Name: Coxsackievirus a karşı antiviral adayların tanımlanması için viral giriş analizinin kullanımı ve moleküler yerleştirme Analizi A16 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Keşfedin, viral giriş analizi ve moleküler yerleştirme kullanarak Coxsackievirus A16'ya karşı antiviral adayları nasıl tanımlayacağınızı. Bu yöntem, küçük moleküllerin antiviral aktivitesini değerlendirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Dr Joshua Beckham için Austin Texas Üniversitesi 'nde moleküler yerleştirme ile teknik destek için minnettar. Bu çalışmada, Tayvan bilim ve Teknoloji Bakanlığı (MOST107-2320-B-037-002-C.-JL ve L.-m. ' den fon tarafından kısmen destekleniyordu; MOST106-2320-B-038-021 ve MOST107-2320-B-038-034-MY3 için L.-m).

Not: Tüm hücre kültürü ve virüs enfeksiyonları, işlenen numunelerin Biyogüvenlik düzeyine uygun sertifikalı Biyogüvenlik davlumbazlarında yapılmalıdır. Küçük moleküllerin chebulagik asit (CHLA) ve punicalagin (PUG) iki tannin-sınıfı, etkili CVA16 enfeksiyon9engellemek için gözlenen, aday inhibitör ajanlar örnekleri olarak kullanılır. Viroloji teknikleri, virüs yayılma, virüs titer belirlenmesi ve plak şekillendirme birimleri (PFU) veya enfeksiyon çokluğu (MOı) kavramları temel ilkeler için, okuyucu referans10denir.
1. hücre kültürü, virüs hazırlama, bileşik hazırlama ve bileşik sitotoksisite
<ol><li>İnsan rhabdomiyoskomi (RD) hücreleri CVA16 enfeksiyon11için ev sahibi hücrelerdir. RD hücrelerini, 10 ml 'lik Dulbecco 'nun modifiye kartal Orta (dmem) ile 10% fetal sığır serumu (FBS) ile tamamlayıcı olarak büyütün, 200 U/ml penisilin G, 200 μg/ml streptomisin ve 0,5 μg/ml Amfoterisin B, T-75 ' d a% 5 Co2 ' de 37 °c ' de flsorat.</li>
	<li>RD hücrelerinde virüsü yaymak ve PFU/ml viral titresi belirlemek tarafından CVA16 hazırlayın. Optimize edilmiş protokol için lütfen11' e başvurunuz.</li>
	<li>Test bileşiklerini ve denetimlerini ilgili çözücüleri kullanarak hazırlayın: Örneğin, CHLA ve PUG 'yi dimetil sülventide (DMSO) içinde çözülür. Tüm enfeksiyon adımları için, bazal orta DMEM artı 2% FBS ve antibiyotikler oluşur. Not: Test bileşik tedavilere DMSO son konsantrasyonu eşit veya% 0,25 altında deneyler; 0,25% DMSO karşılaştırılması için deneyleri bir negatif kontrol tedavisi olarak dahildir.</li>
	<li>RD hücrelerinde XTT ((2, 3-bis [2-metoksi-4-Nitro-5-sulfophenyl] 5-fenylamino)-karbonil]-2H-tetrazolium hidroksit) gibi reaktif belirlenmesi ile ilgili test bileşiklerinin sitotoksisite tahlili gerçekleştirin. Ayrıntılı protokol için lütfen12' ye başvurun. Üreticinin protokolüne göre GraphPad Prism gibi bir analitik yazılım kullanarak test bileşiklerinin sitotoksisite konsantrasyonlarını belirleyin. Hücre kalabilirliği önemli ölçüde etkilemez ilaç konsantrasyonları (≥ 95% uygun hücreler) çalışmanın geri kalanı için kullanılır.</li>
</ol>2. zaman-of-ilaç-ek assay
<ol><li>
Viral enfeksiyondan önce ev sahibi hücrelerde ilaçların etkisini değerlendirmek için (ön tedavi)
	<ol>
<li>2 x 105 hücreli/iyi bir tohumlama yoğunluğu 12-kuyu plakaları IÇINDE tohum RD hücreleri. Bir monolayer elde etmek için% 5 CO2 kuluçko içinde bir gecede 37 °c ' de inkübe.</li>
		<li>RD hücrelerini, 1 h veya 4 h için 1 mL bazal medya hacminde sitotoksisik olmayan konsantrasyonlarda (adım 1,4 ' den belirlenir) test bileşikleri ile tedavi edin.</li>
		<li>1-2 ml PBS ile yıkama hücreleri eklenmeden önce 50 PFU/Well bazal orta virüs (inokulumunu son hacmi olan 300 μL) için 1 h. her 15 dakikada bir taş plaka.</li>
		<li>Enfeksiyonun ardından, PBS kullanarak monolayerleri tekrar yıkayın, sonra% 5 CO2 kuluçte 37 °c ' de daha fazla inkübasyon için% 0,8 metilselüloz Içeren 1 ml bazal medyaya bindirin.</li>
		<li>72 sonra inkübasyon, bindirme medyayı çıkarın ve 2 mL PBS kullanarak kuyuları yıkayın.</li>
		<li>15 dakika boyunca 0,5 mL% 37 formaldehit kullanarak kuyuları düzeltin.</li>
		<li>Süpernatant çıkarın ve PBS kullanarak tekrar yıkayın.</li>
		<li>0,5 mL% 0,5 kristal menekşe çözeltisi kullanarak kuyuları lekeleyin. Sonra 2 dakika içinde leke solüsyonu çıkarın ve hava kurutmadan önce hafif bir su akışı ile kuyuları yıkayın.</li>
		<li>Plaka beyaz ışık kutusuna yerleştirerek viral plakları saymak. Yüzde (%) hesaplayın CVA16 enfeksiyon aşağıdaki gibidir: (ortalama # plak virüsü + ilaç /Mean # plak virüsü + DMSO kontrol) × 100%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
İlaçlar ve virüsün aynı anda eklenmesi etkisini değerlendirmek için (ortak ilavesi)
	<ol>
<li>2 x 105 hücreli/iyi bir tohumlama yoğunluğu 12-kuyu plakaları IÇINDE tohum RD hücreleri. Bir monolayer elde etmek için% 5 CO2 kuluçko içinde bir gecede 37 °c ' de inkübe.</li>
		<li>RD hücrelerini uygun konsantrasyonlarda test bileşikleri ile tedavi edin ve 50 PFU/Well CVA16 (inokulumunu son hacmi 300 μL 'dir) aynı anda 1 h. her 15 dakikada bir plaka kaya.</li>
		<li>1 mL PBS ile yıkayın ve sonra% 5 CO2 kuluçko Içinde 37 °c ' de daha fazla kuluçl için 0,8% metilselüloz içeren bazal medya 1-2 ml ile bindirme.</li>
		<li>72 h sonrası enfeksiyon sonra kristal menekşe ile leke viral plaklar ve yukarıda açıklandığı gibi% CVA16 enfeksiyon belirler.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Viral giriş sonrası ilaç tedavisi etkisini değerlendirmek için (enfeksiyon sonrası)
	<ol>
<li>2 x 105 hücreli/iyi bir tohumlama yoğunluğu 12-kuyu plakaları IÇINDE tohum RD hücreleri. Bir monolayer elde etmek için% 5 CO2 kuluçko içinde bir gecede 37 °c ' de inkübe.</li>
		<li>RD hücrelerini 50 PFU/Well CVA16 (inokulumunu son hacmi 300 μL) ile inoculate 1 h. her 15 dakikada bir plakayı kaya.</li>
		<li>1-2 mL PBS ile kuyuları yıkayın ve 0,8% metilselüloz ve test bileşiklerinin uygun konsantrasyonları içeren bazal medya ile hücreleri bindirme.</li>
		<li>Kristal menekşe ile leke viral plaklar ve 72 h sonrası enfeksiyon sonra saymak ve yukarıda açıklanan% CVA16 enfeksiyon inküsyon belirlemek. Not: Hücrelerin kaldırılması önlemek için yavaşça tüm PBS yıkanıyor gerçekleştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. akış sitometri bazlı bağlayıcı tahlil
<ol><li>2 x 105 hücreli/iyi bir tohumlama yoğunluğu 12-kuyu plakaları IÇINDE tohum RD hücreleri. Bir monolayer elde etmek için% 5 CO2 kuluçko içinde bir gecede 37 °c ' de inkübe edin.</li>
	<li>1 saat için 4 °c ' de hücre tek tabakalı ön Chill.</li>
	<li>4 °C ' de 3 h için test bileşiklerinin varlığı ve yokluğunda CVA16 (MOı = 100) ile RD hücrelerini bulaştırın. Not: 4 °c ' de sıcaklık korumak için 4 °c ' de buz üzerinde viral aşı ve ortaya çıkan inkübasyon gerçekleştirin, bu da viral bağlamaya izin verir, ancak giriş yapmaz.</li>
	<li>Virüs inokulumunu çıkarın ve 1-2 ml buz soğuk PBS ile bir kez yıkayın.</li>
	<li>Hücreleri toplamak ve buz-soğuk akış sitometri tampon (1x PBS artı 2% FBS) onları resuspending önce, 3 dakika buz kuyuları için buz-soğuk ayrışma tampon 1 ml ekleyerek hücreleri kaldırın.</li>
	<li>Buz-soğuk akış sitometri tamponunu kullanarak hücreleri iki kez yıkayın ve buz üzerinde 20 dakika boyunca 0,5 mL% 4 paraformaldehit ile hücreleri düzeltin.</li>
	<li>Herhangi bir ilişkisiz veya zayıf bağlı virüsleri kaldırmak için PBS kullanarak hücreleri yıkayın ve sonra hücreleri leke Anti-VP1 antikor 1 mL (1:2000;% 3 BSA içeren PBS seyreltilmiş) 1 h için buz üzerinde, ikinci bir Alexa 488-konjuza Anti-fare IgG (1:250 ile inkübasyon izledi; 1 h için buzda% 3 BSA içeren PBS 'de seyreltilir. her antikor tedavisinin ardından PBS yıkasları (3 kez) gerçekleştirin.</li>
	<li>0,5 mL 'Lik buz-soğuk akış sitometri tamponunun hücrelerini resuspend ve standart prosedürler kullanılarak bir akış sitometre üzerinde akış sitometri analizi gerçekleştirin. İlişkili Yazılım ve çubuk grafik gösterimi için quantitate kullanarak histogram verileri mevcut.</li>
</ol>4. viral Inaktivasyon assay
<ol><li>
Daha önce açıklanan12 aşağıdaki koşulları kullanarak viral inaktivasyon assay gerçekleştirin: -106 PFU/ml CVA16 bir başlangıç konsantrasyonu. -2 x 105 hücre/iyi bir tohumlama yoğunluğu 12-kuyu plakaları RD hücre monolayers. -50-50 PFU/Well son virüs konsantrasyonu sonuçlanan ilaç bileşikleri titreyme için Fold seyreltme. -1-2 mL PBS kullanarak yıkama adımları. -% 0,8 metilselüloz içeren kaplama ortamı.</li>
	<li>Yukarıda ayrıntılı olarak viral plaklar prosedürün kristal menekşe boyama kullanarak viral enfeksiyon son okuma gerçekleştirin.</li>
</ol>5. moleküler yerleştirme Analizi
<ol><li>PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) test bileşiklerinin 3D molekülleri indirin. Moleküllerin yüklenmiş bir 3B yapısı yoksa, 2B yapıları indirin veya gülme dize dizisini kullanın ve bir moleküler program (örneğin CORıNA) ile 3D moleküllere dönüştürün.</li>
	<li>RCSB protein veri bankasından viral biyolojik montaj birimini indirin (https://www.rcsb.org/) ve viral yapı modelini bir biyobilgisayar programı (örneğin, UCSF Chimera) kullanarak hazırlayın. Örneğin, CVA16 olgun virion kristal yapısı (PDB: 5C4W)3durumunda, pdb dosyasından çözücüleri silin, Dunbrach 2010 Rotamer Kütüphanesi 'nden veri kullanarak tamamlanmamış yan zincirleri değiştirin ve yapıya hidrojenler ve masraflar ekleyin daha önce13bildirdi. Yerleştirme hedefleri, biyolojik montaj bilgileri (protein veri Bankası) ile amaçlanan analiz için herhangi bir ilgili viral proteinler olabilir.</li>
	<li>
Örnek UCSF Chimera kullanarak hazırlanmış virüs ünitesi üzerine Dock test bileşikleri, ve bir görselleştirme yazılımı ile çıktı dosyaları analiz (örneğin, AutoDock Vina, PyMol):
	<ol>
<li>' Ligand ' olarak UCSF Chimera içine test bileşik dosyasını yükleyin ve ' reseptör ' olarak hazırlanmış tüm viral protein seçerek kör yerleştirme gerçekleştirin. Arama hacmini tüm ' reseptör ' ile yeniden boyutlandırmak için bilgisayar fareyi veya trackpad 'i kullanın. ' Gelişmiş Seçenekler ' içinde, bağlama modlarının sayısının maksimum olmasını sağlar. Yerleştirme çerçeveleri otomatik olarak en yüksek en düşük bağlayıcı enerji sıralanır.</li>
		<li>Isteğe bağlı Daha da kör yerleştirme, arama hacmini azaltmak için tekrar fare veya trackpad kullanarak kör yerleştirme sonuçlarından türetilen ilgi bölgelerindeki virüs proteini üzerine yerleştirme site Confine (örneğin, 100 Å x 100 Å x 100 Å). Bu adım, kör yerleştirme sonuçlarının onaylanması ve özgüllüğü artırır yardımcı olur.</li>
		<li>Yerleştirme dosyasını yükleyerek bağlayıcı modların konumlarını çözümlemek için bir moleküler grafik sistemi (örn. PyMol) kullanın. ' Ligand ' seçerek ve ' herhangi bir atom ' seçeneği ile kutup kişileri tanımlayarak viral protein bileşik kutup kişileri bulun; sonuçları inceleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Legay, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatal+coxsackievirus+A-16+pneumonitis+in+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Fatal coxsackievirus A-16 pneumonitis in adult.</a> Emerging Infectious Diseases. 13, 1084-1086 (2007).</li>
<li>Wang, C. Y., Li Lu,, Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatal+coxsackievirus+A16+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Infectious+Disease+Journal%22%5BJournal%5D)">Fatal coxsackievirus A16 infection.</a> Pediatric Infectious Disease Journal. 23, 275-276 (2004).</li>
<li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+coxsackievirus+A16+capsids+with+native+antigenicity%3A+implications+for+particle+expansion%2C+receptor+binding%2C+and+immunogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Structures of coxsackievirus A16 capsids with native antigenicity: implications for particle expansion, receptor binding, and immunogenicity.</a> Journal of Virology. 89, 10500-10511 (2015).</li>
<li>Nishimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+is+a+functional+receptor+for+enterovirus+71%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71.</a> Nature Medicine. 15, 794-797 (2009).</li>
<li>Yamayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scavenger+receptor+B2+is+a+cellular+receptor+for+enterovirus+71%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71.</a> Nature Medicine. 15, 798-801 (2009).</li>
<li>Yamayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+SCARB2-dependent+infection+by+coxsackievirus+A7%2C+A14%2C+and+A16+and+enterovirus+71%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7, A14, and A16 and enterovirus 71.</a> Journal of Virology. 86, 5686-5696 (2012).</li>
<li>Lin, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrolyzable+tannins+%28chebulagic+acid+and+punicalagin%29+target+viral+glycoprotein-glycosaminoglycan+interactions+to+inhibit+herpes+simplex+virus+1+entry+and+cell-to-cell+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread.</a> Journal of Virology. 85, 4386-4398 (2011).</li>
<li>Lin, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad-spectrum+antiviral+activity+of+chebulagic+acid+and+punicalagin+against+viruses+that+use+glycosaminoglycans+for+entry%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry.</a> BMC Microbiology. 13, 187(2013).</li>
<li>Lin, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+targeting+coxsackievirus+A16+capsid+inactivate+viral+particles+and+prevent+viral+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+%26+Infections%22%5BJournal%5D)">Small molecules targeting coxsackievirus A16 capsid inactivate viral particles and prevent viral binding.</a> Emerging Microbes & Infections. 7, 162(2018).</li>
<li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlint%2C+SJ+%22Principles+of+Virology%22">Principles of Virology</a>. , 3rd edn, ASM Press. (2008).</li>
<li>Velu, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BPR-3P0128+inhibits+RNA-dependent+RNA+polymerase+elongation+and+VPg+uridylylation+activities+of+Enterovirus+71%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">BPR-3P0128 inhibits RNA-dependent RNA polymerase elongation and VPg uridylylation activities of Enterovirus 71.</a> Antiviral Research. 112, 18-25 (2014).</li>
<li>Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Viral+Entry+Assays+for+the+Identification+and+Evaluation+of+Antiviral+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds.</a> Journal of Visualized Experiments. , e53124(2015).</li>
<li>Lang, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DOCK+6%3A+combining+techniques+to+model+RNA-small+molecule+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">DOCK 6: combining techniques to model RNA-small molecule complexes.</a> RNA. 15, 1219-1230 (2009).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coxsackievirus+A16+utilizes+cell+surface+heparan+sulfate+glycosaminoglycans+as+its+attachment+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+%26+Infections%22%5BJournal%5D)">Coxsackievirus A16 utilizes cell surface heparan sulfate glycosaminoglycans as its attachment receptor.</a> Emerging Microbes & Infections. 6, 65(2017).</li>
<li>Waterhouse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWISS-MODEL%3A+homology+modelling+of+protein+structures+and+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes.</a> Nucleic Acids Research. 46, W296-W303 (2018).</li>
</ol>

Yazarlar, hiç bir ilgi çatışması olmadığını beyan ederler.

Bu raporda, viral giriş hedefleyen antiviral adayların tanımlanması için yararlı olan protokolleri tarif, özellikle olmayan zarflı CVA16 karşı. Deneyleri viral giriş sırasında erken olayları incelemek için şekillerde tasarlanmıştır, hangi eylem mekanizması (ler) açıklığa kavuşturmak için yararlıdır ve potansiyel hedef (ler) test ajanları ' antiviral aktivite. ' Zaman-of-ilaç-ek tahlil ' büyük ölçüde test bileşiklerinin potansiyel hedefini belirlemek için izin verir, örneğin enfekte olmayan konak hücreleri (ön tedavi Anal...

El, ayak ve ağız hastalığı (HFMD), küçük çocuklarda coxsackievirus A16 (CVA16) ve enterovirüs 71 (EV71) tarafından en sık neden olan bir hastalıktır. Son zamanlarda Asya-Pasifik Bölgesi genelinde, CVA16 kaynaklı HFMD 'de önemli bir Uptick olmuştur. Belirtiler hafif olabilir iken, şiddetli komplikasyonlar beyin ve kalp etkileyen oluşabilir, potansiyel Fatality ile1,2. Şu anda, hiçbir lisanslı antiviral tedaviler veya aşılar CVA16 için mevcut, ve bu nedenle bir baskı ihtiyacı gelecek salgınlar ve ilişkili komplikasyonlar frenlemek için antiviral stratejiler geliştirmek için vardır.
CVA16 bir icosahedral kapsid her biri 4 yapısal proteinleri yani VP1, VP2, VP3 ve VP4 içeren pentam montajlı bir olmayan zarflı virüs. Pentamer her beş kat ekseni çevreleyen bir ' Kanyon ' bölge bir depresyon olarak gösterir ve reseptör bağlayıcı rolü için belirtilmiştir3. Bu kanyon altında bir hidrofobik cep yatıyor VP1 bölgede doğal bir yağ ligand adlı sphingosine (SPH) içerir. Cellular reseptörleri, insan P selektin glikoprotein ligand 1 (psgl-1) ve çöpçü reseptör sınıf B üyesi 2 (SCARB2) gibi, bu ligand yerinden tarafından viral bağlayıcı bir rol oynamak için önerilmiştir hangi kapsid ve Konformasyonel değişiklikler sonuçlanır viral genomu daha sonra ev sahibi hücreye4,5,6. Viral giriş sürecinde ardışık olayları engelleyen olası inhibitörleri tanımlamak CVA16 enfeksiyonuna karşı potansiyel terapötik stratejiler sağlayabilir.
Virüs yaşam döngüsünde adımlar, mod özgü antiviral ajanlar tanımlamanıza yardımcı olmak için hedefler olarak deneysel yaklaşımlar üzerinden disseke olabilir. Bir zaman-of-ilaç-ek analiz viral enfeksiyon sırasında farklı zamanlarda ilaç tedavi etkisini inceler, ön giriş de dahil olmak üzere (virüs enfeksiyonu önce eklendi), giriş (virüs enfeksiyonu eşzamanlı eklendi), ve sonrası giriş (aşağıdaki eklendi virüs enfeksiyonu)7. Etkisi her tedavi koşullarında oluşan viral plaklar sayısını quantitating standart bir plak tahlil kullanılarak değerlendirilebilir. Akış cytometry tabanlı viral bağlayıcı tahlil ilaç ev sahibi hücrelere viral eki önler Eğer belirler. Bu, insan virüsü enfeksiyonlarının çoğunun oluştuğu 37 °C ' den gelen sıcaklığı, viriyonların ana hücre yüzeyine bağlanabildiği ancak hücreleri7' ye giremeyeceği 4 °c ' ye kadar kaydırarak elde edilir. Hücre membranı bağlı virüs parçacıkları daha sonra viral antijenlere karşı immünostatif ile ölçülmüş ve akış sitometri tarafından değerlendirilir. Diğer taraftan viral inaktivasyon assay ücretsiz virüs parçacıkları ile ilacın potansiyel fiziksel etkileşimlerini değerlendirmek için yardımcı olur, ya kalkanlama ya da virions nötralize, ya da neden toplamalardan ya da onları etkin hale getirmek Konformasyonel değişiklikleri enfeksiyon sırasında ana hücre yüzeyi ile sonraki etkileşimleri8,9. Bu deneyde, viral inokulumunu ilk ilaç ile ana hücre tek tabakalı enfekte ve standart bir plak tahlil8gerçekleştirmeden önce ilaç dışarı titrat için seyreltilmiş olmak için izin verilir. Son olarak, moleküler yerleştirme virion yüzeyinde potansiyel uyuşturucu etkileşimi sitelerini tahmin etmek için güçlü bir araçtır, zarflı virüslerden viral glikoproteinler ve non-zarf virüslerden viral kapsid proteinleri dahil, Hesaplamalı kullanarak Algoritma. Bu mekanik ilaç eylem modu hedeflerini belirlemek için yardımcı olur ve daha fazla aşağı akım assays tarafından doğrulanabilir yararlı bilgiler sağlar.
Son zamanlarda etkili olmayan zarflı CVA169tarafından enfeksiyon bloke antiviral bileşikler tanımlamak için yukarıda açıklanan yöntemleri istihdam. Burada, kullanılan ayrıntılı protokoller açıklanmıştır ve tartışılmaktadır.

<table><tbody><tr><td>% 4 Paraformaldehit</td><td>Sigma</td><td>AL-158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488-konjuge anti-fare IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterisin B</td><td>GIBCO</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>Anti-VP1 antikoru</td><td>Merck-Millipore</td><td>MAB979</td><td>Anti-Enterovirüs 71 Antikor, Coxsackie A16 ile çapraz reaksiyona girer, klon 422-8D-4C-4D</td></tr><tr><td>Beckman Coulter Sitometre</td><td>Beckman Coulter</td><td>FC500</td><td></td></tr><tr><td>Corina</td><td>Moleküler Ağlar GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kristal menekşe</td><td>Sigma</td><td>C3886-100G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prizma</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodyum tuzu</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>İn vitro toksikoloji test kiti, XTT bazlı</td><td>Sigma</td><td>TOX2</td><td></td></tr><tr><td>Metilselüloz</td><td>Sigma</td><td>M0512-100G</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>GIBCO</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>GIBCO</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>PyMol</td><td>Schr&ouml; dinger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UCSF Chimera</td><td>Kaliforniya Üniversitesi, San Francisco</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

coxsackievirus 'a karşı antiviral adayların tanımlanması için viral giriş analizinin kullanımı ve moleküler yerleştirme analizi a16

Use of Viral Entry Assays and Molecular Docking Analysis for the Identification of Antiviral Candidates against Coxsackievirus A16

Antiviral bir mekanik viral giriş incelemek için hangi adım değerlendirilen ajanlar en etkili olduğunu ayırt etmek için uygun olduğunu, ve aday viral giriş inhibitörleri tanımlanması için izin asdiyor. Burada, virüs parçacıklarını veya erken viral girişteki belirli adımları hedefleyerek, zarfsız coxsackievirus A16 (CVA16) tarafından enfeksiyonun engellenebilen küçük moleküllerin tanımlanması için deneysel yaklaşımlar sunuyoruz. Assays zaman-of-ilaç-ilavesi analizi, akış sitometri tabanlı viral bağlayıcı tahlil ve viral inaktivasyon assay içerir. Ayrıca, antiviral bileşiklerin hedeflediği potansiyel kalıntıları tahmin etmek için virüs kapsid proteinlerini kullanan bir moleküler yerleştirme Protokolü sunuyoruz. Bu tanıtım viral giriş üzerinde hareket aday antiviral ajanlar tanımlanmasını yardımcı olmalıdır. Gelecek yönleri daha fazla ilaç gelişimi için bu olası inhibitörleri keşfedebilirsiniz.

Zaman-of-ilaç-ek tahlil Şekil 1 ' de belirtilir ve küçük moleküller CHLA ve pug CVA16 enfeksiyon ya pre-viral giriş (pretreatment), viral giriş sırasında (Co-ilavesi), veya post-viral giriş kullanarak tedavinin etkisini gösterir ( enfeksiyon sonrası). Hem küçük moleküller sadece CVA16 infeksiyonuna karşı marjinal bir etki yaratıp viral enfeksiyondan önce ev sahibi hücrelerin ön tedavisinde (Şekil 1a) veya enfeksiyon sonrası tedav...

Protokol amacı, aday viral giriş inhibitörleri tanımlamak için kullanılabilecek viral giriş ile ilgili farklı deneyleri göstermek için.

Coxsackievirus 'a karşı antiviral adayların tanımlanması için viral giriş analizinin kullanımı ve moleküler yerleştirme Analizi A16

Antiviral assays that mechanistically examine viral entry are pertinent to discern at which step the evaluated agents are most effective, and allow for ...

Bu protokol, mekanizma odaklı bir yaklaşımla potansiyel antiviral küçük moleküllerin keşfine yardımcı olabilir. Ek çalışma süresi, enfeksiyonun hangi adımında küçük molekülün antiviral aktivitesini sergilediğini belirler. Moleküler yerleştirme küçük molekül ve viral proteinler arasındaki etkileşimi tahmin eder.Viral enfeksiyon öncesinde ev sahibi hücreler üzerinde ilaçların etkisini değerlendirmek için, iyi kaplama yoğunluğu başına beş kez 10 iki kez 10 tohum RD hücreleri. Hücreleri bir gecede %5 karbondioksit kuvözde 37 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi sabah, rd monolayer her iyi ilgi bir test bileşik ile tedavi, triplicate, bazal orta bir mililitre toksik olmayan konsantrasyonlarda bir veya dört saat.Tedavi kuluçka sonunda, bir saat boyunca iyi bazal orta 300 mikrolitre 50 plak oluşturan birim virüs eklemeden önce PBS bir mililitre ile hücreleri yıkayın, her 15 dakikada sallanan. Enfeksiyon kuluçka sonunda, PBS ile hücreleri yıkayın ve taze bazal orta bir mililitre ile hücreleri bindirme 0.8% metilselüloz içeren. Hücre kültürü kuluçka 72 saat sonra, PBS iki mililitre ile her iyi yıkayın ve 15 dakika boyunca iyi başına% 37 formaldehit 0.5 mililitre ile hücreleri düzeltmek.Fiksasyon sonunda, pbs ile kuyuyıkama ve iyi başına% 0,5 kristal mor çözelti0.5 mililitre ile hücreleri leke. İki dakika sonra, kuyuları hafif bir su akışıyla yıkayın ve plakanın kurumasını bekleyin. Sonra sayma için beyaz bir ışık kutusu üzerine plaka yerleştirin ve formüle göre coxsackievirus enfekte hücrelerin yüzdesini hesaplamak.Moleküler yerleştirme analizi için, PubChem'den test bileşiklerinin 3Boyutlu moleküllerini indirin. Bir molekülün yüklenen bir 3B yapısı yoksa, 2B yapısını indirin veya uygun bir moleküler program aracılığıyla yapıyı bir 3B moleküle dönüştürmek için SMILE dize dizisini kullanın. Sonra, RCSB Protein Veri Bankası'ndan viral biyolojik montaj ünitesi indirin.Uygun bir biyo-bilgi işlem programı kullanarak, Protein Veri Bankası dosyasından çözücüleri silin, Dunbrack 2010 rotamer kitaplığından alınan verileri kullanarak eksik yan zincirleri değiştirin ve daha önce bildirildiği gibi yapıya hidrojen ve patlayıcı ekleyin. Test bileşiklerini hazırlanan virüs ünitesine yerleştirmek için, test bileşik dosyasını Ligand olarak California Üniversitesi San Francisco Chimera'ya yükleyin ve kör yerleştirme yapmak için reseptör olarak hazırlanan viral proteinin tamamını seçin. Ek yerleştirme için, yerleştirme alanını, arama hacmini daha da azaltarak kör yerleştirme sonuçlarından elde edilen ilgi bölgelerine viral proteinle sınırlandırın.Ardından bağlama modu konumlarını analiz etmek için yerleştirme dosyasını uygun bir moleküler grafik sistemine yükleyin. Herhangi bir atom seçeneği ile polar temasları tanımlayan, viral protein bileşik polar temas bulmak için ligand seçin. Bu temsili deneyde test edilen küçük moleküllerin her ikisi de, viral enfeksiyon dan önce konak hücrelerin ön tedavisinde veya enfeksiyon sonrası tedavide olsun, sadece coxsackievirus A16 enfektivitesine karşı marjinal bir etki yaratmaktadır.Buna karşılık, moleküller etkili bir co-ek tedavi de% 80'den fazla enfeksiyon ortadan, iki bileşikler infeksiyon sırasında konak hücre yüzeyinde virüs parçacıkları ile aynı anda mevcut olduğunda en etkili olduğunu düşündürmektedir. Akış sitometri sitometri sitometrisi bazlı bağlama analizi, iki tanenin konak hücrelere viral parçacık bağlanmasını engelleyerek coxsackievirus A16 enfekte girişini engellediğini doğrulamaktadır. Tanenlerin moleküler kenetlenme her ikisi de coxsackievirus pentamer kanyon bölgesinde bağlamak için tahmin olduğunu gösterir, cep faktörü tutan cep girişinin hemen üzerinde ve coxsackievirus bağlama ve konak hücreye giriş aracılık için önemli bir rol oynar.Bu yüzey projeksiyonlarında, cep girişinin etrafındaki küçük moleküllerin kutupsal temaslarından öngörülen benzersiz kalıntılar asparagin-85, lizin-257 ve asparagin-417 ile iki tanen arasında ortak olarak görülebilir. Moleküler yerleştirme için, bağlayıcı kareler sıralamasında viral proteinin topolojisinin dikkate alınması gerekir. Ek deneyler rekombinant virüsler üzerinde bileşiğin antiviral aktivitesitest içerebilir, amino asitler üzerindeki mutasyonlar ilacın etkinliği için önemini doğrulamak için keşfedilen.

use-viral-entry-assays-molecular-docking-analysis-for-identification

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, antiviral ajanların viral partiküller üzerindeki etkisinin değerlendirilmesini gösteren viral inaktivasyon testini göstermektedir.

Bir Viral İnaktivasyon Testi ile Bir Antiviral Test Bileşiğinin Etkinliğinin Değerlendirilmesi

Bu video, antiviral bileşiklerin taranması için bir viral bağlanma testini göstermektedir. Genetiği değiştirilmiş hepatit C virüsü ve lusiferaz kullanarak, tek başına virüsle tedavi edilen kuyucuklara kıyasla birlikte tedavi edilen kuyucuklarda daha düşük ışık yoğunluğu ile belirtildiği gibi, viral bağlanma üzerindeki inhibitör etkileri değerlendirir.

Antiviral Bileşiklerin Taranması için Bir Viral Bağlanma Testi

Bu video, konakçı hücrelere viral girişin belirli adımlarını ve endozomla füzyonu hedefleyen antiviral ajanları değerlendirmek için bir testi göstermektedir. Hücreler düşük bir sıcaklıkta inkübe edilir ve daha sonra HCV ile enfekte edilir. Düşük sıcaklık, konakçı hücrelere viral bağlanmaya izin verir, ancak endositoz yoluyla içselleştirmeyi engeller. Test antiviral bileşiği eklenir ve hücreler fizyolojik sıcaklıkta inkübe edilir. Daha yüksek bir sıcaklığa bu geçiş, viral girişi kolaylaştırır ve...

Test Bileşiklerinin Konakçı Hücrelerde Viral Giriş ve Füzyon Üzerindeki Etkisini Değerlendirmek İçin Bir Test

Sitopatik etki (CPE)-bazlı analiz, doz-yanıt tahlil ve Time-of-adisyonu (TOA) deneyi de dahil olmak üzere üç deneyleri yanı sıra, gelişmiş optimize edilmiş, doğrulanmış ve Bluetongue virüsüne karşı yeni antiviraller (BTV) tanımlamak için kullanılmıştır yeni tespit antiviraller için olası Mekanizması-of-Eylem (MoA) belirlemek gibi.

Bluetongue Virüs karşı Roman Antiviraller belirlenmesi için Tahliller

Virüs çoğaltma ölçmek için in vitro deneylerinde önemli ölçüde lusiferaz veya biyolüminesans edebilen diğer enzimleri ifade eden rekombinant RNA virüslerinin geliştirilmesi yolu ile iyileştirilmiştir. Burada ayrıntılı kızamık ve kimyasal kütüphanelerden geniş spektrumlu antiviral izole etmek Chikungunya virüsler, rekombinant suşlar birleştiren bir yüksek verimli tarama hattını.

RNA Virüslerinin geniş spektrumlu Kimyasal Önleyicileri için yüksek verimli tarama

Burada, yeni antiviral ajanları tanımlamak ve değerlendirmek için viral girişin belirli adımlarını inceleyen bir protokol sunuyoruz.

Erken Viral Giriş Tespiti için Tahliller ve Antiviral Bileşiklerin Değerlendirilmesi

Arenavirüs yaşam döngüsünün ilk adımı, viral partiküllerin konak hücrelere bağlanmasıdır. Arenavirüs bağlanma olaylarının ultra hassas tespiti ve kantitasyonu için kantitatif (q) RT-PCR tabanlı bir test sunuyoruz.

Arenavirüs hücre Ek Ölçümü için son derece hassas Deneyi

Burada, Abdovirüs çoğaltma ve Abdovirüs çoğaltma kısıtlamak 2) ökaryotik ana faktörler teşvik 1) virüs kodlanmış immunomodulators tanımlamak için protokolleri mevcut. Floresan ve ışıldama dayalı yöntemlerin araştırmacılar hızla düşük sinyal noise oranları ile basit deneyleri Abdovirüs çoğaltma nicel veriler elde etmek için izin verir.

Araçlar Viral Immunomodulators ve ana bilgisayar Antiviral faktörler tanımlanması için eleme olarak Abdovirüs enfeksiyonlar

Viral poliproteine gömülü homolog konak-patojen protein dizilerinin (SSHHPS) kısa uzantılarını belirlemek için genel bir protokol sayılmiyoruz. SSHHPS viral proteazlar tarafından tanınan ve çeşitli Grup IV virüsler tarafından belirli konak proteinlerin hedefli imha doğrudan.

Grup IV Viral SSHHPS In Vitro ve In Silico Yöntemleri Kullanılarak Analizi

Mevcut protokol, HA, S glikoproteini, ilgili hibrid tip glikanlar ve yüksek mannoz oligosakkaritlerine CV-N bağlanmasını incelemek için SPR bağlanma testleri için yeni araçları açıklamaktadır. SPR, bu glikanlara dimerik veya monomerik CV-N'yi bağlamak için KD'yi belirlemek için kullanılır.

Yüzey Plazmon Rezonansı ile Antiviral Ajanların Mühendisliği

Bu makale, luciferaz raporlayıcı sistemi kullanarak SARS-CoV-2 sahtetipli parçacıkların üretilmesi metodolojisini ve giriş inhibitörlerini tanımlamada kullanımını açıklamaktadır. Bu protokoller, rekombinant insan ACE2-Fc füzyon proteini ve küçük moleküllü bileşik arbidol olmak üzere iki farklı giriş inhibitörü kullanılarak gösterilmiştir.

MLV tabanlı psödovirüsler kullanılarak SARS-CoV-2 giriş inhibitörlerinin potansiyel antiviral olarak tanımlanması için prosedürler

Keşfedin, viral giriş analizi ve moleküler yerleştirme kullanarak Coxsackievirus A16'ya karşı antiviral adayları nasıl tanımlayacağınızı. Bu yöntem, küçük moleküllerin antiviral aktivitesini değerlendirmeye yardımcı olur.

Coxsackievirus a karşı antiviral adayların tanımlanması için viral giriş analizinin kullanımı ve moleküler yerleştirme Analizi A16 (Video) | JoVE Journal

Coxsackievirus 'a karşı antiviral adayların tanımlanması için viral giriş analizinin kullanımı ve moleküler yerleştirme Analizi A16

Daha fazla video keşfet