RNA 'nın ayak Izleri tanımlaması: proteinli kompleksleri RNA Immunoprecipitation ile tandem sonra sıralamayı (RIPiT-seq)
10 Temmuz 2019
Burada, endojen RNA bağlayıcı siteleri veya RNA: protein (RNP) kompleksler "ayak izleri" mammalin hücrelerden zenginleştirmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım RNP alt paketleri iki immünoprecipitations içerir ve bu nedenle tandem RNA immünopresipitasyon dubbed (ripit).
RNA immünopresidasyon tandem ve ardından sıralama veya RIPiT-Seq, RNA'nın hangi bölgelerinin belirli bir rna bağlayıcı protein çifti ile bağlı olduğunu belirlemek için kullanılan bir yöntemdir. RIPiT'in en eşsiz avantajı iki arınmada iki farklı proteini hedeflenebilme yeteneğidir. Bu diğer komplekslerden bir kompozisyon farklı RNA protein kompleksi için zenginleştirmek için güçlü bir yol sağlar.
Ayrıca, RIPiT-Seq UV-crosslinking bağımsız, ve doğrudan bağlamadan RNA hareket birçok protein uygulanabilir. Bu yöntem doğrudan tedavi veya tanı doğru genişletmek olmasa da, RNA bağlayıcı proteinler ve RNA işleme nöropatiler ve kanser gibi çeşitli hastalıklar ile ilişkili olmuştur. RIPiT-Seq, hastalığa bağlı RNA bağlayıcı proteinlerin fonksiyonlarını incelemek için bir araç sağlar.
RIPiT-Seq bir epitop etiketli protein ifade edilebilir bir sistem gerektirir. Sadece HEK293 hücrelerinde test edilmiştir ve hücre kültürüne en uygun olandır. Ancak, crispr kullanarak proteinleri etiketleme yeteneğimiz ile, RIPiT-Seq çeşitli modern sistemler için uygulanabilir.
RIPiT'nin başarısı iki etkin immünoprepitre bağlıdır, bu nedenle kullanılan antikor için immünopresidasyon koşullarını optimize etmek kritik olacaktır. Ayrıca, RNA ile çalışmak uygun önlemler gerektirir, bu nedenle RNA ekstraksiyonu sırasında ve sonrasında RNa içermeyen reaktifler kullanılmalıdır. Prosedürü gösteren Lauren Woodward, laboratuvarımda yüksek lisans öğrencisi olacak.
15 santimetre lik plakabaşına 15 mililitre soğutulmuş PBS ile monolayer hücreleri hafifçe yıkayarak başlayın. Sonra pbs 30 mililitre içine hücreleri kazımak ve 50 mililitrekonik tüp onları toplamak. 4 santigrat derecede 10 dakika 400 g santrifüj ederek hücreleri pelet ve supernatant atın.
Dört mililitre buz gibi hipotonik lisis tamponu ekleyin ve hücreleri yeniden askıya almak için P1000 pipeti kullanın. Lysate'yi beş mililitrelik bir tüpe aktarın ve 10 dakika boyunca buzüzerinde kuluçkaya yatırın. Bir buz banyosu ve el yazması yönlere göre sonicate lysate yerleştirin.
Daha sonra tuz konsantrasyonu 150 milimolar ayarlamak için beş azı lı sodyum klorür 108 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, 12, 000 g 4 santigrat derece 10 dakika lysate santrifüj ve batı leke analizi için supernatant 20 mikrolitre toplamak. Pre-wash FLAG agarose boncuklar el yazması yönlere göre ve beş mililitrelik bir tüp içinde boncuk 750 mikrolitre kalan supernatant uygulayın.
FLAG agarose boncukları hücre ekstresi ile dört derece santigrat derecede nazik karıştırma ile 1-3 saat kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, 400 g'da 400 gr'da boncukları 4 derece santigrat derecede bir dakika peletleyin ve batı leke analizi için 20 mikrolitre süpernatant toplayın. Kalan supernatant atın ve iso yıkama tampon dört mililitre onları resuspend tarafından boncuk yıkayın.
Pelet boncuklar tekrar ve supernatant kaldırın. Resûl-i Kusmisi 750 mikrolitre iso yıkama tamponunun el yazması yönergelere göre seyreltin ve FLAG agarose boncuklar ekleyin. Karışımı dört santigrat derecede hafif bir karıştırma ile kuluçkaya yatırın ve sonra boncukları santrifüjle peletlayın.
Batı leke analizi için 20 mikrolitre supernatant toplayın ve geri kalanını atın. Daha sonra boncukları daha önce açıklandığı gibi iso yıkama tamponuyla yıkayın. Daha sonra, boncuklara 375 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyerek ve karışımı bir ila iki saat boyunca dört santigrat derecede hafifçe sallayarak yakınlık elüsyonu gerçekleştirin.
Kuluçkadan sonra, boncukpelet ve batı leke analizi için elüsasyon bir 15 mikrolitre aliquot toplamak. Afinite elution devam ederken, manyetik boncuk antikor çekimi gerçekleştirin. Bir mililitre iso yıkama tamponunda 50 mikrolitre manyetik boncuk yıkayarak başlayın.
Konjugasyon tampon 100 mikrolitre boncuk resuspend ve antikor uygun miktarda ekleyin. Daha sonra, oda sıcaklığında en az 10 dakika boyunca boncuk kuluçka. Manyetik boncukları çekim tamponuyla iki kez yıkayın ve 375 mikrolitre RIPiT seyreltme tamponunda boncukları yeniden askıya alın.
İmmünyağış kadar buz üzerinde boncuk saklayın. Flag alüse elution antikor-çiftli manyetik boncuklar ve dört santigrat derece bir ila iki saat boyunca nazik karıştırma ile kuluçka uygulayın. Manyetik boncukları bir mıknatısla yakalayın ve batı leke analizi için 15 mikrolitre süpernatant toplayın.
Daha sonra boncukları iso yıkama tamponu ile yedi kez yıkayın. 100 mikrolitre net numune tamponundaki manyetik boncukları yeniden sulayarak ve süspansiyonu 10 dakika boyunca buzüzerinde kuluçkaya yatırarak elution'ı denatüre etmeye devam edin. Kuluçka sırasında, düzenli olarak onları yeniden askıya almak için boncuk flick.
Manyetik boncukları bir mıknatısüzerinde yakalayın ve batı leke analizi için 15 mikrolitre elüsyon toplayın. Kalan elüasyonu yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın. RNA ayıklamak için, RIPiT elution için RNase içermeyen su ve fenol-kloroform isoamyl alkol 400 mikrolitre 320 mikrolitre ekleyin.
Karışımı girdap ve sonra 12,000 g beş dakika santrifüj. Ayrı bir tüp içine sulu faz 350 mikrolitre toplayın. Toplanan numuneye sodyum asetat, magnezyum klorür, glikojen ve etanol ekleyin ve karışımı bir gecede negatif 20 santigrat derecede inkübün.
Ertesi gün, pelet RNA santrifüj tarafından 12, 000 g 30 dakika için 4 derece santigrat ve% 70 etanol içinde yıkayın. Etanol yıkadıktan sonra, RNA'yı Herhangi bir ATP olmadan T4 polinükleotid kinaz veya PNK ile tedavi edin ve el yazması talimatlara göre fenol-kloroform saflaştırma yapın. Temiz RNA'yı 4,5 mikrolitre RNa içermeyen suda yeniden askıya alın.
RNA verimini ölçmek için, RNA'yı PNK'lı radyoetiketi ve el yazması talimatlara göre 32P etiketli ATP'ler etiketlendi. Boyut ve miktar standartları için düşük menzilli DNA merdiveni ve 20 ila 40 nükleotit sentetik oligo kullanın. Etiketli RNA'yı %26 üre-poliakrilamid jelüzerinde çözün.
El yazması talimatlara göre jeli kurutun ve yeterli sinyal algılanana kadar jeli fosfoscreen'e maruz bırakın. Bu teknik exon kavşak kompleksi veya EJC etkileşimlerini araştırmak için kullanılmıştır. RIPiT prosedüründeki her önemli adımdan arındırılı proteinlerin Batı leke analizi saflaştırılmış EJC'nin hem EIF4A3 hem de MAGOH içerdiğini göstermektedir.
Negatif kontrol, HNRNPA1, elüsyon da algılanmaz. RNA ayak izi sinyalinin gücü RNA protein etkileşimi miktarı ile ilişkilidir. RiPiT puromisin ile tedavi edilen hücrelere yapıldığında daha güçlü bir ayak izi gözlenir, bu da RNA'da EJC doluluk oranını artırır.
RIPiT'nin etkili olduğundan emin olmak için IP'nin verimliliğini batı lekelerine göre test etmek önemlidir. Ayrıca, derin sıralamaya geçmeden önce RNA'nın miktarını ve kalitesini değerlendirmek de önemlidir. 2018 yılında Singh laboratuarı bu tekniği exon bağlantı kompleksinin iki bileşimsel olarak farklı varyasyonlarını arındırmak ve RNA bağlama desenlerini tanımlamak için başarıyla kullanabilmektedir.
Araştırmacılar rna ayak izlerini otoradyografi ile tespit etmeyi seçerlerse, tüm uygun radyasyon güvenliği prosedürleri ve protokolleri izlenmelidir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, memeli hücrelerinden RNA:protein komplekslerinin endojen RNA bağlanma bölgelerini zenginleştirmek için RNA immünopresipitasyon in tandem (RIPiT) adı verilen bir yöntemi sunar. Bu teknik, spesifik RNA bağlanma proteinleri tarafından bağlanan RNA bölgelerinin tanımlanmasını sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Moleküler Biyoloji
- RNA Biyolojisi
Arka Plan
- RNA bağlanma proteinleri çeşitli hücresel süreçlerde önemli roller oynar.
- RNA:protein etkileşimlerini anlamak, gen düzenlemesini incelemek için esastır.
- RIPiT, bu etkileşimleri etkili bir şekilde analiz etmek için bir yöntem sunar.
- Bu yöntem, özellikle RNA bağlanma proteinleriyle bağlantılı hastalıklar bağlamında yararlıdır.
Çalışmanın Amacı
- RNA:protein komplekslerini zenginleştirmek için bir yöntem geliştirmek.
- Hastalarla ilişkili RNA bağlanma proteinlerinin çalışmasını kolaylaştırmak.
- RNA işleme mekanizmalarını araştıran araştırmacılara bir araç sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- RNA immunopresipitasyon in tandem (RIPiT) tekniği.
- Farklı RNA bağlanma proteinlerini hedef alan iki immünopresipitasyon.
- Zenginleştirilmiş RNA bölgelerinin dizilimi.
- UV-çapraz bağlanma bağımsız metodolojisi.
Ana Sonuçlar
- Farklı RNA:protein komplekslerinin başarılı bir şekilde zenginleştirilmesi.
- Spesifik RNA bağlanma proteinleri tarafından bağlanan RNA bölgelerinin tanımlanması.
- Yöntemin çeşitli proteinlere uygulanabilirliğinin gösterilmesi.
- RNA bağlanma proteinlerinin hastalıklardaki rolü hakkında içgörüler.
Sonuçlar
- RIPiT-Seq, RNA:protein etkileşimlerini incelemek için güçlü bir araçtır.
- Bu yöntem, hastalık bağlamlarında RNA bağlanma proteinlerini anlamamızı geliştirir.
- Gelecekteki uygulamalar terapötik hedefler hakkında içgörülere yol açabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
RIPiT-Seq enables biopharma R&D teams to map RNA footprints of specific protein complexes without UV crosslinking, expanding targetable RNA-binding proteins in disease-relevant systems. This supports mechanistic de-risking by clarifying cooperative RNA:protein interactions in pathways linked to neuropathies and cancer. The method enhances predictive confidence in target validation by isolating compositionally distinct complexes from background noise.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Identifies RNA regions bound by cooperative protein pairs, clarifying functional complexes in RNA regulation.
- Operational Value: Uses tandem immunoprecipitation to enrich specific RNA:protein interactions, reducing false positives from nonspecific binding.
- Predictive Value: Enables de-risking of RNA-binding protein targets by defining their functional partners in disease-associated pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative RNA footprint data for assessing binding site occupancy under experimental perturbations.
- Operational Value: Produces sequencing-ready libraries from purified RNA, enabling scalable profiling across conditions.
- Assay Readiness: Supports standardized workflows for comparing complex formation in wild-type versus perturbed cellular states.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to RNA-binding proteins implicated in neuropathies and cancer, supporting target linkage to disease mechanisms.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase complex identification with preclinical validation of RNA regulatory functions.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs prioritization of targets by revealing cooperative dependencies that modulate RNA processing.
Pipeline & Workflow Integration
RIPiT-Seq fits within the discovery biology phase, providing mechanistic insights that inform lead identification and preclinical de-risking strategies for RNA-targeted therapeutics.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about cooperative RNA-binding protein function by isolating footprints of defined complexes.
- Screening: Delivers quantitative, sequencing-based readouts that enable comparison of RNA occupancy across treatment groups.
- Analytics: Generates high-resolution RNA footprint maps that support statistical comparison of binding site enrichment.
- Translational Research: Connects complex-specific RNA binding to disease-relevant pathways, supporting biomarker-aligned target selection.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for probing RNA-protein interactions across multiple targets and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by resolving whether RNA-binding proteins act independently or in complexes.
- Operational Value: Enhances reproducibility through dual purification steps that limit background and improve signal-to-noise.
- Strategic Value: Supports go/no-go decisions by clarifying mechanistic context of RNA-binding protein targets early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated cooperative interactions in disease-linked pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoprecipitation, RNA handling, and sequencing library preparation.
- Dependent on availability of high-quality antibodies for sequential immunoprecipitation of epitope-tagged proteins.
- Necessitates RNase-free environments and optimized lysis conditions to preserve RNA-protein complexes.
- Best suited for cell culture systems where epitope tagging via CRISPR or transfection is feasible.
- Limited by the efficiency of both immunoprecipitation steps, requiring optimization for each antibody-protein pair.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:40
Cell Harvesting and Formaldehyde Treatment
2:50
FLAG Immunoprecipitation and RNase I Digestion
4:09
Affinity Elution and Magnetic Bead-antibody Conjugation
5:14
Second Immunoprecipitation
6:12
RNA Extraction and Analysis
7:51
Results: RNA and Protein Yields
8:38
Conclusion
