Name: Bakterilerde Hücre Altı Protein Lokalizasyonu ve Hücre Morfolojisi Değişikliklerini Araştırmak Için Canlı Hücre Floresan Mikroskobu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Öğrenin, canlı hücre floresan mikroskobu kullanarak Bacillus subtilis ve Staphylococcus aureus'ta protein lokalizasyonu ve hücre morfolojisi değişikliklerini nasıl gözlemleyeceğinizi. Bu yöntem tek hücre düzeyinde fenotipik analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Laboratuvar üyelerimize bu yazıdaki yorumları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Güney Florida Üniversitesi'nin (PE) başlangıç ödeneği ile finanse edilmiştir.

1. Genel büyüme koşulları
<ol><li>Uygun büyüme ortamının 2 mL'sini antibiyotiklerle desteklendirin (gerektiğinde) tek bir suş kolonisi ile görüntülenin. Bu tohum kültürlerini bir gecede 22 °C'de sallayarak bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın. NOT: Bu makalede kullanılan özel bakteriyel büyüme koşulları temsili sonuçlar bölümünde sağlanmaktadır.</li>
	<li>Bir gecede kültürleri seyreltin 1:20 taze ortamda 125 mL şişe, antibiyotik ile ek (gerektiğinde).</li>
	<li>37 °C'de orta logaritmik faza (OD600 = 0.5) kadar sallanan bir kuluçka makinesinde kültür(ler) yetiştirin. NOT: İndükleyici veya inhibitör uygun büyüme aşamasında büyüyen kültür(ler) doğrudan eklenebilir.</li>
	<li>Aşağıdaki bölümde açıklandığı gibi mikroskopi numune sipresiyonu için istenilen kültür koşullarında hasat hücreleri.</li>
</ol>2. Örnek hazırlama
<ol><li>Moleküler biyoloji notu 0.25 g, düşük EEO, agarose ile 25 mL büyüme ortamı ile zaman atlamalı mikroskobik veya steril su için uygun antibiyotikler (gerektiğinde) ile takviye birleştirerek% 1 agarose hazırlayın. Karışımı mikrodalga yardımıyla yaklaşık 30 s ısıtın ve steril 100 mm x 15 mm Petri kabına dökün ve katılamasına izin verin.</li>
	<li>Hücre kültürünün ihtiyacına bağlı olarak 5-50 μL aliquot alın ve hücreleri leke. Bu aşamada uygun boyalarla leke hücreleri (örneğin, bir deney için floresan boya FM4-64 (membran lekesi) ekleyin(Şekil 1)).<ol>
<li>Pipet, 35 mm'lik cam alt kültür çanağının altına (14 mm mikrokuyu çapı ve kaplamasız No. 1.5 kapaklı; Malzeme Tablosunabakınız) görüntülenecek kültür numunesinin veya lekeli numunenin 5 μL aliquot'udur. DİkKAT: Farklı büyüme deseni (biz de poli-D-lizin ile gözlemledik; veriler gösterilmez) ve /veya protein dinamiklerini etkileyebileceği için özellikle timelapse mikroskobu için poli-L-lizin kaplı kapakları kullanmayın6.</li>
		<li>Boya kullanımını en aza indirmek için, 3-4 μL hücre süspansiyonu (OD600 = 0,5; b. subtilis ve S. aureus için sırasıyla 1 mL kültür için yaklaşık 2,7 x 107 ve 3,4 x 107 hasat) doğrudan cam alt çanak üzerinde.</li>
		<li>Önceden kesilmiş bir agarose levha (11 mm çapında veya coverslip alanı örtüşmek için istenilen boyutta; steril bir tüp veya jilet açık ucunu kullanarak kesilmiş) örnek üstüne yerleştirin ve yavaşça agarose levha kapak karşı düz yalan olduğundan emin olmak için dokunun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Görüntülemeden sonra (aşağıdaki bölüme bakınız), görüş alanındaki hücre sayısı istenmiyorsa, seyreltme veya konsantrasyon yoluyla numunenin hücre yoğunluğunu santrifüj ile ayarlayın ve gerektiğinde büyüme ortamı/tampon kullanarak numunedeki hücrelerin oranını değiştirin. NOT: Kültür ortamından yayılan otofloresansı en aza indirmek için hücreler tamponda yıkanabilir (örneğin standart 1x fosfat tampon uline) ve görüntülemeden önce uygun miktarda tampon olarak yeniden askıya alınabilir. Bu adımda santrifüjden sonra küçük hücrelerin veya veziküllerin tutulmaması ve bu nedenle kaybedilmesi mümkündür.</li>
	<li>Agarose pedin kurumasını önlemek ve özellikle zaman atlamalı deneylerde görüntü edinimi sırasında nemi korumaya yardımcı olmak için kültür çanağının içindeki boşluğa (coverslip etrafında) pipet (~5°L damla) kullanarak su ekleyin.</li>
	<li>Kültür yemeklerinin, üretici tarafından sağlanan dahili opak bir bölme olan kuluçka odasının içindeki ısıya 15-20 dakika boyunca mikroskobun sıcaklığına dengelemesine izin verin. NOT: Isıtma elemanını açın ve kuluçka odasını görüntülemeden birkaç saat önce istenilen sıcaklığa ayarlayın. Bu, donanımın yeni sıcaklığa sabitolmasını sağlar. Uzun süreli görüntüleme için, nem korumak için mikroskop odasının içine, çalışma alanından uzakta su içeren bir kabı veya şişe yerleştirin.</li>
</ol>3. Görüntüleme
<ol><li>Deney günü, mikroskop sistemini açın. Masaüstündeki uygun simgeyi tıklatarak görüntüleme yazılımını başlatın (Bkz. Malzeme Tablosu). Yazılımın başlangıç iletişim kutusundaki Initialize Microscope seçeneğini (üzerinde mikroskop la betimlenen düğme) tıklayarak mikroskobu başlatın. Başlatmadan önce mikroskop kabası ayarı kullanılarak hedefin tamamen düşürüldüğından emin olun. NOT: Başlatma menüsüne ek olarak üç ek iletişim kutusu görüntülenmelidir: çözümleme3D, veri toplama ve filtre monitörü.</li>
	<li>Üretici tarafından sağlanan 100x yağ daldırma hedefine 1,517 (kırılma indisi) yağı bir düşüş yerleştirin (Sayısal Diyafram = 1,4, Çalışma Mesafesi = 0,12 mm; bkz. Malzemeler Tablosu). NOT: Görüntülemenin yapıldığı sıcaklık için uygun daldırma yağının seçimi önemlidir.</li>
	<li>Numune içeren cam alt kabı metal gövdeye (tabut) yükleyin ve sahne kelepçesine yavaşça kaydırın.</li>
	<li>Yağ yemeğin cam alt ile temas edene kadar hedefi yükseltmek için kaba ayar topuz kullanın. Örneği odak haline getirmek için göz parçasını ve ince ayar topuzlarını kullanın. Hücreler odaklandıktan sonra, mikroskop gövdesinin önünde bulunan seçici anahtarı sola doğru hareket ettirerek düğmeyi göz parçasından kamera moduna çevirin.</li>
	<li>Görüntüleme yazılımını kullanarak denemeye başlayın. Çözümlü 3D penceresinde, bir şişeyle betimlenen Tasarım/çalıştır deneme simgesini seçin. Yeni bir iletişim kutusu tasarım/çalıştır denemesibaşlıklı görünmelidir.<ol>
<li>Tasarım ve ardından tasarım/çalıştır deneme iletişim kutusundaki bölüm sekmesini kullanarak Z yığınlarının sayısını ve örnek kalınlığını ayarlayın. NOT: Temsili sonuçlar bölümündeyapılan deneylerde, hareketsiz görüntüler için 200 nm aralıkta 17 Z-deste, timelapse mikroskopi için 200 nm aralığında dört Z-deste kullanılmıştır.</li>
		<li>Örnekteki hücrelerin kalınlığını ölçmek için, çözümlenmiş 3D iletişim kutusundaki yukarı ve aşağı okları kullanarak Z düzlemini el ile artımlı olarak ayarlayın. Hücrelerin görüntü edinimi için üst ve alt sınır olarak odak dışı gittikleri yeri işaretleyin. Denemeyi çalıştırmadan önce bu bilgileri aktarın.</li>
		<li>Timelapse görüntüleme sırasında fototoksisite ve fotobeyazrlama en aza indirmek için, Z-yığınları sayısını azaltmak ve görüntü edinimi için hücrelerin orta düzlemi seçin.</li>
	</ol></li>
	<li>Tasarımı kullanarak deneme için uygun filtre kümesini seçin ve ardından tasarım/çalıştır deneme iletişim kutusundaki kanallar sekmesini seçin (TRITC: EX 542/27; EM 597/45; FITC/GFP: EX 475/28; EM 525/48; mKiraz: EX 575/25; EM 632/60; Cy5: EX 632/22; EM 676/34).<ol>
<li>Ayrıca, POL/DIC bilgilerinin toplanması için bir başvuru seçin. Çözümleme 3D iletişim kutusunda ki uygun seçenekleri seçerek görüntülemeden önce seçilen tek tek kanallar için yüzde iletimini (ışık yoğunluğunu) ve maruz kalma süresini ayarlayın. NOT: Seçili parametrelerin zayıf sinyali kaçırmadan veya aşırı doyatmadan anlamlı floresan verileri elde edip etmediğini belirlemek için deney için düşünülmeyen bir görünüm alanında bu ayarları test edin. Daha sonra deneysel kurulum için bu parametreleri aktarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Çözümlü 3D iletişim kutusundaki Puanlistesi düğmesini seçerek puan listesini açın. Yeni bir iletişim kutusu, başlıklı puan listesigörünmelidir. Mikroskop aşaması denetimlerini kullanarak uygun görünüm alanlarını bularak ve puan listesi iletişim kutusundaişaret noktası seçeneğini seçerek denemede kullanılacak çeşitli görünüm alanlarını işaretleyin. NOT: Mikroskobun puan listesindeki bir noktaya yeniden odaklandığı her seferde bir değiştirme noktası nın seçilmesi gerekir. Bu, mikroskobu listedeki uygun noktaya odaklayarak ve daha sonra değiştir noktası düğmesini seçerek yapılabilir. Yeniden odaklama yaparken analog kaba/ince ayar tonuna dokunmamak önemlidir; odağı ayarlamak için yalnızca yazılımı kullanın.</li>
	<li>Önce tasarım ve ardından deneme iletişim kutusundaki timelapse sekmesini seçerek zaman atlama parametrelerini ayarlayın. Zaman atlamalı onay kutusunu seçin. Zaman atlamalı görüntüler/toplam zaman açısından uygun zaman atlamalı parametreleri girin.</li>
	<li>Önce tasarımı seçerek puan listesinden görüntülenecek noktaları ve ardından tasarım/çalıştır deneme iletişim kutusundaki noktalar sekmesini ayarlayın. Ziyaret noktaları listesi seçeneğini seçin ve tam bir sıra ise virgül veya tire ile ayrılmış metin kutusuna görüntülenecek noktaları girin.</li>
	<li>Denemebaşlamadan önce, tasarım/çalıştır iletişim kutusundaki çalıştır sekmesini kullanarak dosya adlarını ve dosya konumlarını düzenleme. Dosya konumu ayarlar düğmesini seçerek, veri klasörünü seçerek ve daha sonra uygun klasörü seçerek veya yeni bir klasör oluşturarak değiştirilebilir. Resim dosyası adı metin kutusuna yeni dosya adını girerek dosya adlarını değiştirin.</li>
	<li>Denemeyi başlat iletişim kutusundaki oynat düğmesini seçerek denemeyi başlatın. NOT: Timelapse için, DIC ayarını kullanarak (gereksiz fotobeyazrlamayı önlemek için) deneme boyunca her görüş alanında odağı sürekli olarak denetleyin ve hücreler zaman içinde odak dışına çıkma eğiliminde olduğu için puan listesindeki bilgileri yeniden odaklayıp güncelleyin.</li>
</ol>4. Görüntü işleme
<ol><li>Şekil oluşturma için istenilen ham (R3D) görüntü dosyalarını açın. NOT: Son zamanlarda kaydedilen dosyalar, görüntüleme yazılımının başlangıç iletişim kutusundaki veri klasörü düğmesini kullanarak bulunabilir.</li>
	<li>Deconvolution programı çalıştırın, bir deconvolved D3D görüntü dosyası üretmek için odak dışı floresan ışık kaldırmak için7,8, . Başlat iletişim kutusundaki işlem sekmesini seçin ve ardından deconvolve'useçin. Yeni bir iletişim kutusu deconvolvebaşlıklı görünecektir.<ol>
<li>Deconvolution parametrelerini, dekonvolution iletişim kutusundaki girişe uygun görüntü numarasını (her görüntü dosyasının sol üst köşesinde bulunan) sürükleyerek ayarlayın. Deconvolution iletişim kutusunda, daha fazla seçenek düğmesini seçin ve onay kutusunu işledikten sonra kırpma kenarlığı rolloff'unu seçin (aksi takdirde görüntüler ilgili DIC dosyasının üzerine eklenemez).</li>
		<li>Ham resim dosyasını deconvolve için deconvolution iletişim kutusunda yap düğmesini tıklatın. NOT: Deconvolution parametreleri istenilen sonuçlar için yazılım üreticisinin kılavuz kılavuzunda belirtildiği şekilde ayarlanabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gerekirse, herhangi bir veya tüm dalga boyu (renk) kanallarında manuel arka plan gürültüsü çıkarma ve parlaklık/kontrast ayarı gerçekleştirin. Deconvolved resim dosyasındaki kontrast ayarlama düğmesini seçerek bunu yapın.</li>
	<li>Önce D3D iletişim kutusunun üst kısmındaki dosya seçeneğini seçerek görüntüyü TIFF dosyası olarak kaydedin. Ardından TIFF olarak kaydet'i seçin, uygun Z-yığınlarını (odak içinde olan), istenen filtre kümelerini seçin veya seçin.</li>
	<li>Üretici tarafından sağlanan herhangi bir yazılımı veya ImageJ5gibi serbestçe kullanılabilen programları kullanarak veri nicelleştirme gerçekleştirin.<ol>
<li>Hücre boyutu ölçümü için uygun D3D resim dosyasındaki araç sekmesine tıklayın ve ardından ölçü mesafeleri seçeneğini belirleyin. Sol tıklamalarla fareyi kullanarak istenilen resim dosyasındaki başlangıç ve bitiş noktalarını seçerek mesafeleri ölçün. NOT: Hücre boyutu nicelemesi sırasında görüntüyü yakınlaştırmak en iyisidir.</li>
		<li>Floresan sinyal nicelliği için, uygun D3D görüntü dosyasındaki araç sekmesinin altındaki veri denetçisi seçeneğini kullanın. NOT: En iyisi görüntüyü yakınlaştırmak ve floresan sinyal miktarını tamamlarken yalnızca ilgili filtrelerin seçilmesidir.</li>
		<li>Floresan sinyalini ölçmek için, belirli boyuta ayarlanmış sütun/satır seçeneğine sahip bir kutu çizin. Ölçülecek sinyaliçeren bir alan seçin ve değeri kaydedin. Hücrelerin hemen dışında bir alan seçmek için aynı boyut kutusunu kullanarak arka plan sinyalini ölçün. Hücre içinde elde edilen floresan sinyalinden kaydedilen değerden arka plan değerini çıkarın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Coltharp, C., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+microscopy+for+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Superresolution microscopy for microbiology.</a> Cellular Microbiology. 14 (12), 1808-1818 (2012).</li>
<li>Holden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+mechanistic+principles+of+bacterial+cell+division+with+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Probing the mechanistic principles of bacterial cell division with super-resolution microscopy.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 84-91 (2018).</li>
<li>Hsu, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+color+palette+of+fluorescent+d-amino+acids+for+in+situ+labeling+of+bacterial+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Full color palette of fluorescent d-amino acids for in situ labeling of bacterial cell walls.</a> Chemical Science. 8 (9), 6313-6321 (2017).</li>
<li>Nonejuie, P., Burkart, M., Pogliano, K., Pogliano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+cytological+profiling+rapidly+identifies+the+cellular+pathways+targeted+by+antibacterial+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+USA%22%5BJournal%5D)">Bacterial cytological profiling rapidly identifies the cellular pathways targeted by antibacterial molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (40), 16169-16174 (2013).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BioMed Central Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>Colville, K., Tompkins, N., Rutenberg, A. D., Jericho, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+poly%28L-lysine%29+substrates+on+attached+Escherichia+coli+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Effects of poly(L-lysine) substrates on attached Escherichia coli bacteria.</a> Langmuir. 26 (4), 2639-2644 (2010).</li>
<li>McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+by+deconvolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy.</a> Methods. 19 (3), 373-385 (1999).</li>
<li>Wallace, W., Schaefer, L. H., Swedlow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+workingperson%27s+guide+to+deconvolution+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A workingperson's guide to deconvolution in light microscopy.</a> Biotechniques. 31 (5), 1076-1082 (2001).</li>
<li>Eswara, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+Staphylococcus+aureus+cell+division+protein+directly+regulates+FtsZ+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">An essential Staphylococcus aureus cell division protein directly regulates FtsZ dynamics.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Haeusser, D. P., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splitsville%3A+structural+and+functional+insights+into+the+dynamic+bacterial+Z+ring%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Splitsville: structural and functional insights into the dynamic bacterial Z ring.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 305-319 (2016).</li>
<li>Du, S., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((At+the+Heart+of+Bacterial+Cytokinesis%3A+The+Z+Ring%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">At the Heart of Bacterial Cytokinesis: The Z Ring.</a> Trends in microbiology. , (2019).</li>
<li>Haranahalli, K., Tong, S., Ojima, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+discovery+and+development+of+antibacterial+agents+targeting+the+cell-division+protein+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the discovery and development of antibacterial agents targeting the cell-division protein FtsZ.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 24 (24), 6354-6369 (2016).</li>
<li>Brzozowski, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+Role+of+a+SLOG+Superfamily+Protein+YpsA+in+Gram-Positive+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Deciphering the Role of a SLOG Superfamily Protein YpsA in Gram-Positive Bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 623(2019).</li>
<li>Elsen, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+action+of+the+cell-division+inhibitor+PC190723%3A+modulation+of+FtsZ+assembly+cooperativity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Mechanism of action of the cell-division inhibitor PC190723: modulation of FtsZ assembly cooperativity.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (30), 12342-12345 (2012).</li>
<li>Haydon, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inhibitor+of+FtsZ+with+potent+and+selective+anti-staphylococcal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity.</a> Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).</li>
<li>Pilhofer, M., Ladinsky, M. S., McDowall, A. W., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+TEM%3A+new+insights+from+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Bacterial TEM: new insights from cryo-microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 96, 21-45 (2010).</li>
<li>Ni, Q., Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+cell+signaling+using+genetically+encoded+fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+European+Biochemical+Societies+Journal%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of cell signaling using genetically encoded fluorescent reporters.</a> Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (2), 203-219 (2018).</li>
<li>Weiss, C. A., Hoberg, J. A., Liu, K., Tu, B. P., Winkler, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Microscopy+Reveals+That+Levels+of+Cyclic+di-GMP+Vary+among+Bacillus+subtilis+Subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Microscopy Reveals That Levels of Cyclic di-GMP Vary among Bacillus subtilis Subpopulations.</a> Journal of Bacteriology. 201 (16), (2019).</li>
<li>Schneider, J. P., Basler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+light+on+biology+of+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Shedding light on biology of bacterial cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1707), (2016).</li>
<li>Yao, Z., Carballido-Lopez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+for+bacterial+cell+biology%3A+from+localization+to+dynamics%2C+from+ensembles+to+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+microbiology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging for bacterial cell biology: from localization to dynamics, from ensembles to single molecules.</a> Annual review of microbiology. 68, 459-476 (2014).</li>
<li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li>
<li>Fredborg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image+analysis+for+quantification+of+filamentous+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Automated image analysis for quantification of filamentous bacteria.</a> BioMed Central Microbiology. 15, 255(2015).</li>
<li>Ursell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((precise+quantification+of+bacterial+cellular+dimensions+across+a+genomic-scale+knockout+library%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Biology%22%5BJournal%5D)">precise quantification of bacterial cellular dimensions across a genomic-scale knockout library.</a> BioMed Central Biology. 15 (1), 17(2017).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Mikroskopi mikrobiyal organizmalarla ilgili çalışmalarda dayanak noktası olarak kalmıştır. Mikron ölçekli hücre büyüklükleri göz önüne alındığında, tek hücre düzeyinde çalışmalar geleneksel olarak elektron mikroskobu (EM) dayanıyordu. EM son yıllarda oldukça güçlü bir teknik haline gelmiş olsa da, sınırlı kullanıcı erişimi16ek olarak kendi içsel sınırlamaları vardır. Floresan mikroskobu tekniklerinde gelişmeler ve FDAA3gibi farklı floresan probların geliştirilmesi, canlı hü...

Bakteri hücre biyolojisi alanı önemli ölçüde mikroskopi teknikleri son gelişmeler ile geliştirilmiştir1,2. Diğer aletlerin yanı sıra, timelapse floresan mikroskobik deneyler icra edebilen mikroskoplar değerli bir araç olmaya devam etmektedir. Araştırmacılar gibi floresan proteinler kullanarak gerçek zamanlı olarak çeşitli fizyolojik olayları izleyebilirsiniz, yeşil floresan protein (GFP) tabanlı transkripsiyonel ve çevirisel muhabir füzyon, floresan D-amino asitler (FDAA)3, ya da hücre duvarı, membran ve DNA etiketleme için diğer lekeler kullanın. Bu nedenle floresan mikroskopimikrobiyal hücre biyologları arasında popüler liğini sürdürdüğünü hiç de şaşırtıcı değildir. Sadece son fenotipleri göstermenin yanı sıra, gözlenen fenotiplerin timelapse mikroskobu kullanılarak nasıl ortaya çıkarabileceğine dair bilgi sağlamak bulgulara önemli bir değer katacak ve potansiyel olarak potansiyel olarak potansiyel olarak potansiyel uyuşturucu adayları tarafından hangi hücresel süreçlerin hedeflendiğine dair ipuçları sunabilir4.
Bu makalede, tam motorlu, ters, geniş alan floresan mikroskobu (Malzeme Tablosunabakınız) kullanılarak yüksek çözünürlüklü görüntüleme yapmak için protokoller verilmiştir. Bu protokoller timelapse mikroskoplar yapma yeteneğine sahip diğer floresan mikroskopların ihtiyaçlarına uyacak şekilde uyarlanabilir. Burada tartışılan yazılım, Malzeme Tablosu'ndabelirtildiği gibi üretici tarafından sağlanan özel yazılıma karşılık geliyor olsa da, genellikle diğer mikroskop üreticileri veya serbestçe kullanılabilen ImageJ5tarafından sağlanan yazılım, mikroskopi verilerini analiz etmek için eşdeğer araçlara sahiptir. Zaman aşımının elverişli olmadığı durumlar için, zaman-kurs deneyleri bu makalede açıklandığı şekilde yapılabilir. Burada açıklanan protokoller iki farklı bakteri türündeki henotik değişiklikleri incelemek için ayrıntılı bir kılavuz sağlar: B. subtilis ve S. aureus. Kullanılan suşlar için Tablo 1'e bakınız.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP160-100</td><td>Moleküler Biyoloji Sınıfı - Düşük EEO</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td>Mikroskopi</td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>T3166</td><td>Mikroskopi</td></tr><tr><td>Cam alt tabak</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Mikroskopi</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1755-10</td><td>Dioksan içermez</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>GE</td><td>DeltaVision Elite</td><td>Özelleştirilmiş Olympus IX-71 Ters Mikroskop Standı; Özel aydınlatma kulesi ve iletilen ışık aydınlatıcı modülü. Hedefler: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X YAĞ (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); 100X Hedefi için DIC Prism Nomarski; CoolSnap HQ2 kamera; SSI Meclisi 7 renkli; Çevre kontrol odası - opak.</td></tr><tr><td>PC190723</td><td>MilliporeSigma</td><td>3445805MG</td><td>FtsZ inhibitörü</td></tr><tr><td>SoftWorx</td><td>GE</td><td></td><td>Üretici tarafından sağlanan görüntüleme yazılımı</td></tr></tbody></table>

bakterilerde hücre altı protein lokalizasyonu ve hücre morfolojisi değişikliklerini araştırmak için canlı hücre floresan mikroskobu

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Bakterilerde hücre bölünmesi ve hücre şeklini etkileyen faktörlerin araştırılması genellikle yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobu ile birlikte yapılır, çünkü popülasyon düzeyinde yapılan gözlemler tek bir hücre düzeyinde meydana gelen leri tam olarak yansıtmayabilir. Canlı hücre timelapse mikroskopisi, araştırmacıların hücre bölünmesi veya hücre morfolojisindeki değişiklikleri izlemelerine olanak sağlar ve bu da proteinlerin hücre altı lokalizasyonu ve gen ekspresyonunun zamanlaması ile ilgili değerli içgörüler sağlar, ki bu da önemli biyolojik soruların cevaplanmasında potansiyel olarak yardımcı olur. Burada, bacillus subtilis ve Staphylococcus aureus'taki henotibik değişiklikleri yüksek çözünürlüklü dekonvolution mikroskobu kullanarak izlemek için protokolümüzü açıklıyoruz. Bu raporun amacı, bakterilerin yanı sıra diğer organizmalarda farklı biyolojik süreçleri incelemek için floresan mikroskobu deneyleri yapmak la ilgilenen diğer araştırmacılar tarafından benimsenebilecek basit ve net bir protokol sağlamaktır.

GpsB fenotipleri Daha önce sa-GpsB hücre lysis bir antisense RNA sonuçları kullanarak GpsB tükenmesi gibi önemli bir protein olduğunu göstermiştir9. Burada çeşitli hücre bölünmesi fenotiplerinin ortaya çıkışının ve protein lokalizasyonundaki değişikliklerin bu makalede açıklanan timelapse mikroskopi protokolü kullanılarak nasıl yakalanabileceği açıklanmaktadır. Bu amaçla, S. aureus suşları RB143 [SH1000 barındıran pEPSA5 (boş vektör)] ve GGS8 [SH1000 harboring pGG59 (<...

Bu makalede, protein subselliyerizasyon dinamiklerini araştırmak ve Bacillus subtilis ve Staphylococcus aureus'ta yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobu kullanarak morfolojik değişiklikleri izlemek için adım adım kılavuz verilmektedir.

Bakterilerde Hücre Altı Protein Lokalizasyonu ve Hücre Morfolojisi Değişikliklerini Araştırmak Için Canlı Hücre Floresan Mikroskobu

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

Bu protokol, çeşitli henotik değişikliklerin tek hücre düzeyinde doğrudan gözlemini kolaylaştırır ve protein lokalizasyonu ve gen ekspresyonu zamanlamasının sürekli izlenmesini sağlar. Floresan mikroskobun en büyük avantajı, canlı hücrelerde hücre bölünmesi ve hücre morfolojisi değişiklikleri gibi çeşitli biyolojik süreçleri izlemek için basit bir yöntem olmasıdır. Örnek hazırlama protokolüne özellikle dikkat edin ve bu protokolde listelenen ayarları ve seçenekleri bulabilmek için mikroskop yazılımını araştırın.Bu protokolün görsel bir gösterimi önemlidir, çünkü kullanıcıların kendi denemelerini kurarken tekniğin önemli adımlarını izlemelerine ve öğrenmelerine olanak tanır. Uygun bir membran boyama boya ile ilgi hücre kültürünün bir beş ila 50 mikrolitre aliquot etiketleme ve 35 mililitrelik cam alt kültür çanak altında bir kapak kayma üzerine lekeli bakteri hücrelerinin beş mikrolitre ekleyerek başlayın. Numunenin üzerine 11 milimetre çapında bir agarose levha yerleştirin ve levhanın kapak kaymasına karşı düz olduğundan emin olmak için hafifçe dokunun.Daha sonra agarose pedin kurumasını önlemek için kapak kapağının etrafına yaklaşık beş mikrolitre su ekleyin ve kültür çanağının yüksek çözünürlüklü bir dekonvolution mikroskobunun kuluçka odasıiçindeki sıcaklığı 15-20 dakika boyunca dengelemesini bekleyin. Örneği görüntülemek için, mikroskop yazılımında mikroskopu başlatmadan önce hedefin tamamen düşürüleceğinden emin olmak için kaba ayar odak tonuzunu kullanın. 100x yağ daldırma hedefi içine 1.517 kırılma indisi yağ bir damla yerleştirin ve metal konut tabut içine örnek içeren cam alt çanak aktarın.Yavaşça sahne kelepçeiçine çanak kaydırın ve yağ çanak cam alt ile temas edene kadar hedefi yükseltmek için kaba ayar topuz kullanın. Örneği odak lamak için merceğını ve ince ayar düğmesini kullanın ve Kamera Modu'na geçin. Çözüm3B penceresindeki görüntüleme yazılımında Deneme Tasarla/Çalıştır simgesini seçin.Tasarım/Çalıştır Denemesi başlıklı yeni bir iletişim kutusu görüntülenir. Z yığınlarının sayısını ve örnek kalınlığını ayarlamak için iletişim kutusundaki Tasarım ve Kesit sekmelerini açın. Örnekteki hücrelerin kalınlığını ölçmek için, Çözüm3B iletişim kutusundaki yukarı ve aşağı okları kullanarak Z düzlemini kademeli olarak ayarlayın ve hücrelerin Görüntü Edinme için üst ve alt sınırlar olarak odak dışı gitmelerini sağlar.Çözümleme 3B iletişim kutusunda ki tek tek seçilen kanallar için Işık Yoğunluğunun Yüzde İletimini ve Pozlama süresini ayarladıktan sonra Puan Listesini açmak için Puan Listesi'ni tıklatın. Tasarım ve Zaman Atlamalı sekmelerde, Zaman Atlamalı onay kutusunu seçin ve zaman atlama parametrelerini girin. Ziyaret Noktası listesini seçin ve tam diziler için noktaları virgülveya tirelere göre ayırarak metin kutusuna görüntülenecek noktaları girin.Ardından Çalıştır sekmesinde dosya adlarını ve dosya konumlarını edin ve denemeyi başlatmak için Denemeyi Başlat iletişim kutusunda Oynat'ı seçin. Analizin sonunda, uygun bir deconvolution programında ilgi RAW görüntü dosyalarını açın ve İşlem sekmesi ni ve Deconvolve'u seçin. Görüntüyü TIFF dosyası olarak kaydetmeden önce, herhangi bir veya tüm dalga boyu kanallarında herhangi bir manuel arka plan gürültüsü çıkarma ve parlaklık kontrastı ayarlaması yapın.Hücre uzunluğu niceliği için, üreticitarafından sağlanan yazılımdaki veya ImageJ gibi ücretsiz görüntüleme yazılımındaki deconvoluted görüntü dosyalarını açın ve Araç sekmesini açın. Ardından Ölçü Mesafeleri'ni seçin ve hücre uzunluğunu ölçmek için istenen resim dosyasındaki başlangıç ve bitiş noktalarını sol tıklatın. Floresan sinyal nicelliği için Veri Denetçisi'ni seçin.İlginin belirli boyutuna ayarlanmış Sütun/Satır seçeneğiyle bir kutu çizin ve ölçülecek sinyalin bulunduğu alanı seçin. GGS 8 suşneden ksisoz eklenmesi altı hücreli fenotip sonuçları. Boş vektör kontrolleri indükleyici yokluğunda yetiştirilen hücreleri kontrol benzer görünürken.Staph aureus gpsB aşırı üretimi zaman atlamalı mikroskopi ve hücre uzunluğu nicelleştirme ile ölçülen b.subtilis hücre bölünmesi bozar. Buna ek olarak, FtsZ veya bu protein ile ilişkili proteinlerden birinin lokalizasyon desenleri zaman atlamalı görüntüleme ve hücre uzunluğu nicelemesi yoluyla yeni antimikrobiyal bileşikleri incelemek ve/veya tanımlamak için bir muhabir kullanılabilir. Görüntüleme için kullanılan sıcaklığa bağlı olarak kırılma indisi değişebileceğinden, uygun kırılma indisi olan bir yağ kullandığınızdan emin olun.Kullanıcı odak dışı gürültüyü kaldırmak isterse de dekonvolution yapılabilir ve floresan sinyal ölçümü ile hücre uzunluğu ve genişliği ölçümlerini içeren veri analizi de yapılabilir.

live-cell-fluorescence-microscopy-to-investigate-subcellular-protein

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Burada izlenir ve sayısal, fonksiyonel moleküler kompleksler tespit sağlamak için canlı bakteri hücreleri tek-molekül floresan mikroskopi gerçekleştirmek için protokolleri göstermektedir.

Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi

Bu protokol, otomatik floresan zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak zaman farklı bakteriler tek hücre davranışlarını izlemek için bir adım-adım yordam sağlar. Ayrıca, biz nasıl mikroskobu görüntüleri analiz etmek için yönergeler sağlar.

Canlı Hücre Görüntüleme Bacillus subtilis Ve Streptococcus pneumoniae Otomatik Zaman atlamalı Mikroskopi

Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Mikrobiyal biyofilmler genellikle özel hücreler farklı subpopülasyonunun oluşturduğu edilir. Bu alt popülasyonlarının Tek hücreli analizi floresan gazetecilere kullanımını gerektirir. Burada birkaç subpopulationswithin görselleştirmek ve izlemek için bir protokol...

Tek hücreli Analizi Bacillus subtilis</emFloresan Mikroskobu ve Akım Sitometri Kullanma> Biyofilmler

Kaynak: Brzozowski, R. S. ve diğerleri. Bakterilerde subhücre protein lokalizasyonunu ve hücre morfolojisindeki değişiklikleri araştırmak için canlı hücre floresan mikroskobi. J. Vis. Exp. (2019)Bu video, bakterilerde gerçek zamanlı morfolojik değişiklikleri görselleştirmek için canlı hücre floresans mikroskopisini göstermektedir. Yüksek çözünürlüklü görüntüleri gerçek zamanlı elde etmek için görüntüleme, zaman geçişi ve dekonvolüsyonda kullanılan adımları özetler.

Bakterilerde Morfolojik Değişikliklerin Canlı Hücre Floresan Mikroskopisi Kullanılarak Görüntülenmesi

Video, floresan proteinler, bir donör eGFP ve alıcı mCherry ile etiketlenmiş sitoplazmik proteinleri eksprese eden canlı bakterilerde protein-protein etkileşimini belirlemek için FLIM-FRET görüntüleme tekniğini açıklar. Kombine teknik ayrıca etkileşen proteinlerin miktarının belirlenmesine de izin verir.

Canlı Bakterilerde Protein-Protein Etkileşimlerinin Karakterizasyonu için FLIM-FRET Görüntüleme

Chlamydia içeren hücresel vakuolleri (inklüzyonlar) aydınlatmak için canlı hücre floresan proteini bazlı bir yöntem tanımlanmıştır. Bu strateji, numunelerde Chlamydia enfektivitesinin hızlı ve otomatik olarak belirlenmesini sağlar ve inklüzyon büyüme dinamiklerini kantitatif olarak araştırmak için kullanılabilir.

Görselleştirme ve Miktarının Belirlenmesi için floresan proteinleri kullanarak<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuol Büyüme Dinamikleri Yaşayan Hücrelerde

Biyomoleküllerin in vivo çalışmaları, biyolojik bağlamda moleküler işlevi anlamak için çok önemlidir. Burada, DNA veya proteinler gibi floresan biyomoleküllerin canlı mikroorganizmalara içselleştirilmesine izin veren yeni bir yöntemi açıklıyoruz. Floresan mikroskobu ile kaydedilen in vivo verilerin analizi de sunulmakta ve tartışılmaktadır.

Elektroporasyon yoluyla Yaşam Mikroorganizmalar içinde içselleştirilmesi ve Floresan biyomoleküllerin Gözlem

Bakterilerde temel süreçleri işlevini anlamak zordur. Floresans mikroskobu hedef özel boyalar ile mikrobiyal hücre büyüme ve hücre döngüsü ilerleme içine anahtar anlayışlar sağlayabilir. Burada, Agrobacterium tumefaciens yöntemleri canlı hücre görüntüleme için gerekli işlemleri karakterizasyonu için vurgulamak için bir model bakteri kullanılmaktadır.

Temel işlemler sırasında mikrobiyal hücre büyümesini gözlemlemek için hücre Floresans mikroskobu canlı

Bakteri hücreleri son derece dağınık şekilde düzenlenir. Yavaş büyüyen Myxococcus xanthus hücreler zamanla bu organizasyonda takip etmek için bir tuzak birçok nesiller boyunca yüksek kronolojik zamanmekansal çözünürlük ile floresan canlı hücre görüntüleme için geliştirilmiştir. Bu yöntemi kullanarak, kromozom segregasyon ve hücre bölünmesi için önemli proteinlerin kronolojik zamanmekansal dynamics tespit edilemedi.

Floresans Live-hücre görüntüleme, tam bitkisel hücre döngüsü yavaş büyüyen sosyal bakteri Myxococcus xanthus

Bu canlı-bakteriyel hücre görüntüleme protokolü zaman içinde tek hücre düzeyinde birden fazla bakteri türü arasındaki etkileşimlerin görselleştirilmesiiçin izin verir. Hızlandırılmış görüntüleme, tek tek kültür veya ortak kültürdeki her bakteri türünün gözlemlenmesine olanak sağlar ve bireysel hücre hareketliliği ve canlılığı da dahil olmak üzere çok türler arası bakteri topluluklarındaki türler arası etkileşimleri sorgular.

Tek Hücreli Türler Arası Bakteri Etkileşimlerinin Kinetik Görselleştirilmesi

Öğrenin, canlı hücre floresan mikroskobu kullanarak Bacillus subtilis ve Staphylococcus aureus'ta protein lokalizasyonu ve hücre morfolojisi değişikliklerini nasıl gözlemleyeceğinizi. Bu yöntem tek hücre düzeyinde fenotipik analiz sağlar.

Bakterilerde Hücre Altı Protein Lokalizasyonu ve Hücre Morfolojisi Değişikliklerini Araştırmak Için Canlı Hücre Floresan Mikroskobu (Video) | JoVE Journal

Bakterilerde Hücre Altı Protein Lokalizasyonu ve Hücre Morfolojisi Değişikliklerini Araştırmak Için Canlı Hücre Floresan Mikroskobu

Daha fazla video keşfet