Name: Bir Co-salgılanmış luciferase Surrogate kullanarak bağıl Insülin salgılanmasını ölçme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Öğrenin, Gaussia luciferase kullanarak MIN6 beta hücrelerinde insülin salgılanmasını hızlı ve düşük maliyetli ölçme yöntemini. Bu yöntem, diyabet ilaç keşfi için orta verimli tarama sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar değerli iş ve tartışmalar için Cobb laboratuvarının tüm mevcut ve eski üyelerine teşekkür ve idari yardım için Dionne Ware. Michael Kalwat bir juvenil diyabet araştırma Vakfı SRA-2019-702-Q-R tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma, NıH R37 DK34128 ve Welch Foundation Grant I1243 aracılığıyla Melanie Cobb 'a mümkün hale gelmiştir. Bu çalışmanın erken parçaları da Michael Kalwat için bir NıH F32 DK100113 tarafından destekleniyor.

1. reaktiflerin, medyanın ve tamponların hazırlanması (Tablo 1)
<ol><li>500 mL yüksek glikoz (4,5 g/L) Dulbecco modifiye kartal Orta (DMEM) aşağıdaki katkı maddeleri ile MIN6 komple medya hazırlayın: 15% fetal Sığır serum (FBS), 100 birimleri/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin, 292 μg/mL L-glutamin, ve 50 μM β-mercaptoetanol. Not: Bu durumda istikrarlı hücre hattı 250 μg/mL G418 antibiyotik korunur.</li>
	<li>5 mm KCL, 120 mm NaCl, 15 mm HEPES (pH 7,4), 24 mm NaHCO3, 1 mm MgCl2, 2 mm CAcl2ve 1 mg/ml radioimmunassay sınıfı Sığır serum albümin (BSA) içeren bir çözelti yaparak Krebs-Ringer bikarbonat tampon (krbh) hazırlayın. Glikoz 2 M stokta belirtilen yere eklenecektir. Not: krbh, insülin ve/veya gaussia Lusiferaz salgılanmasını değerlendirmek için stimülasyon olmadan ve uyarılmadan hücreleri kulgermak için kullanılır.</li>
	<li>Coelenterazine (CTZ) stok çözümünü aşağıdaki gibi hazırlayın. 10 ml metanol için 106 μL konsantre HCL ekleyerek asitlendirilmiş metanol hazırlayın. Daha sonra, 1 mg/ml 'de asitlenmiş metanol içinde liyofilize CTZ çözülür ve vida kapaklı tüplerde-80 °c ' de depolar. Not: Bu Stoklar, uygun depolama 1 yıl sonra bile rutin Lusiferaz konusunda yeterli aktivite korur.</li>
	<li>Hazırlamak gaussia Lusiferaz (gluc) tahlil tampon literatür üzerine dayalı9 yanı sıra patent bilgileri10 96 iyi plaka formatında gaussia Lusiferaz tahlil yarı ömrü yardım için. Formülü kullanın: 25 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA, 5% gliserol, 1 mg/mL na2Po4, 300 mm sodyum askorbat, 200 mm na2su yani3 . -20 °C ' de stokları dondurur. Çözünme işleminden sonra tamponu 4 °C ' de saklayın.</li>
	<li>Gaussia Lusiferaz çalışma çözümünü hazırlamak için, gluc assay tampona 1 mg/ml (2,36 mm) CTZ stok çözeltisi 4,2 μL/ml ekleyin. Bu, 10 μM CTZ 'lik 2x çalışma çözümüyle sonuçlanır ve bu tahlil sırasında 5 μM final konsantrasyonuna sahip olacaktır.</li>
</ol>2. InsGLuc MIN6 hücrelerinin kültürü ve salgılanması için tohumlama
<ol><li>Kültür MIN6 hücreleri, tripsinize ve çekirdek hücreleri haftada bir kez standart hücre kültürü teknikleri kullanarak. Hücrelerdeki her 2-3 günde bir ortam değiştirin. Medyaya 250 μg/mL G418 gibi uygun seçim antibiyotiği ekleyin.<ol>
<li>Deneyler için haftalık hücre yeterli sayıda sağlamak için T75 flasks hücreleri koruyun. 10 mL medyaya T75 başına 6 x 106 hücre Seeding genellikle 30 x 10 6 için 40 x 106 hücre kültür 7 gün sonra T75 başına toplam verim olacaktır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>96-Well plakaları içine kaplama için hücreler hazırlamak için, PBS ile iki kez InsGLuc MIN6 hücrelerin bir confluent T75 yıkayın ve tripsin 2 mL ekleyin. 37 °C ' de ~ 5 dakika veya hücreler Flask 'dan dağılıncaya kadar kuluçat. Mililitre başına hücre konsantrasyonunu belirleyin.<ol>
<li>Tam medyadaki hücreleri 1 x 106 hücreye/ml 'ye 1 x 105 hücreye 100 μl 'lik bir 96-kuyu plakasına göre seyreltin. Hücreleri 3 – 4 gün sonra tahlil için yeterince konfluent olmalıdır. Not: kültür süresini uzatmak Için hücre konsantrasyonunun yarısı kaplama yapılabilir. Hücreler deneysel tedavilere maruz kalmadıkça, test gününden önce medya değişiklikleri gerekli değildir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. glikoz stimüle gaussia Lusiferaz salgılanması tahlil
<ol><li>Tahlil gününde deneme için yeterli KRBH hazırlamak (adım 1,2). 96-Well plaka başına 50 mL KRBH en az gereklidir, bu nedenle deneme için yeterli tampon sağlamak için en az 75 mL hazırlayın. İlaç tedavi koşulları farklı kombinasyonları seyreltme için KRBH gerektirecektir Eğer ekstra tampon hazırlayın.</li>
	<li>Glikoz içermeyen KRBH ile bir rezervuar hazırlayın. 96-Well plaka (ler) hızlı bir laboratuvar lavabo üzerinde plaka tersine çevirme ve daha sonra sıkıca kağıt havlu yığını üzerinde aşırı orta kaldırmak için leke tarafından orta decant.</li>
	<li>Elektronik veya manuel 8 kanallı pipet kullanarak, 96-Well plaka (lar) üzerinden rezervuar gelen μL/Well KRBH pipet 100. Toplam iki yıkanıyor için tekrarlayın.</li>
	<li>(İsteğe bağlı akut bileşik tedaviler adım) İlaç tedavileri yapılırsa, 3,5 ve 3,6 modifikasyonsuz adımlarla devam edin. Küçük moleküllerin insülin salgılanması üzerindeki etkilerini test etmek için, ön kuluçte süresi, stimülasyon süresi veya her ikisi de hücrelere bileşikler eklenebilir.<ol>
<li>Bir teknik 1,5 mL tüpler KRBH toplu bileşikler eklemek ve 96-Well plakaları hücrelerine tüpler ilaç KRBH aktarmak için ayarlanabilir bir 8 kanallı dijital pipet kullanın etmektir. Not: ayarlanabilir bir pipet mevcut değilse, bir yineleme 96-iyi plaka ilaç-KRBH yapılabilir ve standart 8 kanallı pipet tampon aktarmak için kullanılabilir. Tedavi paradigması için daha fazla değişiklik, daha önce1,8açıklandığı gibi, tahlil öncesinde medyada 24 h için hücreleri tedavi etmek için yapılabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İstenen glikoz veya bileşikler konsantrasyonu içeren KRBH 100 μL ekleyin ve 1 saat için 37 °C küvatör içinde çanak yerleştirin. Not: deneysel düzene bağlı olarak, sekiz 1,5 mL 'Lik tüplerin bir sütunundan kanal mesafelerini 96-kuyu plakasının 8 satırına aktarmasına olanak veren elektronik çok kanallı bir pipet olması son derece yararlıdır.</li>
	<li>Sonra 1 ön kuluçk, tampon lavabo ve kağıt havlu sıkıca leke içine tamponu. Eklemek 100 μL glikoz ücretsiz KRBH başına iyi Gaussia luciferase birikmiş arka plan yıkamak için. Plakayı tekrar kaplama ve 100 μL 'de de plakaya kontrol ve stimülasyon koşulları ekleyin. Tabağı 37 °C ' lik kuluçte 1 saat için yerleştirin.</li>
	<li>Dikkatle 50 μL çok kanallı pipet kullanarak süpernatant toplamak, gerekli tedavi koşulları arasındaki ipuçlarını değiştirerek, ve temiz bir opak beyaz 96-iyi assay plaka süpernatant aktarmak. Not: önemli miktarda Lusiferaz sinyali kaybolacak olsa da, gerektiğinde beyaz duvarlı açık-alt plakalar kullanılabilir.</li>
	<li>Krbh supernatant 50 μL toplama sonra, örnek hemen farklı teknik kullanılarak olabilir. Gerekirse, bir kaç gün için 4 °c ' de (gluc aktivite Half-Life ~ 6 gün) veya-20 °c ' ye kadar bir ay11,12' ye kadar mühürleyin ve saklayın.</li>
</ol>4. salgılanan gaussia Lusiferaz tahlil
<ol><li>GLuc assay çalışma çözümünü hazırlamak için, gerekli miktarda CTZ stok çözeltisi (4,2 μL/mL) GLuc assay tampon içine pipet. CTZ ısınma önlemek için, hızlı bir şekilde CTZ pipet-80 °C dondurucu veya kuru buz üzerinde tüp tutmak.</li>
	<li>Bir elektronik çok kanallı pipet kullanarak, hızlı bir şekilde 96-iyi çanak toplanan KRBH süpernatants içeren başına GLuc assay çalışma çözeltisi 50 μL ekleyin. Herhangi bir kuyuların tarafında herhangi bir damlacıkları varsa, kısaca bir masa üstü salıncak-kova santrifüjte plaka spin.</li>
	<li>Birkaç dakika içinde uygun bir plaka okuyucuda lüminesans okuyun ve bir 0,1 s entegrasyon süresi ile her iyi okuyun.</li>
</ol>

<ol><li>Kalwat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+promoter-driven+Gaussia+luciferase-based+insulin+secretion+biosensor+assay+for+discovery+of+beta-cell+glucose-sensing+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sensors%22%5BJournal%5D)">Insulin promoter-driven Gaussia luciferase-based insulin secretion biosensor assay for discovery of beta-cell glucose-sensing pathways.</a> ACS Sensors. 1 (10), 1208-1212 (2016).</li>
<li>Burns, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+luminescent+reporter+of+insulin+secretion+for+discovering+regulators+of+pancreatic+Beta-cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">High-throughput luminescent reporter of insulin secretion for discovering regulators of pancreatic Beta-cell function.</a> Cell Metabolism. 21 (1), 126-137 (2015).</li>
<li>Rajan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+processing+and+secretion+of+mutant+insulin+proteins+that+cause+permanent+neonatal+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vitro processing and secretion of mutant insulin proteins that cause permanent neonatal diabetes.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (3), E403-E410 (2010).</li>
<li>Watkins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Secretory+Vesicles+by+Fluorescent+Protein+Insertion+in+Propeptide+Rather+Than+Mature+Secreted+Peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Imaging Secretory Vesicles by Fluorescent Protein Insertion in Propeptide Rather Than Mature Secreted Peptide.</a> Traffic. 3 (7), 461-471 (2002).</li>
<li>Welsh, J. P., Patel, K. G., Manthiram, K., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiply+mutated+Gaussia+luciferases+provide+prolonged+and+intense+bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Multiply mutated Gaussia luciferases provide prolonged and intense bioluminescence.</a> Biochemical Biophysical Research Communications. 389 (4), 563-568 (2009).</li>
<li>Tannous, B. A., Kim, D. E., Fernandez, J. L., Weissleder, R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Codon-optimized+Gaussia+luciferase+cDNA+for+mammalian+gene+expression+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therarpy%22%5BJournal%5D)">Codon-optimized Gaussia luciferase cDNA for mammalian gene expression in culture and in vivo.</a> Molecular Therarpy. 11 (3), 435-443 (2005).</li>
<li>Compounds and methods for regulating insulin secretion. World patent. , WO2018175324A1 (2018).</li>
<li>Kalwat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromomycin+A2+potently+inhibits+glucose-stimulated+insulin+secretion+from+pancreatic+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chromomycin A2 potently inhibits glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta cells.</a> Journal of General Physiology. , (2018).</li>
<li>Luft, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Gaussia+luciferase+in+bicistronic+and+non-conventional+secretion+reporter+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs.</a> BMC Biochemistry. 15 (1), 14(2014).</li>
<li>Ohmiya, Y., Wu, C. Stabilizing composition and stabilizing method of coelenterazine solution for high-throughput measurement of luciferase activity. U.S. Patent. , 7,718,389 B2 (2010).</li>
<li>Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+monitoring+biological+processes+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (4), 582-591 (2009).</li>
<li>Wurdinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+luciferase+for+ex+vivo+monitoring+of+in+vivo+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes.</a> Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).</li>
<li>Henquin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggering+and+amplifying+pathways+of+regulation+of+insulin+secretion+by+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Triggering and amplifying pathways of regulation of insulin secretion by glucose.</a> Diabetes. 49 (11), 1751-1760 (2000).</li>
<li>Mourad, N. I., Nenquin, M., Henquin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+insulin+secretion+by+acetylcholine+or+phorbol+ester+is+independent+of+beta-cell+microfilaments+and+distinct+from+metabolic+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Amplification of insulin secretion by acetylcholine or phorbol ester is independent of beta-cell microfilaments and distinct from metabolic amplification.</a> Molecular & Cellular Endocrinology. 367 (1-2), 11-20 (2013).</li>
<li>Straub, S. G., Sharp, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+insights+regarding+mechanisms+for+the+inhibition+of+insulin+release+by+norepinephrine+and+heterotrimeric+G+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evolving insights regarding mechanisms for the inhibition of insulin release by norepinephrine and heterotrimeric G proteins.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (12), C1687-C1698 (2012).</li>
<li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+passage+MIN6+cells+have+impaired+insulin+secretion+with+impaired+glucose+and+lipid+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High passage MIN6 cells have impaired insulin secretion with impaired glucose and lipid oxidation.</a> PLoS One. 7 (7), e40868(2012).</li>
<li>Head, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin-36+Gap+Junctions+Regulate+In+Vivo+First-+and+Second-Phase+Insulin+Secretion+Dynamics+and+Glucose+Tolerance+in+the+Conscious%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Connexin-36 Gap Junctions Regulate In Vivo First- and Second-Phase Insulin Secretion Dynamics and Glucose Tolerance in the Conscious.</a> Diabetes. 61 (7), 1700-1707 (2012).</li>
<li>Benninger, R. K. P., Head, W. S., Zhang, M., Satin, L. S., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+and+other+mechanisms+of+cell-cell+communication+regulate+basal+insulin+secretion+in+the+pancreatic+islet%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Gap junctions and other mechanisms of cell-cell communication regulate basal insulin secretion in the pancreatic islet.</a> The Journal of Physiology. 589 (22), 5453-5466 (2011).</li>
<li>Konstantinova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphA-Ephrin-A-mediated+beta+cell+communication+regulates+insulin+secretion+from+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets.</a> Cell. 129 (2), 359-370 (2007).</li>
<li>Jaques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+effect+of+cell-cell+contact+disruption+on+cytosolic+calcium+and+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Dual effect of cell-cell contact disruption on cytosolic calcium and insulin secretion.</a> Endocrinology. 149 (5), 2494-2505 (2008).</li>
<li>Calabrese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+36+Controls+Synchronization+of+Ca2%2B+Oscillations+and+Insulin+Secretion+in+MIN6+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Connexin 36 Controls Synchronization of Ca2+ Oscillations and Insulin Secretion in MIN6 Cells.</a> Diabetes. 52 (2), 417-424 (2003).</li>
<li>Bielefeld-Sevigny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AlphaLISA+immunoassay+platform-+the+%26%2334%3Bno-wash%26%2334%3B+high-throughput+alternative+to+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">AlphaLISA immunoassay platform- the &#34;no-wash&#34; high-throughput alternative to ELISA.</a> Assay and Drug Development Technologies. 7 (1), 90-92 (2009).</li>
<li>Aslanoglou, D., George, E. W., Freyberg, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+Time-resolved+Forster+Resonance+Energy+Transfer-based+Assay+for+Detection+of+Insulin+Secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Homogeneous Time-resolved Forster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).</li>
<li>Rafati, A., Zarrabi, A., Abediankenari, S., Aarabi, M., Gill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+colorimetric+assay+using+insulin+G-quadruplex+aptamer+arrays+on+DNA+nanotubes+coupled+with+magnetic+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Sociecy+Open+Science%22%5BJournal%5D)">Sensitive colorimetric assay using insulin G-quadruplex aptamer arrays on DNA nanotubes coupled with magnetic nanoparticles.</a> Royal Sociecy Open Science. 5 (3), 171835(2018).</li>
<li>Hulleman, J. D., Brown, S. J., Rosen, H., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+cell-based+Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+identifying+modulators+of+fibulin-3+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A high-throughput cell-based Gaussia luciferase reporter assay for identifying modulators of fibulin-3 secretion.</a> Journal of Biomolecular Screening. 18 (6), 647-658 (2013).</li>
<li>Frank, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tools+for+understanding+the+complexity+of+beta-cell+signalling+and+insulin+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Optical tools for understanding the complexity of beta-cell signalling and insulin release.</a> Nature Reviews Endocrinology. 14 (12), 721-737 (2018).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+C-Peptide+Storage+and+Secretion+in+Islet+beta-Cells+In+Vitro+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Monitoring C-Peptide Storage and Secretion in Islet beta-Cells In Vitro and In Vivo.</a> Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Burada, MIN6 β hücrelerinden glikoz stimüle edilen insülin salgılanması yanıtlarını hızla değerlendirmek için bir yöntem sunuyoruz. Tahlil en iyi tepkiler için uygun yoğunlukta MIN6 hücreleri tohum ve onları% 85-95 confluent haline izin önemlidir. Bu, hem primer adacıklar17, 18,19,20,21 yanı sıra oluşur Gelişmiş hücre hücre kişileri ve senkronizasyon nedeniyle...

Burada sunulan yöntem, genetik olarak değiştirilmiş bir beta hücre hattından insülin salgılanmasını, 96-Well-Plate formatında hızla ve uygun maliyetli bir şekilde tespit edilmesine olanak tanır. Bu protokol için anahtar doğal olarak salgılanan gaussia Lusiferaz (gluc, ~ 18 kDa) eklenmiş olan insülin değiştirilmiş bir sürümüdür (bkz. Şekil 1) C-peptid içine insülin-gaussia (insgluc)1,2oluşturmak için. GFP (~ 25 kDa) gibi diğer büyük proteinler, başarılı bir şekilde C-peptid insülin içine yerleştirilen ve proinsüline-Gfp gelen beklenen post-translational işleme insülin ve Gfp-C-peptid3,4sergilenmiştir. Bu protokolde tahlil için, gluc-memeliler ifade için optimize edilmiş ve iki mutasyonlar Glow benzeri kinetik5,6geliştirmek için tanıtıldı. Çoklu kombinasyonları ve tedavi koşullarının çoğaltır kolayca 96-Well-Plate formatında test edilebilir ve salgılanması sonuçları hemen deney sonrasında elde edilebilir.
Büyük bir avantaj, daha önce de belirtildiği gibi2, bu luciferase tabanlı salgılanması ölçümü düşük maliyetidir (< $0.01/Well) nispeten daha yüksek maliyetler ve enzim bağlı İmmünosorbent teknik yönlerini ayırt (Elisas) ( > $2/Well) ve homojen zaman çözülmemiş Floresan (HTRF) veya diğer Förster rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı antikor (> $1/Well) sağlar. Bu antikor tabanlı testlere kıyasla, hangi standart bir eğri başvuran tarafından insülin konsantrasyonu ölçmek, InsGLuc tahlil plaka üzerinde kontrol kuyuları göreli bir karşılaştırma olarak salgılayan aktivite ölçer. Bu nedenle, her deney uygun kontroller eklenmesi gerekir. Bu ayrım hızlı ve ucuz ölçümlere izin vermek için bir ticaret-off olduğunu. Bununla birlikte, insgluc salgısı, ELISA1,2ile ölçülen insülin salgılanması ile son derece ilişkilidir. Bu teknoloji yüksek verimlilik taraması için ölçeklendirilmiştir1,2,7 ve bir voltaj-Gated Potasyum kanal inhibitörü dahil olmak üzere insülin salgılanması yeni modülatörlerin tanımlanması için yol açmıştır7 β hücreli fonksiyonun doğal ürün inhibitörü yanı sıra, chromomicin a28. InsGLuc kullanımı, sürekli olarak insülin salgılanması üzerindeki etkileri için birçok farklı tedavi koşullarını test etmeyi planlayan araştırmacılar için uygundur. Takip deneylerinde, ebeveyn β hücre hattında anahtar bulguları tekrar etmek ve duvar veya insan izletlerinde optimum şekilde tekrarlamak ve antikor bazlı bir tahlil kullanarak insülin salgılanmasını ölçmek gereklidir.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Hücre kültürü materyalleri< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>rIns-GLuc kararlı MIN6 hücreleri</td><td></td><td></td><td>pcDNA3.1 + rInsp-Ins-eGLuc'u stabil bir şekilde eksprese eden ve 250 ug / ml G418</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>4.5 g / L glikoz ortamı</td></tr><tr><td>fetal sığır serumu, ısıyla etkisiz hale getirilmiş</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>beta-merkaptoetanol</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>BP 176-100</td><td></td></tr><tr><td>glutamin</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>BP379-100</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T3924-500</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Altın Biyoteknoloji</td><td>G418-10</td><td>Stok çözeltisi 250 mg / mL suda. Alikotları -20C'de dondurun.</td></tr><tr><td>T75 doku kültürü şişeleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-202-000</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyu doku kültürü plakası</td><td>Celltreat</td><td>229196</td><td></td></tr><tr><td>Reaktif rezervuarları (50 mL)</td> <td>Corning</td><td>4870</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > İsim< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Şirket < / strong</td> <td>> < güçlü > Katalog Numarası </td> <td>< güçlü > Yorumlar< / güçlü ></td></tr><tr><td><güçlü > Salgı tahlil reaktifleri< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>BSA (RIA sınıfı)</td> <td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>50-146-952</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glikoz</td><td>Sigma</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Heps, pH 7.4</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>50-213-365</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>15568414</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>M9272-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C-7902</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Stimülasyon deneyleri için isteğe bağlı ilaçlar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diazoxide</td><td>Sigma</td><td>D9035</td><td>Stok çözeltisi: 0.1N NaOH içinde 50 mM. Diazoksitin eklendiği herhangi bir tampona eşit miktarda 0.1N HCl ekleyin.</td></tr><tr><td>epinefrin (bitartrat tuzu)</td> <td>Sigma</td><td>E4375</td><td>Stok çözeltisi: su içinde 5 mM</td></tr><tr><td>PMA (forbol 12-miristat)</td> <td>Sigma</td><td>P1585</td><td>Stok çözeltisi: 100 ve mikro; DMSO'da M</td></tr><<tr><td>güçlü>İsim</güçlü></td><td>güçlü<güçlü>Şirket</güçlü></td><td><güçlü>Katalog Numarası</güçlü></td><td>güçlü<güçlü>Yorumlar<>güçlü</td></tr><tr><td><güçlü>Guassia tahlil malzemeleri</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disodyum fosfat (Na2HPO4)</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>G334</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Bromür</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>AC44680-1000</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>AC44608-5000</td><td>Stok çözelti: 0,5 M pH 8</td></tr><tr><td>Tris baz</td><td>RPI</td><td>T60040-1000.0</td><td>Stok çözelti: 1 M pH 8</td></tr><tr><td>Askorbik Asit</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1775922</td><td>ABD Patent US7718389, askorbatın coelenterazine stabilitesini artırabileceğini öne sürdü.</td></tr><tr><td>Na2SO3</td><td>Sigma</td><td>S0505-250G</td><td>ABD Patent US8367357, sülfitin BSA</td></tr><tr><td>Coelenterazine (doğal)</td> nedeniyle arka planı azaltabileceğini önerdi <td>Nanolight / Prolume</td><td>3035MG</td><td>Stok çözeltisi: asitleştirilmiş MeOH (2.36 mM) içinde 1 mg / ml</td></tr>) <tr><td>OptiPlate-96, Beyaz Opak 96 oyuklu</td><td>Mikroplaka Perkin Elmer</td><td>6005290</td><td>Herhangi bir opak beyaz 96 oyuklu plaka yeterli olmalıdır. Şeffaf alt plakalar da çalışacaktır, ancak bazı sinyaller kaybolacaktır.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 Hibrit plaka okuyucu veya eşdeğeri</td><td>BioTek</td><td>8041000</td><td>Lüminesans algılamalı ve 96 oyuklu plaka özelliklerine sahip bir plaka okuyucu gereklidir.</td></tr><tr><td>8 kanallı VOYAGER Pipet (50-1250 & mikro; L)</td> <td>Integra</td><td>4724</td><td>: Otomatik çok kanallı pipet, lusiferaz reaktiflerinin ve kaplama hücrelerinin 96 kuyucuklu formatta,</td></tr><tr><td>8 kanallı 200 ve mikroda hızlı bir şekilde eklenmesi için son derece kullanışlıdır; L pipet</td><td>Transferpette S 20-200 ve mikro; L</td><td>2703710</td><td></td></tr></tbody></table>

bir co-salgılanmış luciferase surrogate kullanarak bağıl insülin salgılanmasını ölçme

Measuring Relative Insulin Secretion using a Co-Secreted Luciferase Surrogate

Salgılanmış insülin sonrası numune toplama için antikor tabanlı asder gerçekleştirme genellikle test süresi bir gün için birkaç saat gerektirir ve özel tahlil bağlı olarak, pahalı olabilir. Salgılanan Lusiferaz sonuçları hızlandırmak ve örnek başına tahlil maliyeti önemli ölçüde düşük sağlar. Burada, pankreas β hücrelerinden insülin salgıya aktivitesini ölçmek için nispeten az kullanılan bir yaklaşım sunuyoruz, gaussia Lusiferaz kullanarak genetik olarak C-peptid içinde eklenmiştir. Proinsüline proteolitik işleme sırasında, C-peptid insülin salgılayan vezikül içinde Lusiferaz serbest bırakılıyor nerede birlikte-insülin ile salgılanmış. Sonuçlar, Lusiferaz aşının hızı nedeniyle örnek toplamanın ardından dakikalar içinde elde edilebilir. Tahlil bir sınırlama insülin salgılanması ve mutlak bir Nicek değil göreceli bir ölçüm olmasıdır. Ancak, bu protokol, ekonomik, ölçeklenebilir ve en standart lüminesans plaka okuyucular kullanılarak gerçekleştirilebilir. Analog ve dijital çok kanallı pipetler, testin birden fazla adımını kolaylaştırır. Birçok farklı deneysel varyasyonlar aynı anda test edilebilir. Bir kez koşullar odaklı bir dizi üzerine karar verildi, insülin konsantrasyonları doğrudan standart eğrileri ile antikor tabanlı deneyleri kullanılarak ölçülmelidir Lusiferaz tahlil sonuçlarını onaylamak için.

Kontrol koşullarında testin performansını ölçmek için, basit bir glikoz doz-yanıt eğrisi veya Diazoksit paradigmasını kullanarak bir stimülasyon tamamlanabilir. Önceki durumda, 1 h glikoz-ücretsiz koşullarda için hücreler ön-inküs 1 h için tedavi tarafından takip edilen glikoza konsantrasyonları ve altında çok az salgıcı aktivite neden olmalıdır 5 mM, artan salgılanması üzerinde gözlenen iken 8 mM glikoz (Şekil 2). 35 mM KCl ile stimülasyon da uyarılmış salgı...

Bu protokol, bir insülin bağlantılı gaussia Lusiferaz ile Beta hücrelerinden insülin salgılanması için bir vekil olarak orta verim ile hızlı düşük maliyetli Lusiferaz nasıl gerçekleştirileceğini açıklar. Tahlil en lüminesans plaka okuyucular ve çok kanallı pipetler ile gerçekleştirilebilir.

Bir Co-salgılanmış luciferase Surrogate kullanarak bağıl Insülin salgılanmasını ölçme

Performing antibody-based assays for secreted insulin post-sample collection usually requires a few hours to a day of assay time and can be expensive, ...

Bu protokol, ilaç keşfini ve karakterizasyonunu hızlandırmak için beta hücre hatlarından insülin salgısını tespit etmek için alternatif bir hızlı yaklaşım tanımlar. Birden fazla tedavi aynı anda test edilebilir, çünkü bu yaklaşım yararlıdır, sonuçlar denemehemen ardından kullanılabilir, ve bu taht diğerlerinden daha uygun fiyatlı. İnsülin salgılayıcılarının yeni küçük molekül modülatörlerinin taranmasına yönelik bu yöntemin uygulanması gelecekteki diyabet tedavileri için kurşun bileşikleri belirleyebilir.Beta hücre fonksiyonunun artan bilgi genel olarak protein veya nörotransmitter salgısını daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunabilir. Bu insülin salgı muhabiri diğer beta hücreleri hatları nda ve insan adacıklarında lentiviral bir sistemde çalışmak üzere kurulmuştur. Bu tsay hücre kültürü ve işletim çok kanallı pipetler aşina bireyler için çok basit olmalıdır.Herhangi bir deney planlamadan önce, ebeveyn veya istikrarlı beta hücre hatları bir insülin ELISA kullanarak glikoz düzgün yanıt olduğunu doğrulayın. Krebs-Ringer Bikarbonat Tampon veya KRBH ve gaussia luciferase çalışma çözümlerini el yazması talimatlara göre hazırlayarak başlayın. Standart hücre kültürü tekniklerini kullanarak T75 şişelerinde MIN6 hücrelerini büyütün.InsGLuc MIN6 hücrelerini PBS ile iki kez hücre bir confluent şişe yıkama ve trypsin iki mililitre ekleyerek kaplama için hazırlayın. Hücreleri yaklaşık beş dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın, ya da hücreler şişeden ayrışana kadar. Hücre konsantrasyonu belirlemek ve mililitre başına bir milyon hücreye tam ortamda hücreleri seyreltmek, hangi eşittir 100 mikrolitre başına 100 mikrolitre bir 96 iyi plaka.Hücreler üç ila dört gün sonra yeterli teşp için confluent olmalıdır. Deneme günü, deney için yeterli glikozsuz KRBH hazırlamak ve bir rezervuar kurmak. 96 kuyu plakasından ortayı hızlı bir şekilde bir laboratuvar lavabosu üzerinde ters çevirerek ve sonra fazla ortamı çıkarmak için kağıt havlu yığını üzerinde sıkıca lekeleyerek çıkarın.Plakayı her kuyuda 100 mikrolitre glikozsuz KRBH ile iki kez yıkayın ve ilaç tedavisi yapıyorsanız, el yazması talimatlara göre KRBH'ye ilaç ekleyin. Daha sonra, her kuyuya 100 mikrolitre glikozsuz KRBH ekleyin ve bir saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra tamponu dekant edin ve tabağı kağıt havlunun üzerine dökün.Herhangi bir birikmiş arka plan yıkamak ve daha sonra plaka decant iyi başına glikoz ücretsiz KRBH 100 mikrolitre ekleyin. Kuyu başına 100 mikrolitre de ilaç tedavileri ile veya olmadan kontrol ve uyarıcı koşulları ekleyin ve bir saat boyunca 37 derece santigrat plaka kuluçka. Belirli bir deneydeki hücrelerin yanıt verme yeteneğini belirlemek için her plakaya bazal ve uyarılmış kontroller eklemek önemlidir.Hücreler zaman içinde tepkilerini kaybettiyse, onları taze sıvı nitrojen stoğundan yeniden yetiştirin. Çok kanallı pipet kullanarak 50 mikrolitre süpernatant toplayın, opak beyaz 96 iyi bir test tabağına aktarın ve numuneyi luciferase tsay'ı hazır olana kadar tezgahta oda sıcaklığında tutun. Gerekli miktarda CTZ çözeltisini GLuc istif arabelleğine boru layarak, CTZ'nin ısınmasını önlemeye özen tutarak gaussia luciferase çalışma çözümünün hazırlanın.KRBH süpernatantları ile plakaya GLuc tsay çalışma çözümlerini hızlı bir şekilde eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın. Kuyuların yanlarında damlacıklar varsa, kısaca bir masa, salıncak kova santrifüj plaka spin. Sonra plaka okuyucu koymak ve 0.1 saniye entegrasyon süresi ile parlaklık okuyun.Bu test, artan glikoz konsantrasyonlarına yanıt olarak insülin salgısını ölçerek kontrol koşulları altında test edilmiştir. Çok az salgı aktivitesi beş milimolar glukozun altında gözlenir ve salgı sekiz milimolar üzerinde artmıştır. Hücreler diazoksit paradigması ile meydan zaman beklenen salgı yanıtı sergiler.Diazoksit tedavisi ekstrasellüler potasyum klorür yoksa insülin salgıını engeller. Potasyum klorür mevcut olduğunda, salgı glikoz daha ilavesi ile güçlendirilebilir. Ayrıca InsGLuc MIN6 hücrelerinin potasyum klorür, diazoksit, PMA ve epinefrin gibi modüle edici bileşiklerin salgılandığı gibi tepki verdiği gösterilmiştir.Bu prosedürü takiben, kritik sonuçlar insülin konsantrasyonlarının belirlenmesine olanak sağlayan antikor bazlı ELISA veya HTRF tahlillerinde KRBH süpernatanları analiz edilerek doğrulanmalıdır. Broad Enstitüsü'ndeki bir grup tarafından bir çok öncü çalışma yapıldı, bu da araştırmamda bu titreyi giderek daha fazla kullanmamın önünü açtı. Biz ve Broad'daki grup da dahil olmak üzere birçok araştırma grubu, bu yaklaşımı diyabet alanında ilaç keşif çalışmalarında kullanmaktadır.

measuring-relative-insulin-secretion-using-co-secreted-luciferase

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada, Promega Çift GloTM Lusiferaz Testi Sistemi kullanılarak bir lusiferaz tabanlı muhabiri gen yaklaşımı ile fagositoz indüklenen gen ekspresyon değişiklikleri incelemek için prosedürler açıklanmaktadır.

Membran Biyogenez bir Lusiferaz Tabanlı Reporter Gen Testi ile incelenmesi

Lusiferaz ifade Meme tümör hücrelerini farelerde subkütan implant ve uzunlamasına bir çalışmada non-invaziv tümör büyümesini ve gelişimini izlemek için optik görüntüleme ile görüntülendi.

Meme Tümörleri IVIS Spektrum kullanarak in vivo Bioluminescent Görüntüleme

Bu yazıda onların büyüme ve metastaz sırasında metastatik meme kanseri hücrelerinde ifade böceği ve Renilla lusiferaz enzimler hem bioluminescent reaksiyonları, inşa görselleştirmek ve ölçmek için yöntemler...

Vivo Çift Yüzey Bioluminescent Imaging&#39;de

Video, lusiferaz etiketli proteinleri ölçmek için kullanılan lusiferaz testini göstermektedir. Tahlil, ilgilenilen bir protein ile konjuge edilen küçük parçaya bağlanan büyük bir parçadan oluşan tasarlanmış bir lusiferaz enzimi kullanır. Bağlı alt birimler, substratın varlığında ışıldayan bir sinyal yayan aktif bir enzim oluşturur. Bu sinyal daha sonra bir luminometre kullanılarak ölçülür.

Lusiferaz Testi: Tasarlanmış Nanolusiferaz Sistem Tabanlı Biyomuhabirler Kullanarak Lüminesan Sinyalleri Ölçmek İçin Yüksek Verimli Bir Test

Transsellüler protein etkileşimleri pankreatik beta hücre fonksiyonu önemli belirleyicidir. Burada ayrıntılı bir yöntem uyarlanmış özel transmembran proteinler insülin salgılanmasını nasıl etkilediğini araştıran sinaptogenez-için bir kokültürü model. Transfekte edilmiş HEK293 hücreleri ilgili proteinlerin ifade eder; beta hücreleri transfekte edilmiş veya başka şekilde doğrudan tedirgin gerekmez.

Pankreas Beta Hücreleri ile insülin salgılanması Etkileyen Ekstrasellüler Protein etkileşimleri kokültürü Analizi

Hücresel süreçlerin bir sistem düzeyinde anlayış elde günümüz hücre biyolojisi bir hedeftir. Burada çeşitli hücresel fonksiyonunun çoklama lusiferaz gazetecilere yönelik stratejiler tarif son noktaları genom ölçekli RNAi kütüphaneleri kullanılarak gen işlevini sorgulamak için.

Kültür Hücreler Kanser ile ilişkili Sinyal İletimi sorgulanması için bir Multiplexed Lusiferaz tabanlı Tarama Platformu

Burada, paralel sirkadiyen biyolüminesansı ve insan adacık hücrelerinin ve birincil miyotüplerin salgı aktivitesini izlemek için ayarları açıklıyoruz. Bunun için, bir lusiferaz çekirdek saat raportörünün lentiviral gen iletimini, ardından in vitro senkronizasyonu ve sürekli hücre perifüzyonu ile çıkış ortamının toplanmasını kullandık.

İnsan Primer Hücre Kültürleri içinde Sirkadyen Saat Gen İfade ve Hormon salgısını Paralel Ölçümü

Burada, homojen mevcut zaman hücrelerden salgılanan insülin hızlı algılama için etkili bir yöntem olarak FRET (HTRF) çözüldü.

Homojen zaman çözüldü Förster rezonans enerji transferi tabanlı tahlil insülin salgılanması algılanması için

Bu iletişim kuralı bir özünde düşük aktivite, tek ciro proteaz hücresel bir bağlamda proteolitik aktivite değerlendirmek için bir yöntem sunuyor. Özellikle, bu yöntem PCSK9, lipid metabolizması proteolitik olan faaliyet son hypercholesterolemic işlevi için gerekli olan bir anahtar sürücü proteolitik aktivite değerlendirmek için uygulanır.

Tek-ciro proteaz PCSK9 proteolizis değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek Luciferase tahlil

Bu protokol, spontan diyabetik NOD farelerinden saflaştırılmış splenositlerle mücadele eden obez olmayan diyabetik (NOD)-şiddetli kombine immün yetmezlikli farelerde NIT-1 hücrelerinin nakli ve görüntülenmesi için basit ve minimal invaziv bir yöntemi tanımlamaktadır.

Farelerde Otoimmün Diyabetin Evlat Edinilen Transfer Modelinde Greft Sağkalımının Biyolüminesan İzlenmesi

Bu protokol, bir siklik adenozin monofosfat (cAMP) biyosensörünün, bir cAMP fark detektörünün in situ (cADDis) ve bir mikroperifüzyon sisteminin adenoviral iletimini kullanarak hücre içi sinyal olaylarının senkron edinimi ve birlikte kaydı ve birincil insan psödoisletleri tarafından insülin ve glukagon salgılanması için bir yöntemi açıklar.

Floresan Biyosensör Dinamiğinin ve Hormon Salgı Profillerinin Senkron Değerlendirmesi için İnsan Psödoislet Sistemi

Öğrenin, Gaussia luciferase kullanarak MIN6 beta hücrelerinde insülin salgılanmasını hızlı ve düşük maliyetli ölçme yöntemini. Bu yöntem, diyabet ilaç keşfi için orta verimli tarama sağlar.

Bir Co-salgılanmış luciferase Surrogate kullanarak bağıl Insülin salgılanmasını ölçme

Daha fazla video keşfet