RNA In Vivo'nun 4-Thiouracil (Ers4tU) ile Son Derece Hızlı ve Spesifik Metabolik Etiketlemesi

Başka hiçbir protokol yeni sentezlenmiş RNA gibi kısa bir zaman ölçeğinde analiz edilmesine izin verir, çünkü bu yöntem önemlidir ve bu kadar kısa bir darbe ile darbe-kovalamaca deneyleri sağlar. Bu protokol, Best AID 4U protokolü gibi protein tükenmesi ile iyi çalışır. Ana avantajı arka plan düşük olmasıdır.

Bu, hemen hemen tüm nonthiolated RNA kaldırarak, kısa etiketleme süreleri sağlar. Yazılı protokol ayrıca yapılabileceği birçok farklı deney türünü ve bunları bu tekniğe nasıl entegre edebileceklerini de ayrıntılarıyla anlatır. Bu prosedüre başlamak için YMM ortasında mayayı 0,6 ile 0,8 arasında Bir OD 600'e yetiştirin.

Bir duman kaputunda, 50 mililitrelik bir tüpe istenilen numune hacminin %30 ila %50'sine eşdeğer bir metanol ekleyin. Tüpleri sıkıca kapatın, etiketleyin ve soğuması için kuru buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, numunelerin uzun süreli depolanması için iki mililitrelik tüpleri etiketleyin ve soğuması için buzüzerine yerleştirin.

İki mililitretüplerzirkoni adak ekleyin. Buz üzerinde numune başına en az bir mililitre su soğutun. Kültüre bir S.pombe çivisi eklenecekse, çözülmek için buz üzerinde siolated S.pombe hücrelerinin bir aliquot yerleştirin.

Girdap çözülmüş aliquot ve kültürekleyebilirsiniz. Sonra 10 mikromolar bir konsantrasyon için kültüre 4tU ekleyin ve şiddetle karıştırın. 15 saniye ile beş dakika arasında bir süre için thio-label.

Zaman kursunun sonuna kadar düzenli aralıklarla kültür den örnekler alın. Her örneği metanol içeren hazırlanan santrifüj tüplerinden birine ekleyin. Mühür her tüp, iyice karıştırmak için sallayın ve kuru buz üzerine yerleştirin.

Tüm numuneler alındıktan sonra hepsini buza yerleştirin. Örneklerin hiçbirinin dondurulmamadığından emin olun. Herhangi bir dondurulmuş varsa, sürekli ters çevirerek elinize hafifçe ısıtın.

Hücreleri 3,000 kez g ve dört santigrat derecede iki dakika boyunca hücreleri pelet için santrifüj. Sıvı dökün ve şiddetle yukarı ve aşağı boru ile buz soğuk su en az bir mililitre pelet resuspend. Süspansiyonu hazırlanan vida kapağı tüpüne aktarın ve tüpü buza yerleştirin.

Hücreleri yeniden peletlemek için 13,000 kez g'den daha büyük bir hızda numuneleri kısaca santrifüj edin. Sonra buz üzerine geri yerleştirin ve sıvı çıkarın. İlk olarak, 400 mikrolitre AE tampon, 40 mikrolitre SDS ve 800 mikrolitre fenol düşük pH ekleyin.

10 saniye girdap tarafından yeniden askıya alın. Daha sonra hücreleri homogenizer en düşük güç ayarında üç iki dakikalık patlamalar için lize. Homojenizasyon darbeleri arasında örnekleri iki dakika buzun üzerinde bırakın.

Lysed hücreleri katılanıncaya kadar kuru buzun üzerine beş dakika yerleştirin. Daha sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca 13.000 kez g'nin üzerinde bir hızda hücreleri döndürmek için bir mikrosantrifüj kullanın. Bundan sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi fenol kloroform ekstraksiyonu ve kloroform ekstraksiyonu gerçekleştirin.

RNA çökelti 10 molar lityum klorür hacminin 1/3 ila 1/2 arasında ekleyin ve karıştırın. Santrifüj 13,000 kez g'den beş dakika daha hızlı. Sıvıyı çıkarın ve dregs kaldırmak için kısa bir süre örnek yeniden döndürün.

Sonra, % 70 etanol 300 ila 500 mikrolitre ile pelet yıkayın. Yıkanmış peleti kısa bir süre için santrifüj edin ve kalan etanolleri çıkarın. RNA peletini 90 mikrolitre TE'de pH 7.0'da sallayarak 65 derecede ısıtarak yeniden çözün.

Tam RNA çözünürasyon kontrol ettikten sonra, süspansiyonu 0,2 mililitrelik bir tüpe aktarın. Başlamak için, RNA'ya 10 mikrolitre HPDP-biotin çözeltisi ekleyerek biyotinylate ve iyice karıştırın. Karanlıkta 65 derecede 15-30 dakika kuluçkaya yat.

Daha sonra, küçük bir reçine hacmi, boyut dışlama sütununa dahil edilmemiş biotin hariç hazırlayın. Sütunun alt etiketini çıkarın, kapağı gevşetin ve sütunu iki mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Arabelleği temizlemek ve akışı atmak için bir dakika boyunca 1, 500 kez g santrifüj.

Daha sonra sütunun üst kısmına 0,3 mililitre TE ekleyin ve aynı koşulları kullanarak tekrar döndürün. Yıkanmış kolonu 1,5 mililitrelik taze bir tüpe aktarın. Örnek kuluçka tamamlandığında, örneği sütunun üst bölümüne ekleyin.

İki dakika boyunca 1, 500 kez g santrifüj, tüpün altında biyotinylated RNA örneği bırakarak. Sütunu atın. Ve numuneyi içeren tüpe 10 molar lityum klorür 1/3 ila 1/2 hacim ekleyin.

RNA'yı yeniden çöktürmek için karıştırın. İlk olarak, Depc tarafından işlenmiş suyun 200 mikrolitre rna yeniden eritin. RNA konsantrasyonu ölçün ve tüm numuneler için eşit miktarda RNA verecek her numune için hacimleri hesaplayın.

Bu miktarda RNA'yı taze bir tüpe ekleyin ve DEPC ile işlenmiş suyu toplam 200 mikrolitre hacmine kadar ekleyin. Bir numune oda sıcaklığında olduğunda, 10 x NaTM tampon25 mikrolitre, bir azı lı sodyum fosfat 25 mikrolitre ve% 10 SDS 2.5 mikrolitre ekleyin. Iyice karıştırın ve 30 saniyeden daha kısa bir süre boyunca yaklaşık 100 kez g hafifçe santrifüj.

Bir x NaTM tamponu, 0.1 molar sodyum fosfat ve %0.1 SDS ile her numune için iki mililitre boncuk tamponu hazırlayın. Düşük tutma 1.5 mililitre tüp streptavidin boncuk 50 mikrolitre ekleyin. Tüpü manyetik rafa yerleştirin ve boncukların yerleşmesini bekleyin.

Sonra, aspirasyon ile sıvı çıkarın. Boncukları yıkamak için, boncuk pelet tamamen askıya alınana kadar boncuk tampon ve girdap 200 mililitre ekleyin. Tüpü yaklaşık 100 kez en fazla beş saniye santrifüj edin.

Boncukmıknatıs tarafından yakalanan izin vermek için manyetik rafa tüp yerleştirin. Az sayıda örnek varsa sıvıyı aspirasyon ile çıkarın. Sıvı yıkın ve sonra çok sayıda örnek varsa aspire.

200 mikrolitre boncuk tamponu, 10 mikrolitre glikojen ve 2,5 mikrolitre tRNA ile blok. Orta hızda uç üzerinde dönerken 20 dakika oda sıcaklığında kuluçka. Bundan sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi sıvıyı çıkarın ve tekrar yıkayın.

Numunedeki boncukları yeniden askıya alın ve dönerken oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Bu kuluçka sırasında, her örnek için taze bir 1,5 mililitrelik tüp hazırlayın. PH 5.3 ve glikojen 20 mikrogram üç molar sodyum asetat 1/10 hacim ekleyin.

Üç saniye boyunca yaklaşık 100 kez g santrifüj. Bağlanmamış RNA'yı boncuklardan çıkarın ve metin protokolünde belirtildiği gibi yıkayın. RNA'yı eleştirmek için, boncuklara taze hazırlanmış 0,7 molar beta merkaptoetanol 50 mikrolitre ekleyin.

Girdap ve santrifüj sonra, manyetik raf içinde bulamaç yerleştirin. Pipet Hazırlanan 1.5 mililitrelik santrifüj tüpler içine çözelti içeren RNA. Elute bir kez daha daha açıklandığı gibi.

Daha sonra, eluted RNA artık boncuk kaldırmak ve taze, düşük bağlayıcı 0,5 mililitre santrifüj tüp sıvı aktarmak için manyetik raf geri örnek yerleştirin. Örneği karıştırın. Ve sonra nsRNA çökelti için etanol 2.5 cilt ekleyin.

Karıştırma ve kuluçka sonra, en az 13, 000 kez g ve 20 dakika boyunca dört derece santigrat hızda santrifüj. Bu protokol kullanılarak kurtarılan snRNA'nın tipik verimleri burada gösterilmiştir. Sıfır noktasındaki RNA kurtarmasının, yaklaşık 30 milyar hücreden sadece 0,3 mikrogram RNA'nın kurtarıldığı uzun zaman noktalarından kurtarılançok küçük bir kısmı olduğunu unutmayın.

Etiketleme sadece 30 saniye sonra, ancak, iki kat daha fazla RNA aynı sayıda hücre den toplanır. Biyoanalizör takibinde, RNA öncüllerimiz 1,000 nükleotite yakın bir tepe ve 1, 700'e 1, 800 nükleotitte bir çift tepe olarak görülebilir. Bu ara ların bolluğu, tiyasyon devam ettikçe artar.

Thiolation daha sonra thio-labeling başlangıcından itibaren 15 saniye aralıklarla alınan örnekler ile gerçekleştirilir ve ACT1 RNA transkript işleme izlenir. Görüldüğü gibi pre-mRNA ve lariatlar sadece 15 saniye etiketlemeden sonra bile üretilir. Yaklaşık 45 saniye ile bir dakika arasında bir dakika sonra, lariats ve pre-mRNA miktarı bu RNA türlerinin çok transkripsiyon tarafından oluşturulan olarak birleştirme tarafından işlenir ile dengeye ulaşmak.

En zor adımlar boncuk, yıkama ve engelleme içeren olanlar vardır. Boncukları kaybetmemeye veya kurumasına izin vermemeye dikkat edin. Yeni sentezlenen RNA'yı saflaştırdıktan sonra, herhangi bir geleneksel RNA analiz yordamını kullanabilirsiniz.

RNA'yı bir biyoanalizör veya benzeri bir şekilde çalıştırmanız önerilir. Bundan sonra, normalde RNA analiz etmek için QPCR ve RNA-Seq kullanın. Bu yöntem, RNA işleme kinetik analiz için ideal olduğunu kanıtladı.

En tehlikeli adımlar RNA ekstraksiyonfenol ve kloroform kullananlardır. Bu kimyasalları mühürsüz bir kapta her kullandığınızda, bunu bir duman başlığında yapın ve uygun koruyucu giysiler, laboratuvar önlüğü ve eldiven giyin. Bir sızıntıya yol açacaktır gibi vida kapağı tüp iplik hiçbir zirkon boncuk lar olduğunu özellikle dikkat edin.