Coxsackievirus 'a karşı antiviral adayların tanımlanması için viral giriş analizinin kullanımı ve moleküler yerleştirme Analizi A16
15 Temmuz 2019
Protokol amacı, aday viral giriş inhibitörleri tanımlamak için kullanılabilecek viral giriş ile ilgili farklı deneyleri göstermek için.
Bu protokol, mekanizma odaklı bir yaklaşımla potansiyel antiviral küçük moleküllerin keşfine yardımcı olabilir. Ek çalışma süresi, enfeksiyonun hangi adımında küçük molekülün antiviral aktivitesini sergilediğini belirler. Moleküler yerleştirme küçük molekül ve viral proteinler arasındaki etkileşimi tahmin eder.
Viral enfeksiyon öncesinde ev sahibi hücreler üzerinde ilaçların etkisini değerlendirmek için, iyi kaplama yoğunluğu başına beş kez 10 iki kez 10 tohum RD hücreleri. Hücreleri bir gecede %5 karbondioksit kuvözde 37 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi sabah, rd monolayer her iyi ilgi bir test bileşik ile tedavi, triplicate, bazal orta bir mililitre toksik olmayan konsantrasyonlarda bir veya dört saat.
Tedavi kuluçka sonunda, bir saat boyunca iyi bazal orta 300 mikrolitre 50 plak oluşturan birim virüs eklemeden önce PBS bir mililitre ile hücreleri yıkayın, her 15 dakikada sallanan. Enfeksiyon kuluçka sonunda, PBS ile hücreleri yıkayın ve taze bazal orta bir mililitre ile hücreleri bindirme 0.8% metilselüloz içeren. Hücre kültürü kuluçka 72 saat sonra, PBS iki mililitre ile her iyi yıkayın ve 15 dakika boyunca iyi başına% 37 formaldehit 0.5 mililitre ile hücreleri düzeltmek.
Fiksasyon sonunda, pbs ile kuyuyıkama ve iyi başına% 0,5 kristal mor çözelti0.5 mililitre ile hücreleri leke. İki dakika sonra, kuyuları hafif bir su akışıyla yıkayın ve plakanın kurumasını bekleyin. Sonra sayma için beyaz bir ışık kutusu üzerine plaka yerleştirin ve formüle göre coxsackievirus enfekte hücrelerin yüzdesini hesaplamak.
Moleküler yerleştirme analizi için, PubChem'den test bileşiklerinin 3Boyutlu moleküllerini indirin. Bir molekülün yüklenen bir 3B yapısı yoksa, 2B yapısını indirin veya uygun bir moleküler program aracılığıyla yapıyı bir 3B moleküle dönüştürmek için SMILE dize dizisini kullanın. Sonra, RCSB Protein Veri Bankası'ndan viral biyolojik montaj ünitesi indirin.
Uygun bir biyo-bilgi işlem programı kullanarak, Protein Veri Bankası dosyasından çözücüleri silin, Dunbrack 2010 rotamer kitaplığından alınan verileri kullanarak eksik yan zincirleri değiştirin ve daha önce bildirildiği gibi yapıya hidrojen ve patlayıcı ekleyin. Test bileşiklerini hazırlanan virüs ünitesine yerleştirmek için, test bileşik dosyasını Ligand olarak California Üniversitesi San Francisco Chimera'ya yükleyin ve kör yerleştirme yapmak için reseptör olarak hazırlanan viral proteinin tamamını seçin. Ek yerleştirme için, yerleştirme alanını, arama hacmini daha da azaltarak kör yerleştirme sonuçlarından elde edilen ilgi bölgelerine viral proteinle sınırlandırın.
Ardından bağlama modu konumlarını analiz etmek için yerleştirme dosyasını uygun bir moleküler grafik sistemine yükleyin. Herhangi bir atom seçeneği ile polar temasları tanımlayan, viral protein bileşik polar temas bulmak için ligand seçin. Bu temsili deneyde test edilen küçük moleküllerin her ikisi de, viral enfeksiyon dan önce konak hücrelerin ön tedavisinde veya enfeksiyon sonrası tedavide olsun, sadece coxsackievirus A16 enfektivitesine karşı marjinal bir etki yaratmaktadır.
Buna karşılık, moleküller etkili bir co-ek tedavi de% 80'den fazla enfeksiyon ortadan, iki bileşikler infeksiyon sırasında konak hücre yüzeyinde virüs parçacıkları ile aynı anda mevcut olduğunda en etkili olduğunu düşündürmektedir. Akış sitometri sitometri sitometrisi bazlı bağlama analizi, iki tanenin konak hücrelere viral parçacık bağlanmasını engelleyerek coxsackievirus A16 enfekte girişini engellediğini doğrulamaktadır. Tanenlerin moleküler kenetlenme her ikisi de coxsackievirus pentamer kanyon bölgesinde bağlamak için tahmin olduğunu gösterir, cep faktörü tutan cep girişinin hemen üzerinde ve coxsackievirus bağlama ve konak hücreye giriş aracılık için önemli bir rol oynar.
Bu yüzey projeksiyonlarında, cep girişinin etrafındaki küçük moleküllerin kutupsal temaslarından öngörülen benzersiz kalıntılar asparagin-85, lizin-257 ve asparagin-417 ile iki tanen arasında ortak olarak görülebilir. Moleküler yerleştirme için, bağlayıcı kareler sıralamasında viral proteinin topolojisinin dikkate alınması gerekir. Ek deneyler rekombinant virüsler üzerinde bileşiğin antiviral aktivitesitest içerebilir, amino asitler üzerindeki mutasyonlar ilacın etkinliği için önemini doğrulamak için keşfedilen.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, mekanizma odaklı bir yaklaşım aracılığıyla potansiyel antiviral küçük moleküllerin keşfedilmesine yardımcı olur. Aday viral giriş inhibitörlerini belirlemek için viral girişle ilgili çeşitli analizleri örneklemektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Viroloji
- Farmakoloji
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Viral girişi anlamak, antiviral terapilerin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir.
- Küçük moleküller, viral girişi çeşitli aşamalarda inhibe edebilir.
- Analizler, etkili antiviral adaylarının belirlenmesine yardımcı olabilir.
- Mekanizma odaklı yaklaşımlar, keşif sürecini iyileştirir.
Çalışmanın Amacı
- Viral giriş inhibitörlerini belirlemeye yönelik analizleri örneklendirmek.
- Küçük moleküllerin antiviral aktivitesini değerlendirmek.
- Gelecekteki antiviral ilaç keşifleri için bir çerçeve sunmak.
Kullanılan Yöntemler
- Küçük molekülün etkilediği enfeksiyon aşamasını belirlemek için ekleme zamanı deneyi.
- Küçük moleküller ve viral proteinler arasındaki etkileşimleri öngörmek için moleküler docking.
- RD hücreleri için hücre ekimi ve uygulama protokolleri.
- Viral enfeksiyon öncesinde ilacın konak hücreler üzerindeki etkisinin değerlendirilmesi.
Temel Sonuçlar
- Antiviral özelliklere sahip aday küçük moleküllerin belirlenmesi.
- Enfeksiyon sırasında antiviral aktivitenin zamanlamasına ilişkin öngörüler.
- Küçük moleküller ve viral proteinler arasındaki öngörülen etkileşimler.
- Konak hücrelerin antiviral tedavilere verdiği yanıtların değerlendirilmesi.
Sonuçlar
- Protokol, antiviral keşif için sistematik bir yaklaşım sunmaktadır.
- Deneyler, potansiyel viral giriş inhibitörlerini etkili bir şekilde belirleyebilir.
- Gelecekteki çalışmalar, ilaç geliştirme için bu çerçeve üzerine inşa edilebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Alaka
Mekanistik antiviral keşif, erken enfeksiyonun kritik bir dönüm noktası olan viral girişi engelleyen bileşiklerin hassas bir şekilde tanımlanmasını gerektirir. Bu protokol, antiviral aktivitenin aşamasını belirleyerek ve viral proteinlerle olan moleküler etkileşimleri öngörerek hedef doğrulamasına olanak tanır. Bu tür risk azaltma işlemleri, antiviral geliştirme süreçlerinde öncü bileşiklerin tanımlanmasını ve portföy önceliklendirmesini destekler.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: İlaç ekleme zamanı analizi aracılığıyla küçük moleküllerin antiviral aktiviteyi enfeksiyonun hangi aşamasında gerçekleştirdiğini belirleyerek terapötik hipotezi sorgular.
- Operasyonel Değer: Hedef doğrulama ve mekanistik risk azaltmayı desteklemek için enfeksiyon inhibisyonuna dair kantitatif okumalar sağlar.
- Öngörücü Değer: Viral kapsid proteinleri üzerindeki bağlanma bölgelerini öngörmek için moleküler docking yöntemini kullanır ve kalıntı düzeyinde hedef onaylanmasına olanak tanır.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Viral partiküllerin konak hücrelere tutunmasını kantitatif olarak ölçmek için akış sitometrisi tabanlı bağlanma analizleri kullanır.
- Operasyonel Değer: Farklı koşullar altında bileşik etkinliğinin tekrarlanabilir şekilde değerlendirilmesi için viral inaktivasyon ve ekleme zamanı analizlerini standartlaştırır.
- Ölçeklenebilirlik: Alt tarama iş akışları ve analizlerin yeniden kullanımı için valide edilmiş biyolojik sistemler (RD hücreleri) hazırlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Erken giriş inhibisyon verilerini, ortogonal assay doğrulaması yoluyla antiviral etkinlikteki öngörüsel güvenle ilişkilendirir.
- Mekanistik Risk Azaltma: Docking ile öngörülen kalıntıları (örneğin, asparagine-85, lysine-257, asparagine-417) fonksiyonel bağlanma verileriyle ilişkilendirerek hedef etkileşimini doğrular.
- Preklinik Model Uygunluğu: İnhibitör aktivitesini fizyolojik olarak ilgili bir sistemde değerlendirmek için hastalıkla ilgili Coxsackievirus A16 enfeksiyon modellerini kullanır.
İş Akışı ve Pipeline Entegrasyonu
Bu yöntem, erken hedef doğrulamadan öncü bileşik tanımlamaya kadar antiviral keşif sürekliliğine entegre olarak, mekanistik ve kantitatif verilere dayalı devam/dur kararlarını destekler.
- Keşif Biyolojisi: Bileşiklerin viral bağlanma inhibisyonu veya giriş sonrası mekanizmalar aracılığıyla etkili olup olmadığını belirleyerek hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Viral bağlanma, inaktivasyon ve ekleme zamanı ölçümleri için standartlaştırılmış protokoller aracılığıyla analiz hazırlığını sağlar.
- Analitik: Koşullar arası karşılaştırma için kantitatif bağımlı değişkenler (yüzde enfeksiyon inhibisyonu, bağlanma afinitesi öngörüleri) üretir.
- Translasyonel Araştırma: Viral kapsid bölgelerindeki hedef bölge etkileşimini doğrulayarak, giriş inhibisyon verilerini preklinik ilerlemeye bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Diğer picornavirüslere veya zarfsız virüslere karşı antiviral aday taraması için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Tutunma öncesi, bağlanma ve bağlanma sonrası antiviral etkileri ayırt ederek mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Ekleme zamanı, bağlanma ve inaktivasyon formatları arasında analiz standardizasyonunu ve tekrarlanabilirliğini sağlar.
- Stratejik Değer: Kaynak yoğun öncü optimizasyon süreci öncesinde hedef etkileşimini doğrulayarak karar verme süreçlerini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Fonksiyonel analizler ve yapısal kenetlenme (docking) ile çift doğrulamaya sahip bileşiklerin riskle uyumlu önceliklendirilmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Viroloji, hücre kültürü ve moleküler docking yazılımları (örneğin, UCSF Chimera) konusunda uzmanlık gerektirir.
- Virüs işlemleri ve plak deneyi uygulamaları için uygun biyogüvenlik seviyesine sahip altyapıya erişim gereklidir.
- Verilerin tutarlı şekilde yorumlanması için viroloji ve hesaplamalı biyoloji birimleri arasında ekipler arası standardizasyon gerektirir.
- Deneylerin RD hücreleri dışındaki diğer viral sistemlere veya hücre hatlarına genişletilmesi durumunda adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Pratik sınırlama: Docking doğruluğu, protein yapısının kalitesine ve ligand hazırlığına bağlıdır; bu durum mutajenez veya bağlanma deneyleri yoluyla doğrulama gerektirir.
