için Doktora Bursu sağladı. Biz J. Fiorotti için Doktora Bursu sağlamak için Brezilya bilimsel ve Teknolojik Kalkınma (CNPq) Ulusal Konseyi teşekkür ederiz. Bu araştırma aynı zamanda Rio de Janeiro (FAPERJ) ve CNPq devlet araştırma Carlos Chagas Filho Vakfı Hibe tarafından desteklenmektedir. V.R.E.P. Bittencourt bir CNPq araştırmacıdır.

Bu çalışmada kullanılan keneler, bir yapay koloniden elde edildi, Rio de Janeiro Federal kırsal Üniversitesi 'nde bulunan, hangi yöntemleri omurgalı hayvanların kullanımı için Etik Komitesi tarafından onaylandı (CEUA-IV/UFRRJ #037/2014).
1. tik dişiler
<ol><li>Kene toplama sonra, musluk suyu kullanarak kaynadı kadın yıkayın ve 0,5% (v/v) sodyum hipoklorit solüsyonu 3 dakika için bir 500 ml cam kabı alıcı, manikür hijyeni (Şekil 1), sonra kurutun tüm kadın steril kağıt havlu kullanarak (Şekil 2).</li>
	<li>Kadın homojen ağırlıklı gruplarda bölmek (her biri 20 kadın): herhangi bir tedavi olmadan bir grup, bir kontrol grubu 5 μL 0,1% polioksietilen Sorbitan monooleat sulu çözeltisi (v/v) ile aşı ve bir enfekte-Grup 1,0 x 10 de 5 μL ile aşı 7 blastospores ml-1. Not: hacim ve hemocayt konsantrasyonu için sadece tedavi edilmemiş keneler kullanılmıştır. Her grubun üç çoğaltır gerçekleştirildi.</li>
</ol>2. skutum ve başkentler arasında patojenlerin inokülasyon
Not: Bu çalışmada örnek olarak entomopatogenik mantar süspansiyonlar kullanılmıştır.
<ol><li>1 ml 0,1% polioksietilen Sorbitan monooleat sulu çözeltisi (v/v) içinde mantar blastospores askıya ve 1,0 x 107 blastospores ml-1son konsantrasyonuna ayarlayın. Plastik parafin film yüzeyine 5 μL metarhizium blastospores (Şekil 3) süspansiyon bir kısım ekleyin. Not: Metarhizium blastospores süspansiyonu, Neubauer odası kullanılarak ayarlandı. Aşı sürecini hızlandırmak için, plastik parafin film yüzeyine birden fazla kabarcıklar eklenebilir, her kabarcık 5 μL 'ye karşılık gelen.</li>
	<li>1 ml Ultra-ince insülin şırınga ve 0,3 mm iğne süspansiyon çekmek ve kene içine aşılamak kullanın. Kullanmadan önce şırıngadan tüm havayı almak unutmayın.</li>
	<li>Scutum ve başaç arasındaki kene dişi içine 5 μL mantar süspansiyonu inoculate. 0,1% 5 μL ile kontrol grubundan inoculate kadın polioksietilen Sorbitan monooleat sulu solüsyon (v/v) hiçbir mantar ile. Not: iğne eklendikten sonra foramen üzerinde küçük bir hemolymph hacmi mevcut olabilir. Hava aşılamak değil dikkatli olun.</li>
</ol>3. bacak uyluk ve kene dişi vücudu arasında entomopatogenik mantar inoculation
<ol><li>Mantar süspansiyon ile inoculate kadın (5 μL at 1,0 x 107 blastospores ml-1) bacak Tigh ve dişi vücudu arasında, bir 1 ml Ultra-ince insülin şırınga kullanarak bir 0,3 mm iğne ile birleştiğinde. Kontrol grubundan 5 μL 0,1% polioksietilen Sorbitan monooleat sulu solüsyon (v/v) ile inoculate kadın. Not: ne zaman metarhizium blastospores aşı bacak Tigh ve kene dişi vücudu arasında gerçekleştirilir, hemolymph küçük bir hacim iğne ekleme sonra Tigh üzerinde mevcut olabilir. Hava aşılamak değil dikkatli olun.</li>
</ol>4. dorsal hemolymph koleksiyonu
<ol><li>Kanat infüzyon kümesinin kauçuk parçasını, 0,3 mm kapiller tüpünü ve hemolymph koleksiyonunu gerçekleştirmek için süzülmüş bir ucu kullanın.</li>
	<li>0,3 mm iğne kullanarak dişi dorsal manikür bozar.</li>
	<li>Kesintinden sonra, kene gövdesinin ön kısmına nazik basınç uygulayın. Bozulma yerinin dışına çekerek neredeyse şeffaf bir sıvıya uyun. Bir kanatlı infüzyon seti kauçuk parçasına bağlı filtre ucu ile sıvı emme ve 0,3 mm kapiller tüp hemolymph toplayın. Not: Bu midgut bozabilir ve hemolymph kontamine olabilir çünkü onun immobilizasyon sırasında neredeyse kene vücut basın etmeyin. Nazik basınç kirliliğe gerek kalmadan sıvıyı dışarı atıncaya kadar bekleyin.</li>
</ol>5. kene bacak hemolymph koleksiyonu
<ol><li>Kene immobilize, bir makas bir çift ön bacak bir parça kesti. Not: bir veya daha fazla bacak kesilebilir, yanı sıra, aynı bacak birden fazla kez kesilebilir.</li>
	<li>Tick 'in posterior vücut parçasına nazik basınç uygulayın. 4,3 adımda açıklandığı gibi, kesim yerinde görünen ve kapiller tüpü ile toplamak şeffaf bir sıvı kabarcık gözlemlemek. Not: Bu midgut bozabilir ve hemolymph kontamine olabilir çünkü onun immobilizasyon sırasında neredeyse kene vücut basın etmeyin. Nazik basınç kirliliğe gerek kalmadan sıvıyı dışarı atıncaya kadar bekleyin.</li>
</ol>6. hemolymph işleme
<ol><li>Hemolymph koleksiyonundan sonra, daha önce 30 μL proteaz kokteyl ve 82 μL tuz tamponu ile dolu 1,5 ml mikrotüpler içinde yatırın. Mikrotüpler hemolymph koleksiyonu boyunca buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Santrifüjü örnekleri (500 x g 4 °c ' de 3 dakika). Hemolymph Santrifüjden sonra yumuşak bir hemanosit Pelet oluşturulacaktır. Not: hemolymph ölçme Için, mikrotüp içinde toplam hacmi sayma ve proteaz kokteyl ve tuzlu tampon hacminin sayılarak elde edilen hemolymph hacmi ölçmek.</li>
	<li>Dikkatle süpernatant kaldırmak (hücre-ücretsiz hemolymph). Örneğin, Leibovitz 'in L-15 kültürü pH 7.0-7.2 olarak ayarlanmış olan hücreleri yavaşça pelletini. Neubauer odasına 10 μL resuspended hemocayt koyarak hemanositleri ölçün.</li>
</ol>7. hemocayt örnekleme slayt hazırlama
<ol><li>Bir çift makas ile kene ön bacak kes.</li>
	<li>Tick 'in posterior vücut parçasına nazik basınç uygulayın. Kesim bölgesinde görünen şeffaf bir sıvı balonu izleyin.</li>
	<li>Uygulamak hemolymph doğrudan temiz mikroskop slaytlar üzerine düşer, bundan sonra, hücreleri leke için tahsis yöntemleri kullanın.<ol>
<li>Giemsa kullanarak hemanosit leke için, 30 dakika boyunca slayt üzerinde hemolymph hava kuru, 3 dakika için metanol ile Oda sıcaklığında düzelt, ve Giemsa çözeltisi leke (1:9 Sorensen tampon çözeltisi oranı, pH 7,2) Oda sıcaklığında 30 dakika. Boya fazlalığını çıkarmak, slaydı hava kurutmak ve hücreleri optik mikroskop içinde 400x olarak değerlendirmek için akan suyla kaydırmaları yıkayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Grisi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassessment+of+the+potencial+economic+impact+of+cattle+parasites+in+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Brasileira+de+Parasitologia+Veterin%C3%A1ria%22%5BJournal%5D)">Reassessment of the potencial economic impact of cattle parasites in Brazil.</a> Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 23 (2), 150-156 (2014).</li>
<li>Schrank, A., Vainstein, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metarhizium+anisopliae+enzymes+and+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Metarhizium anisopliae enzymes and toxins.</a> Toxicon. 56 (7), 1267-1274 (2010).</li>
<li>Camargo, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metarhizium+anisopliae+for+controlling+Rhipicephalus+microplus+ticks+under+field+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Metarhizium anisopliae for controlling Rhipicephalus microplus ticks under field conditions.</a> Veterinary Parasitology. 223, 38-42 (2016).</li>
<li>Perinotto, W. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+pathogenicity+of+different+Metarhizium+anisopliae+s.l.+isolates+in+oil+formulations+against+Rhipicephalus+microplus%5BTitle%5D)+AND+%22Biocontrol+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">In vitro pathogenicity of different Metarhizium anisopliae s.l. isolates in oil formulations against Rhipicephalus microplus.</a> Biocontrol Science and Technology. 27 (3), 338-347 (2017).</li>
<li>Pedrini, N., Crespo, R., Juarez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry+of+insect+epicuticle+degradation+by+entomopathogenic+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology.+Part+C%3A+Toxicology+and+Pharmacolpgy%22%5BJournal%5D)">Biochemistry of insect epicuticle degradation by entomopathogenic fungi.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. Part C: Toxicology and Pharmacolpgy. 146 (1-2), 124-137 (2007).</li>
<li>Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+on+the+surface%3A+Entomopathogenic+fungi+versus+the+insect+cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">Action on the surface: Entomopathogenic fungi versus the insect cuticle.</a> Insects. 4 (3), 357-374 (2013).</li>
<li>Angelo, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+serpins+involved+in+cellular+immune+response+of+Rhipicephalus+microplus+challenged+with+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Biocontrol+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Detection of serpins involved in cellular immune response of Rhipicephalus microplus challenged with fungi.</a> Biocontrol Science and Technology. 24 (3), 351-360 (2014).</li>
<li>De Paulo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhipicephalus+microplus+infected+by+Metarhizium%3A+unveiling+hemocyte+quantification%2C+GFP-fungi+virulence%2C+and+ovary+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+Research%22%5BJournal%5D)">Rhipicephalus microplus infected by Metarhizium: unveiling hemocyte quantification, GFP-fungi virulence, and ovary infection.</a> Parasitology Research. 117, 1847-1856 (2018).</li>
<li>Marmaras, V. J., Lampropoulou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+and+signalling+in+insect+haemocyte+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">Regulators and signalling in insect haemocyte immunity.</a> Cell Signal. 21, 186-195 (2009).</li>
<li>Hinzmann, M. F., Lopes-Lima, M., Gonçalves, J., Machado, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiaggregant+and+toxic+properties+of+different+solutions+on+hemocytes+of+three+freshwater+bivalves%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+%26+Environmental+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Antiaggregant and toxic properties of different solutions on hemocytes of three freshwater bivalves.</a> Toxicological & Environmental Chemistry. 95, 790-805 (2013).</li>
<li>Nation, J. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNation%2C+JL+%22Insect+Physiology+and+Biochemistry%22">Insect Physiology and Biochemistry</a>. , University of Florida. Gainesville, FL. (2016).</li>
<li>Gene, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%A9moires+de+l%27Acad%C3%A9mie+royale+des+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Torino%22%5BJournal%5D)">Mémoires de l'Académie royale des sciences.</a> Torino. 9, 751(1848).</li>
<li>Lees, A. D., Beament, J. W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organ+waxing+in+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22The+Quarterly+Journal+of+the+Mythic+Society%22%5BJournal%5D)">An organ waxing in ticks.</a> The Quarterly Journal of the Mythic Society. 7, 291-332 (1948).</li>
<li>Sonenshine, D. E., Roe, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSonenshine%2C+DE+%22Biology+of+ticks%22">Biology of ticks</a>. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2014).</li>
<li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+hemocytes+proliferation+in+larval+silkworm+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of hemocytes proliferation in larval silkworm Bombyx mori.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (6), 595-603 (2013).</li>
<li>Bowden, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+humoral+immune+systems+of+the+American+lobster+%28Homarus+americanus%29+and+the+European+lobster+%28Homarus+gammarus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Research%22%5BJournal%5D)">The humoral immune systems of the American lobster (Homarus americanus) and the European lobster (Homarus gammarus).</a> Fish Research. 186, 367-371 (2017).</li>
<li>Sonenshine, D. E., Hynes, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+and+related+aspects+of+the+innate+immune+response+in+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization and related aspects of the innate immune response in ticks.</a> Frontiers in Bioscience. 13, 7046-7063 (2008).</li>
<li>Tsakas, S., Marmaras, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+immunity+and+its+signaling%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebrate+Survival+Journal%22%5BJournal%5D)">Insect immunity and its signaling: an overview.</a> Invertebrate Survival Journal. 7, 228-238 (2010).</li>
<li>Burgdorfer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolymph+Test.+A+technique+for+detection+of+Rickettsiae+in+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Hemolymph Test. A technique for detection of Rickettsiae in ticks.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 19, 1010-1014 (1970).</li>
<li>Dunham-Ems, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+reveals+a+biphasic+mode+of+dissemination+of+Borrelia+burgdorferi+within+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Live imaging reveals a biphasic mode of dissemination of Borrelia burgdorferi within ticks.</a> Journal of Clinical Investigation. 119, 3652-3665 (2009).</li>
<li>Patton, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva%2C+salivary+gland%2C+and+hemolymph+collection+from+Ixodes+scapularis+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Saliva, salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks.</a> Journal of Visualized Experiments. 60, e3894(2012).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Patojenlerin inoculation çalışması, çalışmada deneysel Artropod modellerinde mikroorganizmaların in vivo eylemini araştırmayı amaçladığından, çünkü patojenin ev sahibinin içinde olduğunu garanti eder. Bu teknik Ayrıca RNA parazitleri (RNAi) gibi aşılamak moleküllere de uygulanabilir. Scutum ve başkentlik arasında inoculation gerçekleştirmek için daha kolay kabul edilir ama sık zarar Gené organı, yumurtalarını zayıflatır12,13. Gené 'nin organı anatomik olarak başk...

Sığır kene, Rhipicephalus Microplus, tropikal alanlarda Hayvancılık üzerinde büyük bir olumsuz etkisi olan bir hematofagus antiparazitik olduğunu. Bu kene, Babesia Bovis, Babesia bigeminave anaplasma obtus gibi patojenik ajanların vektörü olup, doğrudan hemofeeding hasar ile birlikte, süt ve et üretimini azaltabilir, anemi ve sonuçta ölüm neden olabilir. Bu ektoparasitin neden olduğu kayıplar Brezilya 'da yıllık 3.240.000.000 dolar olarak tahmin edildi1. Sürdürülebilir Yöntemler talep edilir ve entomopatogenik ajanların kullanımı, kimyasal akarisitlerin kullanımını azaltmak için umut verici bir alternatif olarak kabul edilir2,3,4.
Metarhizyum spp. gibi entomopati ojenik mantarlar, keneler de dahil olmak üzere eklemropodların doğal düşmanlarıdır ve bazı izolatlar biyodenetleyici olarak kullanılabilir. Bu patojenler aktif olarak manikür yoluyla ev sahibi enfekte ve vücudunu kolonize2,5,6. Enfeksiyon geliştikçe, hücresel ve humoral tepkiler kene bağışıklık sistemi tarafından aracılık edilir. Kene hemolymph Analizi patojenler ile zorlu sonra bağışıklık yanıtlarını değerlendirmek için yararlı bir araç olarak bildirilen7,8.
Arthropods ' bağışıklık tepkisi humoral ve hücresel tepkiler ayrılmıştır. Humoral yanıt hemaglütinasyon süreçleri ve antimikrobiyal proteinler/peptidler üretimi içerir, hücresel bağışıklık yanıtı hemanositler aracılığıyla gerçekleştirilir ise. Bu hücreler tüm eklemropodlar hemolymph mevcut ve doğal bağışıklık tepkisi içeren çalışmalarda ifade rol geliştirmek için bildirilen9, doğrudan fagositoz ve kapsülleme süreçleri ile ilgili olduğu gibi. Buna göre, hemanositler hakkında çalışmalar ölüm yolunun araştırılması ve otophagy, apoptozis ve nekroz gibi süreçleri anlamanıza yardımcı olabilir. Bazı omurgasızlar olarak biyvalfler, hemanosit koleksiyonu hücre bozulması gibi sınırlamalar, düşük hemolymph hacmi elde, ve düşük konsantrasyon kurtarılmış hücreler10. Çok sık, uygulanan metodolojiye bağlı olarak, hücrelerin miktarlama ve analizini doğrudan etkileyen, azaltılmış hücre konsantrasyonu elde edilir.
Hemolymph içinde dolaşan hemanosit sayısı farklı eklemropodlar arasında değişkendir ve seks, yaş ve Artropod 'un gelişimsel aşaması11gibi farklı fizyolojik aşamalar nedeniyle aynı türde değişebilir. Hemanositler de bazı organlara yapışmış bulunabilir ve enfeksiyon işleminden hemen sonra dolaşım içine salınabilir11. Yine de, çoğu çalışmada böcek kullanımı bildirilmiştir, keneler ise fizyolojisi ve patolojileri ile ilgili daha az incelenmiştir. Patojen inokülasyon ve hemolymph koleksiyonuna rağmen keneler daha az kullanılan tekniklerdir, standart yöntemler kurulması daha doğru çalışmaların gelişmesine yardımcı olur.
Bu çalışmanın amacı, hemolymph toplama ve patojenlerin inokülasyon için en çok kullanılan metotlarını R. Microplus Ticks olarak karşılaştırmaya, hematositlerin elde edilmesi ve hemanosit konsantrasyonunda etkinliğini değerlendirmek idi.

<table><tbody><tr><td>Alkali Hipoklorit çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1727</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Synth</td><td>2706</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Gibco</td><td>16000036</td><td></td></tr><tr><td>Esnek kauçuk</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Giemsa leke</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>48900-500ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Cam kılcal</td><td>CTechGlass</td><td>CT95-02</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin şırıngası (iğne)</td><td>BD</td><td>SKU:&nbsp; 324910</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Vetec</td><td>60REAVET014512</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz'in L-15 kültür ortamı&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop slaytları</td><td>Kasvi</td><td>K5-7105</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotüpler</td><td>MARKA</td><td>Z336769-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Vetec</td><td>60REAVET014593</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer odası&nbsp;</td><td>Kasvi</td><td>K5-0111</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin</td><td>Gibco</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2714</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Vetec</td><td>60REAVET003662</td><td></td></tr></tbody></table>

hemolymph toplama ve metarhizyum blastosporların omurgasız patoloji çalışmalarına doğru rhipicephalus microplus ticks içine inoculation

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Keneler, hematofajöz Ektoparazitleri ve Rhipicephalus mikroplus , anemi, kilo kaybı, hayvanların deri amortismanı ve aynı zamanda çeşitli patojenlerin bir vektör olarak hareket edebilir çünkü veteriner tıbbında büyük önem taşımaktadır. Bu parazitler kontrol etmek için fahis maliyetleri nedeniyle, kimyasal akaritelerin uygunsuz kullanımı nedeniyle çevreye zarar, ve geleneksel parazit karşı artan direnç, keneler alternatif kontrol, kullanımı ile Örneğin entomopatogenik mantar, ilginç bir yaklaşım olarak kabul edilmiştir. Yine de, birkaç çalışmada Tick bağışıklık sistemi bu entomopathogens mücadele nasıl davranır göstermiştir. Bu nedenle, bu protokol Entomopatojen aşı için kullanılan iki yöntem gösterilmiştir dişi ve iki teknikleri hemolymph toplama ve hemanosit hasat için kullanılır. Kene dişi vücudunda bacak eklemesinde patojenlerin aşı dişi biyolojik parametrelerin değerlendirilmesine izin verir, skutum ve başkentin arasındaki aşı, hangi sıklıkla Gené organı zarar. Dorsal hemolymph koleksiyonu bacaklardan koleksiyonundan daha yüksek hacimli iyileşme sağladı. Kene hemolymph toplama ve işleme bazı sınırlamalar dahil i) yüksek oranları hemanosit ' bozulma, ii) bozmuş midgut ile hemolymph kontaminasyonu, ve iii) düşük hemolymph ses kurtarma. Hemolymph bacak kesme yoluyla toplandığında, hemolymph bacak açılışında birikmesi için zaman alır, pıhtılaşma sürecini tercih. Buna ek olarak, ilk yöntemin gerçekleştirilmesi daha kolay kabul edilse bile, dorsal koleksiyona kıyasla bacak aracılığıyla koleksiyonda daha az hemanosit elde edilir. Entomopatogenik ajanlar tarafından aracılık edilen kenlerde bağışıklık tepkisini anlamak, patogenezini ortaya çıkarmak ve kene kontrolü için yeni hedefler geliştirmek için yardımcı olur. Burada açıklanan aşı süreçleri çok düşük teknolojik kaynaklar gerektirir ve sadece keneler patojen mikroorganizmalara maruz bırakmak için kullanılabilir. Benzer şekilde, kene hemolymph koleksiyonu birçok fizyolojik çalışmalar için ilk adımı gösterebilir.

Bu makalede kenelere uygulanan aşı ve hemolymph toplama yöntemleri yaklaşmaktadır. Bacak uyluk ve kene dişi vücudu arasındaki aşı sonra, bazı sıvı (hemolymph) süreci sırasında salgılanan olabilir; Ancak, aşı bittiğinde, iğne ucunda veya aşı bölgesinde sıvı veya doku bulunmadığını, mantar süspansiyonun tamamen inoculated olduğundan emin olmak önemlidir. Aşı işlemi doğru şekilde gerçekleştirildiğinde, iğne ekleme kene kadınların ölümü neden olmadı. Öte yandan, entomopatogenik mantar aşı son...

Kene hemolymph analizi, bazı patojenlerin hastalığa neden olduğu ve keneler immünolojik olarak bu enfeksiyona nasıl yanıt vereceği konusunda önemli bir bilgi kaynağını temsil eder. Bu çalışmada, mantar propagülleri aşılamak ve Rhipicephalus Microplus tıkanmış kadınlarda hemolymph toplamak gösterilmiştir.

Hemolymph toplama ve Metarhizyum blastosporların omurgasız patoloji çalışmalarına doğru Rhipicephalus Microplus ticks içine inoculation

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight ...

Keneler hematophagous ektoparazitler vardır, Rhipicephalus microplus, halk sığır kene olarak bilinen tropikal alanlarda hayvancılık üzerinde büyük olumsuz ekonomik etkisi vardır. Buna ek olarak, kimyasal acarisitlerin uygunsuz kullanımı ve kene popülasyonlarının geleneksel parazitlere karşı artan direncinden kaynaklanan bozulmuş çevre koşulları ve halk sağlığı endişeleri hakkındaki endişeler, entomopatojenik mantar kullanımı gibi alternatif kontrol yöntemleri üzerine araştırma yığılmasıdır. Bu entomopatojenler eklembacaklı konaklarını etkenolarak enfekte eder ve vücutlarını kolonize ederler.Eklembacaklımantar enfeksiyonuna farklı tepkiler verebilir. Eklembacaklı bağışıklık sistemi mizahi ve hücresel tepkiler e ayrılır. Humoral yanıt hemagglutinasyon süreci ve antimikrobiyal moleküllerin üretimini içerir, hemositler hücresel immün yanıt aracılık ederken.Eklembacaklı immün yanıt üzerine yapılan çalışmaların çoğu böcekler kullanılarak rapor edilirken kene yanıtları daha az araştırılmış durumdadır. Ayrıca, patojen aşılama ve kene hemolenf toplama eklembacaklı bağışıklık yanıtını daha iyi anlamak için gerekli kötü yaygın tekniklerdir. Buna göre, bu video adresi teknikleri \aşılama, hemolenf toplama ve işleme filme kullanılır.Kene hemositleri hasat, hücre bozulması, düşük hemolenf değeri elde edilmesi ve kurtarılan hücrelerin düşük konsantrasyonu gibi bazı sınırlamalarla karşı karşıya dır. Doğrudan hücre yapılandırma ve analiz enfekte. Kene toplama sonra, tıkanmış dişiler yıkayın.Musluk suyu kullanın ve 500 mililitre cam kabı alıcı üç dakika boyunca% 0.5 sodyum hipoklorit çözeltisi onları batırın. Kütikül hijyeni için dişileri homojen gruplara, her biri 20 dişiile bölün. Her gruptan üç kopya yapıldı.Aşılama sürecinde metarhizium robertsii blastosporlar kullanıldı. Plastik bir parafin filminin yüzeyine beş mikrolitre metarhizium blastospores süspansiyon bir sıvı ekleyin. Aşılama işlemini hızlandırmak için, her kabarcık beş mikrolitreye karşılık gelen plastik parafin film yüzeyine birden fazla kabarcık eklenebilir.Bir milimetreultra ince insülin şırınga ve 0.3 milimetrelik bir iğne kullanarak süspansiyon uyup kenenin içine aşılamak için kullanın. Kullanmadan önce şırınganın tüm havasını almayı unutmayın. Scutum ve capitulum arasında kene kadın içine mantar süspansiyon 5 mikrolitre aşılamak.İğne kesiğinden sonra çerçevelemede küçük bir hacim de hemolenf olabilir. Hava aşılamamaya dikkat edin. 0.3 milimetrelik bir iğne ile bir mililitre ultra ince insülin şırınga kullanarak bacak uyluk ve kadın vücudu arasında mantar süspansiyon ile aşılamak.Metarhizium blastospores aşılama bacak uyluk ve kene kadın vücudu arasında yapıldığında, hemolenf küçük bir hacim iğne yerleştirildikten sonra uyluk üzerinde mevcut olabilir. Hava aşılamamaya dikkat edin. Kanatlı bir infüzyon kauçuk parçası kullanın 0.3 miliimeters kılcal tüp ve hemolenf toplama gerçekleştirmek için bir filtre ucu ayarlayın.0.3 milimetrelik bir iğne kullanarak dişi dorsal mitikülbozun. Bozulmadan sonra kene gövdesinin anterial kısmına hafif basınç uygulayın. Neredeyse saydam bir sıvının bozulma alanından çıktığını gözlemleyin.Kanatlı infüzyon seti ve 0.3 milimetre kılcal tüp bir lastik parçası ile birleştiğinde filtre ucu ile sıvı emerek hemolenf toplamak. Bu midgut bozabilir ve hemolenf kontamine olabilir, çünkü immobilizasyon sırasında kene vücuduna zor basmayın. Hafif basınç kontaminasyon olmadan sıvı dışarı atabilirsiniz kadar bekleyin.Keneyi etkisiz hale getir. Ön bacaktan bir parça kes. Bir veya daha fazla bacak kesilebilir yanı sıra aynı bacak birden fazla kez kesilebilir.Kenenin arka vücut kısmına hafif basınç uygulayın. Şeffaf bir sıvı kabarcık kesilmiş tarafında göstermek gözlemlemek ve kılcal tüp ile toplamak. Bu midgut bozabilir ve hemolenf kontamine olabilir, çünkü seferberlik sırasında kene vücuduna zor basmayın.Hafif basınç kontaminasyon olmadan sıvı dışarı atabilirsiniz kadar bekleyin. Hemolenf toplama sonra, daha önce 30 mikrolitre proteaz kokteyl ve 82 mikrolitre tuzlu tampon ile doldurulmuş 1.5 mililitre mikrotüp yatırın. Mikrotüpleri hemolenf koleksiyonu boyunca buz üzerinde tutun.Hemolenf santrifüjünden sonra santrifüj örnekleri ve hemositlerin yumuşak peleti oluşacaktır. Hemolenf niceliği için, mikrotüp içindeki toplam hacmi sayarak ve proteaz kokteyl ve tuzlu tampon hacmini azaltarak elde edilen hemolenf hacmini ölçün. Dikkatle supernatant hücresiz hemolenf kaldırmak ve yavaşça hücreleri yeniden askıya.Neubauer odasına 10 mikrolitre yeniden asılı hemosit yerleştirerek hemositleri ölçün. Hücreler için yeniden askıya alma bir kültür ortamı kullanılmıştır. Kenenin ön bacağını kesin, kenenin arka vücut kısmına hafif basınç uygulayın, kesilen bölgede saydam bir sıvı kabarcığı gözlemleyin.Hemolenf damlalarını doğrudan temiz mikroskop slaytlarına uygulayın. Bundan sonra hücreleri lekelemek için uygun yöntemler kullanın. Bacak uyluk ve kene kadın vücudu arasında aşılama da midgut ve malpighian tübülleri gibi kene iç organlara zarar verebilir.Kene midgut dorsal hemolenf koleksiyonunda iğne tarafından bozulduğunda elde edilen sıvı kırmızı, şeffaf değil. Bu yanlış bir hemolenf toplama gösterir. Bu durumda, hemolenf kontamine olarak atılır.Kene doğal patojenlerin yüksek yükler ilerbulandığında ya da aşılanmış patojenlerin neden olduğu ölüm sürecinden sonraki son adımlarda hemolenf kontaminasyonu da görülebilir. Dorsal toplama dan sonra elde edilen hemolenf hacmi, bacak yoluyla toplama da elde edilen hacimden daha yüksektir. Kontaminasyon kolaylığına rağmen ilk toplama yönteminde daha yüksektir.Hemosit konsantrasyonu da dorsal koleksiyonda önemli ölçüde daha yüksekti. Doğru hemosit toplama yapıldığında iyi bir yayma elde edilebilir ve boyama sonra farklı hemositayırt etmek mümkündür. Bu video, patojenin, özellikle entomopatojenik mantarların keneler içine aşılama ve hemolenf toplamak için yöntemler hakkında bilgi sağladı.Burada sunulan teknikler kene fizyolojisi, kene patolojisi ve kene bağışıklık yanıtı ile ilgili çalışmalar için klasik adımlarımızda çok düşük teknolojik kaynaklar gerektirir. Eklembacaklı hücrelerin doğru hasat, ve hücresiz hemolenf sonraki çalışmalar için güvenilir bilgi göze çok önemlidir. Bu nedenle, bu tekniklerin uygulanmasında gözlenen en yaygın hataların farkında olmak da önemlidir.Ayrıca, bu çalışmanın önerileri, elde edilen hacim ve kontaminasyon olasılığı arasındaki fark göz önünde bulundurularak, bacakların deforme edilmesi veya kesilmesi yoluyla hemolenf toplama için daha uygun bir alan belirleyecektir.

disclosing-hemolymph-collection-inoculation-metarhizium-blastospores

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Lyme hastalığı araştırma çalışmaları, genellikle bir süreç genellikle birkaç hafta sürer patojen Borrelia burgdorferi ile enfekte kenelerin nesil gerektirir. Burada saat içinde yapılabilir mikroenjeksiyon tabanlı bir kene enfeksiyonu prosedürü göstermektedir. Ayrıca keneler içinde B. burgdorferi in situ lokalizasyonu için immünofloresan yöntemi göstermektedir.

Hızlı Aktarım ve Lyme Hastalığı Patojenler lokalizasyonu için işaretleyin Gut içinde Yöntemleri

Keneler hemolimf, tükrük bezleri ve tükürük toplama patojenler hastalıklara nasıl neden kene kaynaklı incelemek önemlidir. Bu protokolü biz beslenmesini hemolimf ve tükrük bezleri toplamak nasıl...

Ixodes scapularis Keneler gelen tükürük, Tükürük Bezi ve hemolimf Koleksiyonu

Lyme hastalığı Kuzey Amerika'daki en sık bildirilen vektör kaynaklı bir hastalıktır. Etkeni, Borrelia burgdorferi keneler kene ile bulaşan bir spioket bakteridir. Hayvan modellerinde enfeksiyonun İletim ve saptama burada açıklandığı kene besleme, kullanılmasıyla optimize edilir.

Lyme Hastalığı Araştırma İletim ve Xenodiagnosis için Hayvanlar Keneler besleme

Bu yöntem, patojen işgali üç boyutlu (3D) modelleri ile böcek hücreye görselleştirmek gösterilmiştir. Hemocytes Drosophila larvaları üzerinden viral veya bakteriyel patojenler, ex vivo veya vivo içindeile bulaşmış. Virüslü hemocytes daha sonra sabit ve görüntüleme için bir confocal mikroskop ve sonraki 3D hücresel yeniden yapılanma ile lekeli.

Hemocytes mikrobiyal enfeksiyon ve çözümleme çekme--dan Drosophila melanogaster larva

Burada, dağınık şekilde ve geçici kene cesaret bir değiştirilmiş bütün-mount In situ hibridizasyon yaklaşım kullanarak uygun microbiota varlığı değerlendirmek için bir protokol mevcut.

Kene bağırsaklar tarafından bütün-mount Situ hibridizasyon Microbiota görselleştirme

Mevcut protokol, mikroRNA'ların kene tükürük bezlerinden ve saflaştırılmış hücre dışı veziküllerden izolasyonunu tanımlamaktadır. Bu, yaygın olarak kullanılan reaktifleri ve sarf malzemelerini birleştiren evrensel bir prosedürdür. Yöntem aynı zamanda az sayıda kene kullanımına izin verir, bu da kolayca sıralanabilen kaliteli mikroRNA'larla sonuçlanır.

MikroRNA'ların Kene Ex Vivo Tükürük Bezi Kültürlerinden ve Hücre Dışı Veziküllerden İzolasyonu

Elektroporasyon, eksojen DNA'yı Rickettsia cinsine sokmak için hızlı, geniş çapta benimsenmiş bir yöntemdir. Bu protokol, Rickettsia cinsindeki zorunlu hücre içi bakterilerin dönüşümü için yararlı bir elektroporasyon yöntemi sağlar.

Kene Hücre Hatlarında Floresan Protein İfade Eden Mekik Vektörü ile Rickettsia spp.'yi Dönüştürmek için Bir Elektroporasyon Yöntemi

Daha sonraki analizler için ölçülebilir hemolenfleri küçük eklembacaklılardan verimli bir şekilde toplamak için bir yöntem tarif ediyoruz.

Küçük Eklembacaklılardan Hemolenf Toplamak için Kesin ve Ölçülebilir Bir Yöntem

Bu makale, klinik araştırmalar için insanları larva Ixodes scapularis'e maruz bırakma metodolojisini sunmaktadır. Teknik nispeten basittir, araştırma gönüllüleri tarafından tolere edilebilir ve deneysel ihtiyaçlara göre değiştirilebilir. İnsan denekleri içeren bu tür araştırmalar, uygun düzenleyici makamlar tarafından onaylanan klinik çalışma protokolleri kapsamında yürütülmelidir.

İnsanların Larva Ixodes scapularis Kenelerine Deneysel Maruziyeti İçin Bir Model

Burada, vektör yeterliliği ve patojen-mikrobiyom etkileşimlerinin anlaşılmasını ilerletmek için kene kaynaklı patojenlerin dokuya özgü lokalizasyonunu incelemek için, beslenen bir kenenin diseksiyonunu takiben tükürük, hemolenf, tükürük bezleri ve orta bağırsak toplamak için bir protokol sunuyoruz.

Bireysel Kenelerden Tükürük, Hemolenf, Tükürük Bezleri ve Orta Bağırsağın Ekstraksiyonu (Acari: Ixodidae)

Bu yöntem, 3D baskılı bir oda ve laboratuvarda üretilmiş silikon membranı içeren in vitro kene kan besleme sisteminin geliştirilmesini öngörür. Sistem, kenelerin yapay beslenmesini sağlar, çeşitli beslenme evrelerinde kolayca örnekleme alınır ve düşük miktarda kan kullanılır; bu da ixodid kenelerini incelemek için paha biçilmez bir araç sağlar.

Ixodid kene araştırmalarında 3D baskılı bir odada yapay bir zardan beslenen kene kanı

Keşfedin, Rhipicephalus microplus kene larvalarına Metarhizium blastospor enjeksiyonu ve hemolimf toplama tekniklerini. Bu yöntem, omurgasız patoloji ve bağışıklık yanıtı çalışmalarında fungal patojen etkileşimlerini anlamaya yardımcı olur.

Hemolymph toplama ve Metarhizyum blastosporların omurgasız patoloji çalışmalarına doğru Rhipicephalus Microplus ticks içine inoculation (Video) | JoVE Journal

Hemolymph toplama ve Metarhizyum blastosporların omurgasız patoloji çalışmalarına doğru Rhipicephalus Microplus ticks içine inoculation

Daha fazla video keşfet