Name: Çift DNA cetvelleri tek Nükledotid çözünürlüğe sahip Ribosome translocation mekanizmasını Incelemek için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Öğrenin, çift DNA cetveli yöntemiyle ribozom translokasyonunu tek nükleotid çözünürlüğünde inceleyin. Bu teknik mRNA dinamiklerini ve nükleik asit yer değiştirmelerini moleküler biyolojide araştırmak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01GM111452, Y.W., S.X.) tarafından desteklenmektedir. Y. W. Welch Vakfı (E-1721) desteğini onaylar.

1. ribozom kompleksleri hazırlanması
<ol><li>TAM10 tampon, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM mg (OAc)2, 30 mm NH4CL, 70 mm KCL, 5 mm EDTA, 7 mm BME (2-mercaptoethanol) ve% 0,05 Tween20 oluşur. 1.000</li>
	<li>Tablo 1' de listelenen beş karışımlar hazırlayın. Not: ribozom MRE600 gerinim11oldu. EF-tu: uzama faktörü termo kararsız. EF-TS: uzama faktörü termo istikrarlı. GTP: guanozin trifosfat. PEP: phospho (enol) pyruvate.</li>
	<li>Ribozom kompleksler yapmadan önce 25 dakika için 37 °c ' de beş karışımını ayrı olarak kulbe etme. Tablo 2başına beş ribozom kompleksleri hazırlayın. Not: Post: translocation sonrası; Pre: ön translocation.</li>
	<li>Her beş ribozom kompleksleri bir 1,1 M sakaroz yastık üzerine ayrı olarak, hacim oranı 1:1 ile ekleyin. Her bir ultra-santrifüjde 2 h için 450.000 × g ile arındırın. Süpernatant kaldırmak ve TAM10 tampon ile Pelet Resuspension sonra-80 °c ' de ribozom kompleksleri geri yüklemek için bir boru kullanın.</li>
</ol>2. biotin kaplı cam kaydırakların hazırlanması
<ol><li>Cam kaydırakların ön temizliği<ol>
<li>Kısa ve geniş cam çanak 60,0 × 4,0 × 0,3 mm3 (L × W × T) boyutları ile 12 cam slaytlar yerleştirin.</li>
		<li>Cam tabağı aseton ile doldurun ve 5 dakika boyunca sonikat yapın. Sonra 5 kez ultra saf su ile slaytlar yıkayın ve su ile çanak 3/4 doldurun.</li>
		<li>Yemek doldurmak ve 20 dakika boyunca cam slaytları sonikat için 10 M KOH ekleyin. slaytları 5 kez suyla yıkayın.</li>
		<li>Etanol ekleyin ve 5 dakika için sonikat, etanol dışarı dökün ve sonra ayrı olarak kuru 300 ° c 3 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aminosilan kaplama<ol>
<li>12 temizlenmiş slaytları metanol içeren cam çanağa geri yerleştirin. 5 dakika sonicating tarafından metanol ile bir PEGylation Flask temiz, sonra 25 mL metanol, 1,25 mL su, 0,125 mL HAc, 0,25 mL 3-aminopropyltriethoxysilane (AYEO) ile doldurun.</li>
		<li>Hemen cam çanak içinde metanol hazırlanmış AYEO çözeltisi ile değiştirin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inküye yapın.</li>
		<li>Slaytlar su ile birkaç kez durulayın, sonra azot Temizleme ile kurutun. Kuru slaytları temiz cam yemeklerle yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PEGlation için<ol>
<li>NaHCO3 solüsyonu (8,4 mg/ml) ve pegylation tampon (37,5 mg Peg, 6 mg biyotinlenmiş Peg, 150 μL NaHCO3 çözeltisi) hazırlayın. 1 dakika 6.000 rpm at iplik tarafından iyi karıştırın.</li>
		<li>Her slaytta 25 μL PEG çözeltisi yerleştirin. Üstte diğer slayt ile kapak. İki slayt arasında hiçbir kabarcıklar olduğundan emin olun.  Slaytları boş bir pipet ucu kutusuna yerleştirin. Kutunun tesviye olduğundan emin olun ve yaklaşık 3 saat boyunca koyu bir çekmeceye yerleştirin.</li>
		<li>Slaytları su ile durulayın ve tekrar kurutun. Kuru slaytları, 2 haftaya kadar vakum altında oda sıcaklığında saklayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. manyetik ve kuvvet ölçümlerinden önce numune hazırlama
<ol><li>Makine bir plastik örnek iyi boyutlar 4 × 3 × 2 mm3 (L × W × D) ile. Tutkal bir parça biotin-kaplamalı cam (yaklaşık 5 mm uzunluğunda, kesme 60 mm uzunluğunda slaytlar Bölüm 2 hazırlanmış) alt yüzey üzerinde epoksi kullanarak.</li>
	<li>Numunenin içine 20 μL 0,25 mg/mL streptavidin sulu solüsyonu ekleyin ve 40 dakika boyunca oda sıcaklığında inküye yapın. Daha sonra TAM10 tampon ile örneği iyi iki kez durulayın.</li>
	<li>Ribozom kompleksler immobilize.<ol>
<li>Antibiyotikler olmadan: örnek iyi bir tampon kaldırmak için bir pipet kullanın, sonra 20 μl 0,1 μM ribozom kompleks ekleyin (MF-pre veya MF-post) örnek iyi. Ribozom kompleksi, mRNA üzerinde 5 '-End biotin ile yüzeyde streptavidin ile bağlayacaktır. 37 °C ' de 1 saat boyunca inküye yapın ve sonra TAM10 tampon ile bir kez durulayın.</li>
		<li>Hem neomisin hem de Fusidik asit kullanan deney için: 37 °c ' de neomisin ile MF öncesi kompleksi 10 dakika boyunca inkük; 37 °C ' de 20 dakika boyunca Fusidik asit ile EF-G ' i kulbin. Konsantrasyonları aşağıdaki gibidir: 0,1 μm ribozom Complex, 2 μm EF-G, 4 mm GTP, 4 mm Pep, 0,02 mg/ml piruvat kinaz, 0,2 mm neomisin, ve 0,25 mm Fusidik asit.</li>
		<li>Diğer antibiyotik deneylerini benzer şekilde gerçekleştirin. Konsantrasyonları aşağıdaki gibidir: 0,2 mM viomisin, 0,4 mM higromisin B, ve 0,25 mM Fusidik asit.</li>
		<li>Frameshifting çalışma için, MFNF-pre ve MFNF-Post kompleksler için yukarıdaki adımları tekrarlayın kaygan motif U6A. kullanım antibiyotikler Fusidik asit artı neomisin, ve tek başına Fusidik asit, sırasıyla.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Arabellek örnek iyi çıkarın, sonra 20 μl 1 μM biyotinlenmiş yoklama DNA iplikçik ekleyin ve oda sıcaklığında bir gecede inkübe. TAM10 tampon Ile oluşturulmuş DNA-mRNA dubleks bir kez durulayın.</li>
	<li>Arabellek örnek iyi kaldırın. Ardından, numunenin içine 20 μL 0,5 mg/mL streptavidin kaplı manyetik boncuk ekleyin ve 2 saat boyunca oda sıcaklığında inküye yapın.</li>
	<li>Numuneyi dikkatle bir tutucuya takın ve santrifüjün içine yerleştirin. 84 x g 'de 5 dakika santrifügleme yaparak yüzeyden ücretsiz manyetik parçacıkları çıkarın.</li>
</ol>4. manyetik ve kuvvet ölçümleri
<ol><li>Lazer açma<ol>
<li>Anahtarı kullanarak lazeri açın. Ardından güç düğmesine basın.</li>
		<li>Kilit amplifikatörünün hassasiyetini 1 (LIA1) mV 500 olarak ayarlayın ve yaklaşık 2 saat ısınma ve atomik magnetometre stabilize etmek için bekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Atomik manyetometrenin ayarlanması<ol>
<li>Enstrüman kontrol yazılımını çalıştırın ve ölçüm parametrelerini ayarlayın. Bazı parametreler her ölçümde biraz farklılık gösterebilir. Not: atomik magnetometre bir lazer (yukarıda açıklanan), bir SR830 kilit amplifikatörü (LIA1 olarak adlandırılır), SR530 kilit amplifikatörü (LIA2 olarak adlandırılır), DS345 (FG1 olarak adlandırılır) ve ATF20B (FG2 olarak adlandırılır) fonksiyon jeneratörleri, yüksek çözünürlüklü motor ve bilgisayar. Tüm bunlar protokolün Bu adımda açık olmalıdır.</li>
		<li>Motor hareketli modunu gürültü ve varsayılan konuma 0olarak ayarlayın. Lock tuşuna basın ön PANELINDE, LIA1 için geri 200 MV hassasiyetini ayarlayın.</li>
		<li>Lazerin geçerli ve gerilimini ayarlayın ve uygun rezonans zirvesine ve sinyal-gürültü seviyesini bulun. Ön paneldeki Sweep tuşuna basın. Not genlik/genişlik oranı 0,5 üzerinde olmalıdır ve faz değeri 5 derecelik daha az olmalıdır. Değilse, süpürme adımını yeniden yapın.</li>
		<li>Plug-in LIA2 çıkışı lazer geri bildirim frekansını kilitlemek için. Bu amplifikatör, rezonans12' deki lazer frekansını korumak için yardımcı bir sezyum hücresinin optik rotasyonunu ölçer. Durum ölçüm sonuna kadar kalır.</li>
		<li>Plug-in fonksiyon jeneratör FG2 giriş bir kare dalga (500 mVpp, 100 mHz) Referans sinyali olarak. Kare dalgası 100 pT 'ye karşılık gelir ve amplifikatörün geçerli çıkışını manyetik sinyale dönüştürmek için kullanılır. Fonksiyon jeneratörü çıkarın.</li>
		<li>Motor hareketli modunu iki yönlü ve varsayılan konuma 260 mm 'ye ayarlayın. atom sensörünün uygun sıcaklığını (~ 37 °c) sağlamak için sıcaklık kumandasının durumunu kontrol edin.</li>
		<li>Boş numune tutucusunun sinyallerini iki kez ölçerek tüm sistemin kararlılığını kontrol edin. İki izleri çıkararak istikrar ve gürültü seviyesini değerlendir. Tipik gürültü seviyesi ve dalgalanma 30 MS entegrasyon zamanında ± 2 pT olmalıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>Numuneyi magnetizing<ol>
<li>Numuneyi magnetizasyon istasyonuna hafifçe yerleştirin ve 2 dakika kalalım. Not: magnetizasyon İstasyonu kalıcı bir mıknatıs (~ 0,5 T) ve plastik bir spacer oluşur.</li>
		<li>Numuneyi örnek tutucuya geri koyun. Özellikle bağlı olmayan manyetik parçacıkları kaldırmak için 335,4 × g santrifüj kuvveti kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Kuvvetler uygulandıktan sonra manyetik ölçümler<ol>
<li>Örnek motor üzerine yüklemek için cımbız kullanın. Programı çalıştırmak için ön panelde Kilitle 'yi tıklatın. Bu arada, diğer numuneyi tutucuya yüklemek ve santrifüje yerleştirmek için cımbız kullanın. Kaplanmış cam tarafı santrifüjün merkezine yüz gerektiğini unutmayın. Not: numunenin moleküler etkileşimlerinde mekanik kuvvet uygulandıktan sonra numunenin manyetik sinyalini ölçmek için bir atomik Manyetometre kullanan kuvvet kaynaklı kalıntı magnetizasyon spektroskopisi (fırmalar) tekniği kullanılır. Burada, moleküler etkileşimler, ribozom kompleksinde DNA cetvel molekülleri ve mRNA arasındadır. Santrifüj hızını artırarak kuvvet kademeli olarak artar. Her kuvvet uygulandıktan sonra, motor atom sensörüne örnek çevirir ve sonra geri hareket eder. Bu nedenle, iki manyetik alan profilleri elde edilir, bir ileri tarama sırasında ve geriye doğru tarama sırasında diğer13. Biz sadece daha iyi sinyal-gürültü oranı nedeniyle tepe yüksekliği ayıklamak için ikinci kullanın. Mevcut en yüksek yükseklik (nA), kalibrasyon kare dalgasına dayalı olarak manyetik sinyal genliğine (pT) dönüştürülür.</li>
		<li>Her ölçüm yaklaşık 5 dakika sürmektedir. Motor 0 ' a döndüğünde ön panelde Kaydet 'i tıklayın. Dikkatle motor ve Santrifüjden örnekleri almak için cımbız kullanın. 335,4 ' e karşılık gelen başlangıç hızını kullanın × g (2000 rpm, malzeme tablosundalistelenen santrifüjün dakika başına devrim).</li>
		<li>İki numuneyi değiş tokuş ederek santrifüj hızını 100 rpm veya benzer adım boyutuna artırarak daha güçlü bir kuvvet uygulayın. Süreci dönüşümlü olarak kademeli kuvvet artırmak için; 10-12 veri noktalarının ardından tam bir kuvvet spektrum elde edilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Deneyi bitirme<ol>
<li>Planlanan tüm deneyler tamamlandığında, donanımı kapatın ve açık olduğu gibi ters düzende devam etme.</li>
		<li>Tutucunun örneklerini çıkarın ve temizlik ve gelecekteki kullanım için etanol içine batırın. Manyetik boncuk kontaminasyonu durumunda aseton ile örnek tutucuyu temizleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Veri Analizi<ol>
<li>Python çözümleme komut dosyasını açın ve tüm deneysel verileri girin. Referans olarak kare dalgayı girmek için Yük Meydanı 'nı tıklayın. Sonra arka plan olarak giriş kalan manyetik sinyali için temel Yükle 'yi tıklatın.</li>
		<li>Genel manyetik sinyal azalmayı B0olarak tanımlayın. Her manyetik sinyal azalma b b 0 ve yüzde olarak ifade normalleştirmek. FIRMALAR spektrumunu elde etmek için yüzde (B/B0) karşı santrifüj kuvveti çizin. Not: santrifüj kuvvet f , manyetik boncuk m (4,6 × 10− 15 kg), santrifüjlü hız w ve radyal r (7,5 cm burada) denklemi ile f = mw batmaz kütlesinden hesaplanır 2 r. tipik kuvvet çözünürlüğü 2-4 PN ve kuvvet aralığı 15-95 PN bu iş.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+structural+dynamics+in+translocation%3A+yet+another+functional+role+for+ribosomal+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA.</a> Quarterly Review of Biophysics. 50, 12(2017).</li>
<li>Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+ribosome+hands+the+A-site+tRNA+to+the+P+site+during+EF-G-catalyzed+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation.</a> Science. 345, 1188-1191 (2014).</li>
<li>Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual-luciferase+reporter+system+for+studying+recoding+signals%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals.</a> RNA. 4, 479-486 (1998).</li>
<li>Fang, Y., Treffers, E. E., Li, Y., Tas, A., Sun, Z., van der Meer, Y., de Ru, A. H., van Veelen, P. A., Atkins, J. F., Snijder, E. J., Firth, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+-2+frameshifting+by+mammalian+ribosomes+to+synthesize+an+additional+arterivirus+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient -2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 2920-2928 (2012).</li>
<li>Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+excursions+during+mRNA+translocation+mediate+broad+branching+of+frameshift+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways.</a> Cell. 160, 870-881 (2015).</li>
<li>Shirokikh, N. E., Alkalaeva, E. Z., Vassilenko, K. S., Afonina, Z. A., Alekhina, O. M., Kisselev, L. L., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+ribosome-mRNA+complexes+at+different+translation+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages.</a> Nucleic Acids Research. 38, 15(2010).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+pathways+of+-1+translational+frameshifting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic pathways of -1 translational frameshifting.</a> Nature. 512, 328-332 (2014).</li>
<li>De Silva, L., Yao, L., Wang, Y., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Well-defined+and+sequence-specific+noncovalent+binding+forces+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Well-defined and sequence-specific noncovalent binding forces of DNA.</a> Journal of Physical Chemistry B. 117, 7554-7558 (2013).</li>
<li>Yin, H., Xu, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+DNA+rulers+reveal+an+%22mRNA+looping%22+intermediate+state+during+ribosome+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Dual DNA rulers reveal an "mRNA looping" intermediate state during ribosome translocation.</a> RNA Biology. 15, 1392-1398 (2018).</li>
<li>Tsai, T. W., Yang, H., Yin, H., Xu, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+%22-1%22+and+%22-2%22+ribosomal+frameshiftings+revealed+by+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">High-efficiency "-1" and "-2" ribosomal frameshiftings revealed by force spectroscopy.</a> ACS Chemical Biology. 12, 1629-1635 (2017).</li>
<li>Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+study+of+ribosome+hierarchic+dynamics+at+the+peptidyl+transferase+center%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center.</a> Biophysical Journal. 99, 3002-3009 (2010).</li>
<li>Garcia, N. C., Yu, D., Yao, L., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+atomic+magnetometer+at+body+temperature+for+magnetic+particle+imaging+and+nuclear+magnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Optical atomic magnetometer at body temperature for magnetic particle imaging and nuclear magnetic resonance.</a> Optics Letters. 35, 661-663 (2010).</li>
<li>Yao, L., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range%2C+high-resolution+magnetic+imaging+of+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Long-range, high-resolution magnetic imaging of nanoparticles.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 5679-5682 (2009).</li>
<li>Kurkcuoglu, O., Doruker, P., Sen, T. Z., Kloczkowski, A., Jernigan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+structure+controls+and+directs+mRNA+entry%2C+translocation+and+exit+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">The ribosome structure controls and directs mRNA entry, translocation and exit dynamics.</a> Physical Biology. 5, 046005(2008).</li>
<li>Qu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+uses+two+active+mechanisms+to+unwind+messenger+RNA+during+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation.</a> Nature. 475, 118-121 (2011).</li>
<li>Jacks, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+ribosomal+frameshifting+in+HIV-1+gag-pol+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression.</a> Nature. 331, 280-283 (1988).</li>
<li>Schuwirth, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+bacterial+ribosome+at+3.5+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structures of the bacterial ribosome at 3.5 Å resolution.</a> Science. 310, 827-834 (2005).</li>
<li>Jia, H., Wang, Y., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+force+spectroscopy+reveals+ribosomal+motion+at+sub-nucleotide+steps%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Super-resolution force spectroscopy reveals ribosomal motion at sub-nucleotide steps.</a> Chemical Communications. 54, 5883-5886 (2018).</li>
</ol>

Yazarlar tarafından hiçbir potansiyel ilgi çatışması bildirildi.

Bizim çift cetvel tahlil, manyetik boncuklar iki temel roller oynar. İlk olarak, onlar güç dönüştürücülerinin olarak hizmet vermektedir, çünkü merkezkaç kuvveti onların batmaz kütle ile orantılı. İkincisi, boncuklar, şu anda en doğru manyetik sensör olan atomik Manyetometre ile algılanan sinyal taşıyıcılarıdır. Mekanik manipülasyon ve manyetik algılamayı birleştiren fırmalar tekniği, DNA cetvellerinin temeli olan kritik dağılma kuvvetlerine göre çok sayıda moleküler etkileşimi çözebilir. Çift cetvel tahlil benzersiz tran...

Biomoleküler deplasman, ilgili biyolojik fonksiyonların mekanizmasını inceleyerek temel bir parametredir. Belirli bir örnek, ribozom 'in haberci RNA(mRNA) üzerinde tam olarak üç nükleotides (NT) ile hareket ettiği, normal olarak ve bir, iki ya da diğer NT numaralarıyla üç hariç, bir,2, ribozom geçiş konumdur. frameshifting. Bu nedenle, farklı adım boyutlarını ayırt etmek için bir moleküler cetvel sistemi tek NT çözünürlüğü gereklidir. Daha büyük bir zorluk hem giriş hem de çıkış taraflarında ribozom hareketini araştırmanız. Başka bir deyişle, sadece bir çift cetvel sistemi ile biz mRNA düzgün ribosome üzerinden dişli olup olmadığını ortaya çıkarmak mümkün olacak, ya da iki tarafın farklı adım boyutları içinde bir bükülen veya ilmekledi mRNA konformasyon yol olan ara adımlar vardır ribozom.
Ribozom (mRNA 3 ' sonu) çıkış tarafında farklı adımlar çözme ilk zorluk gidermek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Çift Lusiferaz tahlil farklı okuma çerçeveleri ortaya çıkan farklı proteinlerin oranlarını ölçmek tarafından giderir3,4. Sadece mRNA 3 ' End için geçerlidir ve böylece translocation tam bir resim sağlamak için yetersiz. Kütle spektrometresi, ilgili kod yeniden düzenlemelerinin sonucu olarak farklı peptit parçalarını analiz edebilir5. Ama mRNA üzerinde ribozom hamle kaç NT için tespit edemez. Toe-baskı tahlil ribozom doğru mRNA dönüştürme 3 '-distal ucunda astar ters transkriptaz kullanan başka bir ortak yöntemdir6. Ancak, ribosome giren mRNA 5 ' End için geçerli değildir. Tek molekül yaklaşımlar ve floresan yöntemleri7de dahil olmak üzere diğer teknikler, tek NT çözünürlüğü elde etmek zordur.
Biz benzersiz ribosome-mRNA kompleksler içinde açılan mRNA giriş ve çıkış konumlarını hem de belirleyebilirsiniz çift DNA cetvel assay geliştirdik.  Cetvel DNAS, mRNA 'nın hangi ucunda olursa olsun, ribosome tarafından ortaya çıkarılan mRNA ile belirli sayıda basepairs (BP) ' nin dubleksler formunu içeren DNA oligomerdir. BP numaraları daha sonra translocation sırasında mRNA üzerindeki ribozom konumunu kesin olarak ortaya çıkarır. Dubliklerin BP numaraları, kuvvet kaynaklı kalıntı magnetizasyon spektroskopisi (firmalar)8' den elde edilen kritik ayrışma güçleri tarafından belirlenir. 2-3 pN kuvvet belirsizlik ile, kritik güçler tek NT çözünürlük sunmak için yeterlidir. DNA cetvelleri üzerinde bir bağlayıcı molekül uygulayarak, ribozom tarafından mRNA sterollerdir engellenmiş yan probed olabilir. Farklı ribozomal kesimleri böylece doğru çözülebilir. Biz başarıyla translokasyon9sırasında antibiyotikler tarafından sıkışmış mRNA benzersiz bir ilmekledi uyum ortaya koymuştur ve bir kaygan mRNA sırası10üzerinde birlikte farklı okuma çerçeveleri çözüldü. Bu makalede, ribozom kompleksleri hazırlanması, cam slaytlar yüzey functionalization, ribozom kompleksleri immobilizasyonu ve manyetik etiketli DNA cetvel ile hibridizasyon dahil çift cetvel tahlil, ayrıntılarını açıklar moleküller, Manyetik algılama ve kuvvet spektrum analizi FIRMALARı tarafından.

<table><tbody><tr><td>Stiren Şerit Sanayi</td><td>Şehri</td><td>MS-861</td><td></td></tr><tr><td>Cam slaytlar</td><td>Buharlaştırılmış Kaplamalar</td><td></td><td>60.0 & kez; 4.0 & kez; 0.3 mm 3</td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>Millipore Sigma</td><td>A6283-500ML</td><td></td></tr><tr><td>3-Aminopropiltrietoksisilan</td><td>UCT spesiyaliteleri</td><td>21400088</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-SVA</td><td>Laysan Bio</td><td>154-82</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG-SVA</td><td>Laysan Bio</td><td>152-84</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>Millipore Sigma</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Epoksi yapıştırıcı</td><td>Devcon</td><td>31345</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>ThermoFisher</td><td>434301</td><td></td></tr><tr><td>Fusidik Asit</td><td>Millipore Sigma</td><td>F0756-1G</td><td></td></tr><tr><td>Neomisin Sülfat</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td></td>1458009</tr><tr><td>Viomisin Sülfat</td><td>Millipore Sigma</td><td>1715000</td><td></td></tr><tr><td>Higromisin</td><td>invitrojen</td><td>10687-010</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>T5941-100G</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum asetat</td><td>Millipore Sigma</td><td>M5661-50G</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum klorür</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9434-500G</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Millipore Sigma</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>GIBCO</td><td>774750</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Millipore Sigma</td><td>M6250-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1379-250ML</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Millipore Sigma</td><td>G8877-100MG</td><td></td></tr><tr><td>PEP</td><td>Millipore Sigma</td><td>P7127-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Piruvat Kinaz</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1506-5KU</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>S7903-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td><td>ThermoFisher</td><td>11205D</td><td></td></tr><tr><td>mRNA</td><td>Oligo Entegre DNA Teknolojileri</td><td>133899727</td><td>5&prime;-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AUU AAA UA AAU AUA AUG UUU AAU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG CUG AAC UC-3 & prime; &nbsp;</td></tr><tr><td>DNA Oligo</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>157468630</td><td>3?- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5?&nbsp;</td></tr><tr><td>DNA Oligo</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>164845370</td><td>3?-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5' &nbsp;</td></tr><tr><td>DNA Oligo</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>157468628</td><td>3?-AAA, ATC, CCG, CGT, TAG, AAC, UGG, GG/TEGBio/-5' &nbsp;</td></tr><tr><td>DNA Oligo</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>163472705</td><td>3?-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5' &nbsp;</td></tr><tr><td>DNA Oligo</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>138678130</td><td>3?-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5'</td></tr><tr><td>DNA Oligo</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>138678131</td><td>3?-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5' &nbsp;</td></tr><tr><td>DNA Oligo</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>138678132</td><td>3?-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5?&nbsp;</td></tr><tr><td>DNA Oligo</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>138678133</td><td>3?-GTT, AGA, TGA, CGA, CTT, CTC, GGG/TEGBio/-5' &nbsp;</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5427R</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Ultrasantrifüj</td><td>Hitachi</td><td>CS150FNX</td><td></td></tr><tr><td>Vorteks karıştırıcı</td><td>VWR</td><td>VM-3000</td><td></td></tr><tr><td>Kilitli Amplifikatör</td><td>Stanford Araştırma Sistemleri</td><td>SR530</td><td></td></tr><tr><td>Kilitli Amplifikatör</td><td>Stanford Araştırma Sistemleri</td><td>SR830</td><td></td></tr><tr><td>Lazer</td><td>Newport</td><td>TLB-6918-D</td><td></td></tr><tr><td>Fonksiyon üreteci</td><td>Stanford Araştırma Sistemleri</td><td>DS345</td><td></td></tr><tr><td>Fotoğraf dedektörleri</td><td>Thorlabs</td><td>DET36A</td><td></td></tr></tbody></table>

Çift dna cetvelleri tek nükledotid çözünürlüğe sahip ribosome translocation mekanizmasını incelemek için

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

Ribozom translokasyon tam olarak üç nükleotid (NT) tarafından mRNA üzerinde ribozomal hareket anlamına gelir, hangi protein sentezi merkezi adımdır. Mekanizmasını araştırmak için iki temel teknik şart vardır. İlki, ribozom 'ın 3 NT 'den başka tarafından hareket ettiği frameshifting 'den normal translokasyon çözümünü çözebilecek tek NT çözünürlüğüyle olur. İkincisi, translocation tüm resmi aydınlatmak için mRNA giriş ve çıkış kenarlarını prob yeteneğine sahiptir. Biz DNA-mRNA duplexes kritik ayrışma güçleri dayanmaktadır çift DNA cetvel tahlil rapor, kuvvet kaynaklı kalıntı magnetizasyon spektroskopisi (firmalar) ile elde.  2-4 PN kuvvet çözünürlüğü ile çift cetvel tahlil farklı translokasyon adımlarını ayırt etmek için yeterlidir. Uzun bir bağlayıcı yoklama DNAs üzerinde uygulayarak, mRNA pozisyonu her iki taraf için belirlenecek şekilde ribosome karşı tarafında mRNA ulaşabilir. Bu nedenle, Çift cetvel tahlil benzersiz ribozom translocation araştırmak için uygundur, ve genel olarak nüklik asit hareketi. Biz bir ilmekledi mRNA konformasyonu ve frameshifting normal translokasyon çözüldü belirtilen temsili sonuçlar gösterir.

Şekil 1 , önemli bileşenlerin algılama düzenini ve fotoğraflarını gösterir. Manyetik algılama, tarama düzenini kullanarak atomik Manyetometre ile elde edilir (Şekil 1A)13. Numune, doğrusal bir motora monte edilmiş bir çubuk üzerine yerleştirilir. Motor, numuneyi Manyetik kalkan içindeki atomik sensörüne aktarır, sonra da boşaltılması için orijinal siteye geri döner. Atomik magnetometre, numune taraması sırasında manyetik ...

Çift DNA cetvel tahlil ribozom translocation sırasında mRNA konumunu belirlemek için geliştirilmiştir, hangi oluşmuş DNA-mRNA dubliklerin ayrışma güçleri dayanır. Tek nükle çözünürlüğü ve mRNA 'nın her iki ucunda ulaşmanın yeteneği ile, ribozom translokasyon ve prob diğer nüklik asit yerleşimleri için mekanik öngörüler sağlayabilir.

Çift DNA cetvelleri tek Nükledotid çözünürlüğe sahip Ribosome translocation mekanizmasını Incelemek için

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

Çift DNA cetveli testi ribozom translokasyonu için mekanistik kavrayışlar sağlayabilir ve diğer nükleik asit yer değiştirmelerini inceleyebilir. Çift DNA cetveli testimiz şu anda ribozom komplekslerinde mRNA'nın giriş ve çıkış kenarlarını tek nükleotit çözünürlüğü ile objektif olarak inceleyebilen tek yöntemdir. Benzer yöntemler de DNA bağlama gücü ve keforik ilaçların seçiciliğini ölçmek için uygulanır.Yöntemin görsel gösterimi, tekniğimizin avantajlarını sezgisel olarak göstermemiz ve diğer araştırmacıların daha fazla uygulamaya dönüştürmelerine yardımcı olmak için iyi bir şanstır. Başlamak için, iki milimetre üç milimetre üç milimetre boyutları ile merkezinde bir küp sondaj tarafından bir stiren şerit ile iyi bir plastik örnek olun. Daha sonra, epoksi kullanarak, alt yüzeye yaklaşık beş milimetre uzunluğunda biyotin kaplı cam bir parça tutkal.Numune kuyusuna mililitre streptavidin sulu çözelti başına 0,25 miligram lık 20 mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında 40 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra tam10 arabellek ile iki kez iyi yıkın. Antibiyotik olmadan ribozom kompleksleri immobilize etmek için, ilk iyi örnek tampon kaldırmak ve örnek kuyuya 0,1 mikromografi MF-Pre veya MF-P

dual-dna-rulers-to-study-mechanism-ribosome-translocation-with-single

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Burada iki optik kapalı kalmış mikro-arasında asılı tek bir DNA molekülü ile etkileşim tek floresan etiketli protein molekülü tespit etmek için cihazları ve yöntemleri tarif etmektedir.

Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

Optik cımbız, tek tek molekülleri 5' ve 3' uçlarından gererek RNA katlanmasını incelemek için kullanılmıştır. Burada, cımbızlama için RNA moleküllerini sentezlemek, aletin kalibrasyonu ve tek molekülleri manipüle etmek için yöntemler için yaygın prosedürler açıklanmaktadır.

Optik cımbız ile Tek RNA Moleküllerin Nanomanipulation

Ribonucleotides genom ökaryotik nükleer DNA ikileşmesi sırasında dahil en bol kanonik olmayan nükleotit arasındadır. Düzgün kaldırdıysanız, ribonucleotides DNA hasarı ve mutagenesis neden olabilir. Burada, ribonucleotide birleşme DNA ve mutajenik etkileri içine bolluk değerlendirmek için kullanılan iki deneysel yaklaşımlar mevcut.

Eğitim Ribonucleotide ortaklık: Strand-özel hafiye-in Ribonucleotides Maya genom ve Ribonucleotide kaynaklı Mutagenesis ölçme

3D tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi, yaşayan bakteri hücrelerinde floresan olarak etiketlenmiş proteinlerin mekansal konumlarını ve hareket yörüngelerini araştırmak için kullanılır. Burada açıklanan deneysel ve veri analizi protokolü, sitosolik proteinlerin havuzhalinde ki tek moleküllü yörüngelere dayalı yaygın diffüzif davranışlarını belirler.

Tek Moleküllü İzleme Mikroskobu - Sitosolik Moleküllerin Diffüz Durumlarını Belirlemede Bir Araç

Burada açıklanan, nano-mikromolar florofor konsantrasyonlarında tek molekül görüntüleme için metal kaplı cam mikroskopi kapak kapağındaki nanoapertures dizileri olan sıfır mod dalga kılavuzlarının paralel üretimi için bir nanosfer litografi yöntemidir. Yöntem, bir dalga kılavuzu şablonu oluşturmak için kolloidal kristal kendi kendine montajdan yararlanır.

Yüksek Konsantrasyonlı Tek Moleküllü Mikroskopi için Sıfır Mod Dalga Kılavuzlarının İmalatı

Burada bakterilerde RIBO-seq için numune toplama ve hazırlama aşamalarını açıklıyoruz. Bu yönergelere göre hazırlanan kütüphanelerin sıraya dizilimi, kapsamlı biyoinformatik analiz için yeterli veri ile sonuçlanır. Sunduğumuz protokol basittir, standart laboratuvar ekipmanlarını kullanır ve lizizden kütüphanelerin eldeine kadar yedi gün sürer.

Bakterilerde RIBO-seq: NGS Dizilimi için Örnek Toplama ve Kütüphane Hazırlama Protokolü

Bu protokol, optik cımbız kullanarak RNA-protein etkileşimlerini incelemek için eksiksiz bir deneysel iş akışı sunar. Optik cımbızın konfokal mikroskopi ile kombinasyonu da dahil olmak üzere çeşitli olası deneysel kurulumlar özetlenmiştir.

Çeviri Yönetmeliğinde RNA-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Optik Cımbız

Tek moleküllü floresan enerji transferi ribozomal protein sentezi sırasında tRNA dinamiklerini izleyen bir yöntemdir. Bireysel ribozomları izleyerek, mekanizmalara ışık tutan inhomogeneöz popülasyonlar tanımlanır. Bu yöntem, diğer birçok karmaşık biyosistemdeki dinamik işlev ilişkilerini ortaya çıkarmak için genel olarak biyolojik konformasyon değişikliklerini izlemek için kullanılabilir. Tek molekül yöntemleri, ortalama etki nedeniyle geleneksel topluluk yöntemleriyle erişilemeyen oransız...

Ribozom Protein Sentezinin Tek Molekül floresan Enerji Transferi Çalışması

Ko-translasyonel etkileşimler, yeni zincir modifikasyonlarında, hedeflemede, katlamada ve montaj yollarında çok önemli bir rol oynamaktadır. Burada, ökaryot Saccharomyces cerevisiae modelinde bu etkileşimlerin in vivo, doğrudan analizi için bir yöntem olan Seçici Ribozom Profillemeyi açıklıyoruz.

Ko-Translasyonel Etkileşim Ağlarının Seçici Ribozom Profilleme ile Küresel Tanımlanması

Ribozomların çevrilmesi, kodon başına üç nükleotidin peptitlere şifresini çözer. Ribozom profillemesi ile yakalanan mRNA boyunca hareketleri, karakteristik üçlü periyodiklik sergileyen ayak izlerini üretir. Bu protokol, tüm transkriptom düzeyinde aktif olarak çevrilmiş açık okuma çerçevelerini tanımlamak için ribozom profil oluşturma verilerinden bu belirgin özelliği deşifre etmek için RiboCode'un nasıl kullanılacağını açıklar.

De novo Aktif Olarak Çevrilmiş Açık Okuma Çerçevelerinin Ribozom Profil Oluşturma Verileri ile Tanımlanması

Protokol, Drosophila melanogaster'deki X veya Y kromozomu ribozomal DNA lokusundan türetilen ribozomal RNA transkriptlerini ayırt etmek için tek nükleotid polimorfizmlerine duyarlı floresan in situ hibridizasyon (SNP-FISH) yöntemini tanımlar.

Tek Nükleotid Polimorfizmine Duyarlı FISH Drosophila melanogaster'de Locus'a Özgü Ribozomal RNA Transkripsiyonunun Tespiti

Öğrenin, çift DNA cetveli yöntemiyle ribozom translokasyonunu tek nükleotid çözünürlüğünde inceleyin. Bu teknik mRNA dinamiklerini ve nükleik asit yer değiştirmelerini moleküler biyolojide araştırmak için kullanılır.

Çift DNA cetvelleri tek Nükledotid çözünürlüğe sahip Ribosome translocation mekanizmasını Incelemek için

Daha fazla video keşfet