Name: DNA Hasarının Değerlendirilmesinde Kuyruklu Yıldız Testinde Donmuş Dokunun Kullanımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Öğrenin, kuyruklu yıldız testinde donmuş doku örneklerinin hazırlanması ve DNA hasarının değerlendirilmesi yöntemini. Bu teknik, genotoksisite araştırmalarında lojistik kolaylık sağlar ve örnek bütünlüğünü korur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar lincoln Martin ve Kelley Owens uzman teknik yardım hazırlanması ve kuyruklu yıldız slaytlar ve Dr Carol Swartz istatistiksel analizler yapmak için puanlama için borçlubulunmaktadır. Yazarlar ayrıca ILS'de Genetik Toksikoloji, Araştırmacı Toksikoloji ve Nekropsi programlarının üyelerinin destekleyici katkılarını kabul etmektedirler.

Dokular, İyi Laboratuvar Uygulamaları yönetmelikleri (21 CFR Bölüm 58) ve Kurumsal Hayvan tarafından onaylanan hayvan kullanım protokolleri uyarınca NTP sözleşme laboratuvarlarında AAALAC akredite tesislerde yapılan çalışmaların yürütülmesi sırasında hasat edildi Her laboratuvarda Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC).
1. Doku Hasat ve İşleme
NOT: Gerekirse yeniden analiz yapabilmek için yinelenen numune tüplerinin (örn. karaciğer) hazırlanması veya numunenin yaklaşık yarısının başka bir depolama tüpüne (örn. duodenum, mide) aktarılması yararlıdır. Bağırsak sistemi dokuları için olası numuneden numuneye değişkenliği en aza indirmek için, her hayvan için mideye göre aynı doku bölgesinin örnekalınmasına özen gösterilmelidir ve bir örnek çoğaltılabilir numuneler oluşturmak üzere bölünür. Plastik forseps beyin gibi yapışkan dokuların transferi için tavsiye edilir. Bir seçenek olarak, konik bir tüpe bağlı 40 μm hücreli süzgeç kullanılarak homojen tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için kıyma, kazınmış veya homojen doku preparatları filtrelenebilir.
<ol><li>Herhangi bir bağlı bağlı doku, organ ve enkaz kaldırın organ (lar) ilgi. Çıkarıldıktan hemen sonra, kalan kan ve enkazkaldırmak için ,7 mL soğuk taze hazırlanmış kıyma çözeltisi (Mg++, Ca++ ve fenol kırmızısız Hank's Balanced Salt Solution, 10% v/v DMSO ve 20 mM EDTA pH 7.5) içeren orta büyüklükte bir tartım teknesinde organı şiddetle swish.</li>
	<li>Her organı, daha fazla işleme yapılına kadar, dokuların buz üzerinde, buzun altında tutmak için yeterli (~7 mL) soğuk kıyma solüsyonu içeren başka bir temiz tartı teknesine aktarın.</li>
	<li>İlgi çeken her organın bir bölümünü çıkarın ve katıştırma kasetine yerleştirin. Gelecekteki histopatoloji değerlendirmesi için laboratuvarın standart prosedürlerine göre %10 nötr tamponlu formalin, trim ve parafin ilerler.</li>
	<li>Karaciğer için sol lobun 5 mm boyuna kısmını kesin ve ~7 mL soğuk kıyma çözeltisinde hafifçe swish. Doku şeridini ~ 7 mL soğuk kıyma çözeltisi içeren temiz bir orta boy tartım teknesine yerleştirin ve daha fazla işlemeye hazır olana kadar buz üzerinde bakım ını yapın (adım 1.8 veya 1.11).</li>
	<li>Duodenum için, mideye duodenum proksimal 10 mm kısmını kesti. 21-25 G iğne kullanarak, enkaz ve bakterileri temizlemek için floş.
	<ol>
<li>İğneyi duodenumun bir ucuna yerleştirin ve 1 mL soğuk kıyma çözeltisi ile yıkayın.</li>
		<li>Duodenumu ters çevirerek ve 1 mL kıyma çözeltisi ile tekrarlayarak diğer yönü temizleyin. İğneyi at.</li>
		<li>Duodenumu açık dilimleyin ve ~7 mL kıyma çözeltisi içeren orta boy bir tartım teknesine koymadan önce kıyma çözeltisinin ~7 mL'sinde durulayın; daha fazla işlemeye hazır olana kadar buzüzerinde muhafaza edin (adım 1.8 veya 1.11).</li>
	</ol></li>
	<li>Beyin için, ilk iki yarımküreye beyin bölmek için yararlı olabilir; bir yarımküre olası histopatoloji için kaydedilebilir (bkz. adım 1.2).
	<ol>
<li>İlgi beyin bölgesi (ler) diseksiyon ve yavaşça soğuk kıyma çözeltisi ~ 7 mL swish.</li>
		<li>Doku(lar) ~7 mL soğuk kıyma çözeltisi içeren temiz bir orta boy tartım teknesine aktarın ve daha fazla işlemeye hazır olana kadar buzüzerinde bakım ını yapın (adım 1.8 veya 1.11; beyincik ve hipokampus gibi küçük bölgelerin daha fazla budama gerektirmeyebileceğini unutmayın).</li>
	</ol></li>
	<li>Mide için
	<ol>
<li>Ön mideyi çıkarın ve atın. Glandüler mideyi kesin ve orta büyüklükteki bir tartı teknesinde ~7 mL soğuk kıyma tamponu kullanarak gıdalardan arınarak yıkanın.</li>
		<li>Olası histopatoloji değerlendirmesi için fiksasyon için duodenuma 5 mm'lik salgı bezi mide proksimal şeridini çıkarın (bkz. adım 1.2).</li>
		<li>Kalan mideyi orta boy bir tartı teknesinde soğuk kıyma tamponunun ~7 mL'sine yerleştirin ve 15-30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. NOT: Bu kuluçka adımı gerekli olmayabilir; Bu adım JaCVAM doğrulama protokolüne dahil edildi, ancak OECD testkılavuzunda belirtilmemiştir 8,9.</li>
		<li>Mideyi temiz bir parafin parçasına (veya Petri kabına veya tartı teknesine) aktarın ve enkazları temizlemek için neşter bıçağı veya politetetraflorotenen (PTFE) kazıyıcı kullanarak yüzey epitelini iki veya daha fazla kez kazıyın. Bir pipet kullanarak 1 mL soğuk kıyma tamponu ile forceps ve durulamak ile gastrik mukozayı almak. Mide dokusunu temiz bir yüzeye veya tabağa aktarın.</li>
		<li>Hücreleri serbest bırakmak için mide epitelini kıyma çözeltisinde (genellikle 250 μL/fare veya 500-1.000 μL/rat) 4-5 kez (gerekirse daha fazla) bir neşter bıçağının veya PTFE kazıyıcının arkasına kazıyın. İsteğe bağlı olarak, daha fazla hücre kurtarmak için kıyma çözeltisi yaklaşık eşit hacimli doku durulayın. Bir pipet kullanarak serbest hücreleri içeren kıyma çözeltisi toplamak ve buz üzerinde bir mikrosantrifüj tüpü ne aktarım.</li>
	</ol></li>
	<li>Doku örnekleri için, karaciğer veya beyin dokusunun 3-4 mm'lik bir bölümünü veya ~5 mm duodenum'u kesip 1 mL soğuk kıyma solüsyonu içeren 1,5 veya 2,0 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Numunesoğuk tutarken, ince dağılana kadar kıyma makası ile hızlı bir şekilde kıyma (≤30 s). Örnek biraz bulutlu görünmelidir; ancak, tüpün altına yerleşecek bazı parçaların kalması yaygındır.</li>
	<li>Taze doku kullanmak için, buz üzerinde kıyılmış doku veya kazınmış epitel hücreleri içeren tüpler korumak; yaklaşık 1 saat hasat içinde kuyruklu yıldız slaytları hazırlamak için doku kullanın (bölüm 2'de özetlenmiştir).</li>
	<li>Doku örneklerinin dondurulması için, kazınmış epitel hücrelerinin kıyma veya toplanmasından hemen sonra
	<ol>
<li>Tüp kapağını ve damla tüpünü sıvı nitrojen içeren bir Dewar şişesine sabitle; tüpler nekropsi (≤3 h) süresince sıvı nitrojende tutulabilir.</li>
		<li>Bir kepçe kullanarak tüpleri alın ve sıralamak için kuru buz üzerine yerleştirin. Tüpleri -80 °C'lik bir dondurucuda kuru buz ve saklama kutusuna aktarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Dondurulmuş doku küplerini hazırlamak için birkaç küçük doku parçası (≤4 mm çapında ve ~6 mm uzunluğunda; Şekil 1).
	<ol>
<li>Ayrı ayrı doğrudan orta ölçekli bir tartma tekne veya sıvı nitrojen içeren diğer uygun gemi içine bırakın.</li>
		<li>Parçaların tamamen donması ve tek tek dondurulmuş doku küplerini kuru buz üzerinde tutulan etiketli bir mikrosantrifüj tüpüne veya kriyotube'a aktarması için birkaç saniye bekleyin; parçaların donma işlemi sırasında bir araya toplanmış olmasını izin vermez.</li>
		<li>Tüpleri -80 °C'lik bir dondurucuda kuru buz ve saklama kutusuna aktarın.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Slayt Hazırlama
<ol><li>
Kıymalı/kazınmış dokular için
	<ol>
<li>Islı buz üzerinde taze dokular içeren tüpleri bakımını yapıtın.</li>
		<li>Dondurulmuş doku tüplerini, numuneler tamamen eriyene kadar oda sıcaklığındaki su banyosuna yerleştirin ve soğuk tutulmalarını sağlar. Tüpleri hemen buza aktarın.</li>
		<li>Agarose'a (adım 2.3) transfer için hücreleri geri çekmeden hemen önce, her hücresüspansiyonuna hafifçe karıştırın; filtrelenmemiş numuneler için, büyük parçaların tüpün altına yerleşmesine izin verin. Tüm numuneler için slaytlar hazırlanana kadar tüm tüpleri buzüzerinde saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Küplü doku için
	<ol>
<li>80 °C'lik dondurucudan doku küpleri içeren tüpleri alın ve slayt hazırlanınceye kadar kuru buzüzerinde muhafaza edin.</li>
		<li>Aliquot 1 mL Merchant's orta (0.14 M NaCl, 1.47 mM KH2PO4, 2.7 mM KCl, 8.1 mM Na2HPO4, 10 mM NaEDTA, pH 7.4) veya miskasyon çözeltisi her örnek için etiketli 1,7 mL mikrosantrifüj tüp içine ve buz üzerinde korumak.</li>
		<li>Doku erimesini önlemek için hızla çalışarak, oda sıcaklığındaki doku kıyma cihazının açık ucuna bir doku küpü yerleştirin (Şekil 1). Birden fazla doku parçaları kullanılabilir; gerekirse, dondurulmuş doku kesilebilir veya cihaza sığacak şekilde küp boyutunu azaltmak için soğuk bir harç ve havaneli kullanarak küçük parçalara çatlayabilir.</li>
		<li>Hızlı bir şekilde daha sonra soğuk kıyma solüsyonu içeren mikrocentrifuge tüp içine yerleştirilmelidir örgü ucuna doku itmek için cihaza bir boyut uyumlu şırınga piston takın; sıvıyı tüpü nakışmaya zorlamaktan kaçının. Dokunun tamamen erimesini sağlamak için cihazın örgü ucunu soğuk kıyma çözeltisine yaklaşık 5-10 s kadar batırın.</li>
		<li>Hücreler örgü gözenekleri ile ekstrüzyon görülene kadar tamamen piston depress. Daha sonra pistonu yaklaşık 2,5 cm yukarı çekin ve tekrar tamamen bastırın; kıyma çözeltisi bulanık hale gelene kadar işlemi birkaç kez tekrarlayın.</li>
		<li>Gerekirse, örnek 1100 rpm 5 dakika için soğutulmuş santrifüj ve supernatant bir kısmını n için hücre yoğunluğunu artırmak için konsantre olabilir.</li>
		<li>Her örnek için temiz bir doku kıyma cihazı kullanarak tüm numuneler için işlemi tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>37 °C'de %0,5 düşük erime noktası nın 450 μL'sini içeren bir tüpe 50 μL hücre süspansiyonu aktarın. NOT: Hacimler ayarlanabilir, ancak agarose miktarı ≤%1 olmalıdır.</li>
	<li>Daha önce açıklandığı gibi slaytları hazırlayın ve puanlayın10,11.</li>
</ol>

<ol><li>van der Leede, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+and+data+interpretation+of+the+in+vivo+comet+assay+in+pharmaceutical+industry%3A+EFPIA+survey+results%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Performance and data interpretation of the in vivo comet assay in pharmaceutical industry: EFPIA survey results.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 775-776, 81-88 (2014).</li>
<li>ICH. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+Conference+on+Harmonisation+of+Technical+Requirements+for+Registration+of+Pharmaceuticals+for+Human+Use+%28ICH%29+S2%28R1%29%3A+Guidance+on+Genotoxicity+Testing+and+Data+Interpretation+for+Pharmaceuticals+Intended+for+Human+Use%5BTitle%5D)+AND+%22ICH%22%5BJournal%5D)">International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) S2(R1): Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use.</a> ICH. , (2012).</li>
<li>EFSA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scientific+opinion+on+genotoxicity+testing+strategies+applicable+to+food+and+feed+safety+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22EFSA+Journal%22%5BJournal%5D)">Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment.</a> EFSA Journal. 9 (9), 2379(2011).</li>
<li>Lorenzo, Y., Costa, S., Collins, A. R., Azqueta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%2C+DNA+damage%2C+DNA+repair+and+cytotoxicity%3A+hedgehogs+are+not+always+dead%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">The comet assay, DNA damage, DNA repair and cytotoxicity: hedgehogs are not always dead.</a> Mutagenesis. 28 (4), 427-432 (2013).</li>
<li>Guerard, M., Marchand, C., Plappert-Helbig, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+experimental+conditions+on+data+variability+in+the+liver+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Influence of experimental conditions on data variability in the liver comet assay.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (2), 114-121 (2014).</li>
<li>Jackson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+freezing+tissues+and+cells+for+analysis+of+DNA+strand+break+levels+by+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Validation of freezing tissues and cells for analysis of DNA strand break levels by comet assay.</a> Mutagenesis. 28 (6), 699-707 (2013).</li>
<li>Recio, L., Kissling, G. E., Hobbs, C. A., Witt, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Comet+assay+dose-response+for+ethyl+methanesulfonate+using+freshly+prepared+versus+cryopreserved+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Comparison of Comet assay dose-response for ethyl methanesulfonate using freshly prepared versus cryopreserved tissues.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (2), 101-113 (2012).</li>
<li>Uno, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JaCVAM-organized+international+validation+study+of+the+in+vivo+rodent+alkaline+comet+assay+for+detection+of+genotoxic+carcinogens%3A+II.+Summary+of+definitive+validation+study+results%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">JaCVAM-organized international validation study of the in vivo rodent alkaline comet assay for detection of genotoxic carcinogens: II. Summary of definitive validation study results.</a> Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 45-76 (2015).</li>
<li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OECD+Guideline+for+the+Testing+of+Chemicals%3A+In+Vivo+Mammalian+Alkaline+Comet+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22OECD%22%5BJournal%5D)">OECD Guideline for the Testing of Chemicals: In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay.</a> OECD. 489, (2016).</li>
<li>Hobbs, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comet+assay+evaluation+of+six+chemicals+of+known+genotoxic+potential+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Comet assay evaluation of six chemicals of known genotoxic potential in rats.</a> Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 172-181 (2015).</li>
<li>Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Alkaline+Comet+Assay+and+Enzyme-modified+Alkaline+Comet+Assay+for+Measuring+DNA+Strand+Breaks+and+Oxidative+DNA+Damage+in+Rat+Liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), 53833(2016).</li>
<li>Hobbs, C. A., Chhabra, R. S., Recio, L., Streicker, M., Witt, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotoxicity+of+styrene-acrylonitrile+trimer+in+brain%2C+liver%2C+and+blood+cells+of+weanling+F344+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Genotoxicity of styrene-acrylonitrile trimer in brain, liver, and blood cells of weanling F344 rats.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (3), 227-238 (2012).</li>
<li>Hobbs, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+evaluation+of+the+flavonol+anti-oxidants%2C+alpha-glycosyl+isoquercitrin+and+isoquercitrin%2C+for+genotoxic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Comprehensive evaluation of the flavonol anti-oxidants, alpha-glycosyl isoquercitrin and isoquercitrin, for genotoxic potential.</a> Food and Chemical Toxicology. 113, 218-227 (2018).</li>
<li>Pant, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vehicle+and+positive+control+values+from+the+in+vivo+rodent+comet+assay+and+biomonitoring+studies+using+human+lymphocytes%3A+historical+database+and+influence+of+technical+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Vehicle and positive control values from the in vivo rodent comet assay and biomonitoring studies using human lymphocytes: historical database and influence of technical aspects.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 633-642 (2014).</li>
</ol>

Bu çalışma, HHSN273201300009C sözleşmesi kapsamında NIH, Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü (NIEHS) Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir; ancak, burada yer alan ifadeler, görüşler veya sonuçlar NIEHS, NIH veya Amerika Birleşik Devletleri hükümetinin ifadelerini, görüşlerini veya sonuçlarını temsil etmez.

Daha önce gösterildiği gibi7,12,13, düzgün flaş dondurulmuş kıyma doku ele kuyruklu yıldız tahsiniyi iyi sonuçlar sağlar. Aslında, laboratuarımızda hazırlanan dondurulmuş kıyılmış sıçan ve fare karaciğeri için temel % kuyruk DNA değerleri, yeni kıyılmış fare karaciğeri örnekleri için OECD test rehberi9 tarafından tavsiye edilen genellikle ≤%6'dır. Dondurulmuş olarak doğrlanan ve saklanan çeşitli doku tipl...

Kuyruklu yıldız tsay giderek kimyasallar veya diğer çevresel stres 1 maruz kültürlü hücre ve dokularda DNA hasarı değerlendirmek için bir araç olarakkullanılır. Titrek, DNA çift ve tek iplikçikli sonları, alkali-labile lezyonlarını ve eksik DNA onarımı ile ilişkili tek iplikçikli sonları tespit edebilir. Farmasötik testler için Farmasötik Ürünler için Teknik Gerekliliklerin Uyumlaştırılması Uluslararası Konseyi (ICH) farmasötik testler için kılavuz, kemirgen eritrosit mikronükleus testini sağlamak için ikinci bir test olarak kuyruklu yıldız testi gibi bir DNA iplikçik kırılması testi önerir ve tümör indüksiyonu hedef organlarında eylem modunu değerlendirmek için bir takip testiolarak 2. Avrupa Gıda Güvenliği Otoritesi (EFSA) in vivo kuyruklu yıldız testi bir in vitro genotoksisite testi olumlu bir sonucun alaka araştırmak için uygun bir takip testi olarak önerir3. 2014 yılında, kemirgen kuyruklu yıldız testi için bir OECD test kılavuzu onaylanarak, genotoksik potansiyelin düzenleyici testlerinde kullanılmak üzere testin kabul edilebilirliği artırıldı. Test, sakinleştirilmiş DNA döngüleri ve lized hücrelerin çekirdeklerinden göç eden parçaların elektroforetik olarak ayrılmasına dayanır. Temel olarak, tek hücreler mikroskop slaytlar üzerine katmanlı olmuştur agarose gömülüdür. Slaytlar daha sonra bir alkalin (pH > 13) çözeltisi, sıkıca sarılmış nükleer DNA dinlenmek ve gevşemek için izin veren bir lysis tampon batırılır. Slaytlar daha sonra bir elektrik alanına yerleştirilir, bu da negatif yüklü DNA'nın atota doğru göçüne neden olur ve kuyruklu yıldıza benzeyen görüntüler oluşturur; kuyruklu yıldız kuyruğundaki göreceli DNA miktarı, kuyruklu yıldız kafasıyla karşılaştırıldığında DNA hasarının miktarıyla doğru orantılıdır; Kuyruktaki DNA içeriği genellikle dijital görüntüleme yazılımı kullanılarak ölçülür.
Kuyruklu yıldız testi parçalanmış DNA'yı algıladığı için, maruziyete bağlı DNA hasarının doğru niceliği, tedaviye bağlı sitotoksisite veya stresten kaynaklanan nekroz veya apoptozla ilişkili kromatin parçalanması yla şaşırtılabilir. Ayrıca, DNA hasarı mekanik kesme veya yanlış numuneişleme4 sonucu oluşabilir. Dna hasarının temel düzeyini en aza indirmek için slayt hazırlama öncesinde soğutulmuş hasat doku bakımının önemi daha önce gösterilmiştir5,6. Birçok laboratuvar taze dokudan kuyruklu yıldız adaçayı slaytları hazırlar; ancak, bu çok sayıda hayvan ile yapılan bir çalışmada hayvan başına birden fazla doku türünden slaytlar hazırlarken lojistik zor olabilir. Ayrıca, bu durum, uzak bir laboratuvarda slayt hazırlama ve analizlerin yapılacağı ve numunelerin sevkiyatının gerekli olduğu bir sorun teşkil ediyor. Örneğin, ABD Ulusal Toksikoloji Programı, genetik toksikoloji test programının bir bileşeni olarak kuyruklu yıldız tökezlemeyi içerir (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) ve bazen 28 veya 90 gün tekrar doz toksisite çalışmaları içine test içerir; bu, dokuların yaşam içi laboratuvar tarafından toplanmasını ve numunelerin analiz için başka bir laboratuvara aktarılmasını gerektirir. Bunu başarmak için, doku parçaları kıyılmış ve / veya gastrointestinal sistem epitel hücreleri kazınmış ve hücresel süspansiyonlar dondurulmuş ve analiz7kadar alıcı laboratuvar tarafından sonraki sevkiyat ve depolama için bir dondurucuda saklanır . Numunelerin doğru şekilde işlenmesi, dondurulmuş doku kullanılarak yüksek kaliteli veri elde edilmesi için çok önemlidir; ancak, sürekli değişen personel tarafından gerçekleştirilen nekropsiler sırasında doku örneklerinin tekrarlanabilir manipülasyonu kontrol etmek zordur, özellikle kuyruklu yıldız tayı için rutin olarak doku hasat olmayan yaşam laboratuvarlarında. Nekropsi personelinin tazelemesi eğitimi veya deneyimli laboratuvar personeli tarafından taze veya dondurulmuş doku örnekleri toplamak için personele ait bir mobil ünitenin kullanımı genellikle çok maliyetlidir, mümkün değildir veya sadece küçümsenmez.
Kuyruklu yıldız tahlil analizi için uzak bir bölgeye transfer için yüksek kaliteli doku örnekleritutarlı nesil sağlamak için, doku flash dondurulmuş küpleri doku koruma yayınlanan bir yöntem6 programı araştırıldı. Bu yöntemde, dondurulmuş doku küpleri, soğuk tampon içeren bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirilen paslanmaz çelik doku kıyma cihazına(Şekil 1)yüklenir. Doku küpü daha sonra cihazın sonunda küçük bir ölçer örgü ile itilir. Tekrar tekrar her iki yönde de örgü elek yoluyla doku süspansiyon zorlayarak nispeten düzgün tek hücreli süspansiyon ile sonuçlanır. Bu yöntemle hazırlanan numuneler, kalite olarak hem taze hem de dondurulmuş doku örnekleri ile karşılaştırıldı. Ek bir yararı olarak, kıyma örnekleri aksine, doku küpleri uzun süre dondurulmuş saklanabilir ve hala kuyruklu yıldız tahsini yüksek kaliteli sonuçlar verim.

<table><tbody><tr><td>Cryovials</td><td>Corning Costar</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>Dental Wax Levhalar Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>72670</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon (Kıyma) Mikro Makas</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-953-1B</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi</td><td>Gibco</td><td>14175-079</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Teknova</td><td>P0315-10</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Düşük Erime Noktalı Agaroz</td><td>Lonza</td><td>50081</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofüj Tüpleri (1.7 mL)</td><td>Corning</td><td>3207</td><td></td></tr><tr><td>Na2EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Na2 HPO4</sub</td><td>>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>Nötr Tamponlu Formalin</td><td>Leica</td><td>600</td><td></td></tr><tr><td>Neşter Bıçakları</td><td>Miltex</td><td>4-110</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga Pistonu (1 mL)</td><td>Fisher Scientific veya Vitality Medical</td><td>14-826-88; 8881901014</td><td>Becton Dickinson veya Monoject tüberkülin şırıngası</td></tr><tr><td>Doku Kıyma Cihazı</td><td>NorGenoTech (Oslo, Norveç)</td><td>Yok Pistonun</td><td>sıkılığını etkileyebilecek çapta küçük bir değişkenlik gözlendi.</td></tr><tr><td>Cımbız, plastik</td><td>Ticaret Rüzgarları Doğrudan</td><td>DF8088N</td><td>Takviyeli naylon, steril olmayan, künt uçlu, otoklavlanabilir; tradewindsdirect.com</td></tr><tr><td>Tartı Tekneleri</td><td>Krackler Scientific/Heathrow Scientific</td><td>6290-14251B</td><td></td></tr></tbody></table>

dna hasarının değerlendirilmesinde kuyruklu yıldız testinde donmuş dokunun kullanımı

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

Kuyruklu yıldız tsay, özellikle kimyasallara veya diğer çevresel strese maruz kaldıktan sonra, kültürlü hücre ve dokularda DNA hasarını değerlendirmek için bir araç olarak popülerlik kazanıyor. Kemirgenlerdeki genotoksik potansiyel için yapılan düzenleyici testlerde kuyruklu yıldız titrelerinin kullanımı, 2014 yılında Ekonomik İşbirliği ve Kalkınma Örgütü (OECD) test kılavuzunun benimsenmesi ile yürütülmüştür. Kuyruklu yıldız asa slaytları genellikle nekropsi sırasında taze dokudan hazırlanır; ancak, dondurucu doku örnekleri hayvan başına birden fazla organdan ve çalışma başına birçok hayvandan slaytların eşzamanlı hazırlanması ile ilişkili lojistik zorlukları önleyebilir. Donma aynı zamanda maruz kalma tesisinden analiz için farklı bir laboratuvara numune lerin sevkiyatını sağlar ve dondurulmuş dokunun depolanması, belirli bir organ için DNA hasar verileri oluşturma kararının ertelenmesini kolaylaştırır. Alkali kuyruklu yıldız testi, pozlamaya bağlı DNA çift ve tek iplikçikli kırıkları, alkali-labile lezyonlarını ve eksik DNA eksizyonu onarımı ile ilişkili iplikçik kırıklarını tespit etmek için yararlıdır. Ancak, DNA hasarı da mekanik kesme veya yanlış numune işleme prosedürleri, tahsin sonuçları kafa karıştırıcı neden olabilir. Nekropsiler sırasında doku örneklerinin toplanması ve işlenmesinde tekrarlanabilirlik, kuyruklu yıldız tadına göre dokuların hasat edilmesinde farklı düzeyde deneyime sahip laboratuvar personelinin dalgalanması nedeniyle kontrol edilmesi zor olabilir. Deneyimli laboratuvar personeliyle çalışan tazeleme eğitimi veya mobil ünitelerin konuşlandırılması yoluyla tutarlılığın artırılması maliyetlidir ve her zaman mümkün olmayabilir. Kuyruklu yıldız tahlil analizi için yüksek kaliteli örneklerin tutarlı nesil optimize etmek için, özelleştirilmiş doku kıyma cihazı kullanarak doku flaş dondurulmuş küpleri homojenleştirme için bir yöntem değerlendirildi. Bu yöntemle kuyruklu yıldız tadına göre hazırlanan numuneler, nekropsi sırasında kıyma ile hazırlanan taze ve dondurulmuş doku örnekleriile kalite açısından olumlu karşılaştırılabı. Ayrıca, uzun süreli depolandıktan sonra dondurulmuş doku küplerinden hücrelerde düşük bazsatır DNA hasarı ölçüldü.

Çalışma 1 Karaciğer erkek Sprague Dawley sıçanlar iki kohorthas hasat edildi 4 gün boyunca mısır yağı uygulanan, bir hafta ile sendeledi. Slaytlar taze kıyılmış doku, dondurulmuş kıyma doku ve dondurulmuş küp doku Merchant'S orta veya kıyma çözeltisi doku kıyma cihazı kullanılarak işlenmiş hazırlanmıştır. İlk kohorttan hayvanlardan elde edilen dondurulmuş dokular yaklaşık 3,5 ay boyunca dondurucu muhafazasından sonra değerlendirildi. İkinci kohorttan hayvanlardan elde edilen dondurulmuş dokular yaklaş...

Bu protokol, DNA hasarı değerlendirmek için kuyruklu yıldız testinde kullanılmak üzere nekropsi sırasında yüksek kaliteli dondurulmuş doku örnekleri hazırlamak için çeşitli prosedürler açıklar: 1) kıyılmış doku, 2) gastrointestinal sistemden kazınmış epitel hücreleri, ve 3) küp doku bir doku kıyma cihazı kullanarak homojenizasyon gerektiren örnekler.

DNA Hasarının Değerlendirilmesinde Kuyruklu Yıldız Testinde Donmuş Dokunun Kullanımı

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...

Bu protokol önemlidir, çünkü dondurulmuş doku kullanımı birden fazla doku değerlendirilirken lojistiği kolaylaştırır, analiz için uzak bir laboratuvara numune transferine izin verir ve bir dokuyu aylarca analiz etme kararının ertelenmesini sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, dondurulmuş küp dokusunun nekropsi de kuyruklu yıldız testinde eğitilmiş personel gerektirmemesi ve numune manipülasyonu sırasında ortaya çıkan teknik hatalar ve mekanik DNA hasarı için fırsatı en aza indirmesidir. Bu teknik, klinik öncesi ilaç geliştirme, çevreye giren kimyasalların güvenlik değerlendirmesi ve gıda katkı maddeleri uygulamasına sahiptir.Dondurulmuş dokular, kuyruklu yıldız testinde genotoksik potansiyeli, DNA onarımı, kemoterapi veya radyasyonun neden olduğu DNA hasarına karşı koruyucu etkiler ve çevresel biyo-izleme için kullanılabilir. İdeal olarak, deneyler bir sonraki hayvandan alınan organlar işleme için kullanılabilir hale gelmeden önce dondurucu adıma her doku örneğinin işlenmesine izin vermek için tasarlanmalıdır. Dondurulmuş dokular, genotoksik potansiyeli, DNA onarımı, kemoterapi veya radyasyonun neden olduğu DNA hasarına karşı koruyucu etkiler ve çevresel biyo-izleme için kuyruklu yıldız testinde dava edilebilir.Teknik eğitmen Carole Bobbitt ve araştırmacı toksikoloji laboratuvar yöneticisi Eileen Gilas bugün prosectors olarak hizmet verecek. Araştırma görevlisi Lincoln Martin ve histoloji teknisyeni Amelie Ladesseur örnek işleme sergileyecekler. Bu prosedürü başlatmak için, herhangi bir bağlı bağlı doku kaldırmak, organlar, ve enkaz ilgi bir organdan.Hemen kalıntı kan ve enkaz kaldırmak için soğuk, taze hazırlanmış kıyma çözeltisi yaklaşık yedi mililitre içeren orta büyüklükte tartmak teknede şiddetle organ swish. Başka bir temiz tartma tekne doku batık tutmak ve daha fazla işleme kadar buz üzerinde tutmak için yeterli soğuk kıyma solüsyonu içeren için organ aktarın. Karaciğer için, sol lob beş milimetre uzunlamasına bir bölümünü kesti ve yavaşça soğuk kıyma çözeltisi yaklaşık yedi mililitre swish.Daha sonra temiz bir orta boy tartmak tekne içine doku şerit yerleştirin soğuk kıyma çözeltisi yaklaşık yedi mililitre içeren ve daha fazla işlemeye hazır olana kadar buz üzerinde korumak. Karaciğerin bir bölümünü çıkarın ve bir gömme kaset içine yerleştirin. Gelecekteki histopatoloji değerlendirmesi için laboratuvar standart prosedürlerine göre sabitleme, budama ve parafin katıştırma işlemlerini gerçekleştirin.Duodenum için, mideye duodenum proksimal 10 milimetrelik bir kısmını kesti. Duodenumun bir ucuna 21 ila 25 gauge iğne yerleştirin ve herhangi bir enkaz ve bakteri kaldırmak için soğuk kıyma çözeltisi bir mililitre ile floş. Duodenumu ters çevirin, bir mililitre kıyma çözeltisi ile tekrar temizle ve iğneyi atın.Duodenumu açın ve yaklaşık yedi mililitre kıyma çözeltisinde durulayın. Daha sonra duodenumu tekrar durulayın ve daha fazla işlemeye hazır olana kadar buz üzerinde kıyma çözeltisinde saklayın. Daha önce karaciğer için açıklandığı gibi gelecekteki histopatoloji değerlendirmesi için kalan duodenumun bir kısmını kesin ve onarın.Beyin için, ilk iki yarımküreye beyin bölmek için yararlı olabilir, bir yarımküre olası histopatoloji için kaydedilmiş olan. İlgi beyin bölgeleri incelemek, sonra yavaşça durulayın, ve daha fazla işlemeye hazır olana kadar kıyma çözeltisi buz üzerinde korumak, karaciğer ve duodenum için daha önce açıklandığı gibi. Mide için, kaldırmak ve önmide atın.Glandüler mideyi kesin ve yaklaşık yedi mililitre soğuk kıyma tamponu içeren orta boy bir tartı teknesinde swishing tarafından gıda ücretsiz yıkayın. Daha önce açıklandığı gibi olası histopatoloji değerlendirmesi için fiksasyon için duodenuma beş milimetrelik salgı bezi mide proksimal şeridi çıkarın. Kalan mideyi yaklaşık yedi mililitre soğuk kıyma tamponu içeren orta boy bir tartı teknesine yerleştirin ve 15 ila 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.Bundan sonra, parafin temiz bir parça mide aktarın ve hafifçe enkaz kaldırmak için en az iki kez yüzey epitel kazımak için bir neşter bıçak veya plastik hücre kazıyıcı kullanın. Forceps ile mide mukozası almak ve soğuk kıyma tampon bir mililitre ile durulamak için bir pipet kullanın. Durulanan mide dokusunu temiz bir yüzeye veya tabağa aktarın ve soğuk kıyma solüsyonu ekleyin.Hücreleri serbest bırakmak için mide epitelini 4-5 kez dikkatlice kazımak için neşter bıçağının veya plastik bir hücre kazıyıcının arkasını kullanın. Daha sonra, serbest bırakılan hücreleri içeren kıyma çözeltisi toplamak için bir pipet kullanın ve buz üzerinde bir mikrosantrifüj tüpü ne aktarın. Doku örnekleri kıyma için, karaciğer, beyin veya duodenum bir bölümünü kesmek ve soğuk kıyma çözeltisi bir mililitre içeren etiketli bir mikrosantrifüj tüp aktarın.Numunenin soğuk kalmasını sağlarken, numunenin sonunda dağılına kadar hızlı bir şekilde kıyma yapmak için kıyma makasını kullanın. Örnek biraz bulutlu görünmelidir. Ancak, tüpün altına yerleşecek bazı parçaların kalması yaygındır.Bu taze iken doku kullanmak için, buz üzerinde örnekleri içeren tüpler imuhafaza. Doku örneklerini dondurmak için, kıyma veya toplama hemen sonra tüpün kapağını sabitleyin ve tüp sıvı nitrojen içeren bir Dewar şişesine bırakın. Doku hasat sonunda, örnek tüpleralmak için bir kepçe kullanın ve sıralamak için kuru buz üzerine yerleştirin.Tüpleri kuru buz üzerindeki bir dondurucu kutusuna aktarın ve kutuyu eksi 80 derecede bir dondurucuda saklayın. Doku dondurulmuş küpler hazırlamak için, doku birkaç küçük parçalar kesilmiş ve tek tek bir orta ölçekli tartmak tekne veya birkaç saniye için sıvı nitrojen içeren diğer uygun gemi içine doğrudan bırakın. Parçalar tamamen donduktan sonra, dondurulmuş doku küplerini tek tek etiketli mikrosantrifüj tüplere veya kriyo-tüplere kuru buza aktarın.Doku hasadı sonunda, tüpleri kuru buz üzerindeki bir dondurucu kutusuna aktarın ve kutuyu eksi 800 santigrat derecede bir dondurucuda saklayın. Isliç buz üzerinde muhafaza taze kıyılmış veya kazınmış doku kullanırken, hasat bir saat içinde kuyruklu yıldız slaytlar hazırlamak. Dondurulmuş kıyma veya kazınmış doku kullanırken, numuneler tamamen çözülene kadar dondurulmuş doku tüplerini oda sıcaklığında bir su banyosuna yerleştirin ve soğuk tutulmalarını sağlar.Örnekler çözüldükten sonra tüpleri hemen buza aktarın. Küplenmiş doku için, dondurucudan küpleri içeren tüpleri alın ve slayt hazırlanına kadar kuru buzüzerinde muhafaza edin. Aliquot tüccar ın orta veya bir kıyma çözeltisi bir mililitre etiketli içine 1.7 mililitre mikrosantrifüj tüp her örnek için ve buz üzerinde korumak.Erimeönlemek için hızla çalışma, bir oda sıcaklığında doku kıyma cihazının açık sonuna doku bir küp yerleştirin. Hızlı bir şekilde cihaza bir boyut eşleşen şırınga dalgıç eklemek daha sonra soğuk kıyma çözeltisi içeren mikrocentrifuge tüp içine yerleştirilmelidir örgü ucuna doku itmek için. Dokunun tamamen erimesini sağlamak için cihazın örgü ucunu soğuk kıyma çözeltisinde yaklaşık 5 ila 10 saniye batırın.Hücreler örgü gözenekleri ile ekstrüzyon görülene kadar tamamen piston depress. Daha sonra pistiyi yaklaşık 2,5 santimetre yukarı çekin ve tekrar tamamen bastırın. Kıyma çözeltisi bulanık hale gelene kadar birkaç kez tekrarlayın.Slaythazırlamak için, bir hücre süspansiyonuna nazikçe karıştırın ve 50 mikrolitreyi %0,5 düşük erime noktası içeren bir tüpe aktarın. Slaytları metin protokolünde belirtildiği şekilde hazırlayın ve puanlayın. İlk çalışmada, karaciğer erkek Sprague Dawley araç kontrol sıçanlar iki kohortbir hafta tarafından sendeledi hasat edildi.Slaytlar taze kıyılmış doku, dondurulmuş kıyma doku ve dondurulmuş küp doku hazırlandı. OECD taze sıçan karaciğerinde yüzde kuyruk DNA'sı için önerilen üst sınır %6 olduğundan, bu sonuçlar donma yöntemlerinin doku ları değerlendirmek için iyi iş çıkarabileceğini göstermektedir. Genel olarak, yüzde kirpiyüzde kuyruk DNA paralel, dondurulmuş dokular daha fazla değişkenlik sergiledi rağmen.İkinci çalışmada, dişi B6C3F1 farelere araç veya mutajen etil metansülfonat uygulandı. Yüzde kuyruk DNA sonuçları karaciğer dokusu küpler olarak dondurulmuş ve daha sonra doku kıyma cihazı kullanılarak işlenmiş çok taze kıyılmış doku için elde edilen sonuçlar ait olduğunu göstermektedir. Her üç yöntemle işlenen doku örneklerinde EMS kaynaklı DNA hasarında istatistiksel olarak anlamlı bir artış ölçüldü.Üçüncü çalışmada, 90 günlük kimyasal toksisite çalışmasında dişi B6C3F1 farelerinden alınan karaciğer örnekleri analiz edildi. Dondurulmuş kıyma dokusundaki DNA hasarı tüm doz gruplarında yüksekti ve hayvan değişkenliğine kadar önemli bir hayvanvardı. Yüzde kuyruk DNA sonuçları kirpilerin yüzde kirpilerle ilişkili olduğunu gösteriyor, bu da kirpilerin bu örneklerde gözlenen yüksek DNA hasarına önemli ölçüde katkıda bulunduğunu gösteriyor.Buna karşılık, hem DNA hasarlı ve yüzde kirpi kıyma doku örnekleri paralel olarak hazırlanmış flaş dondurulmuş küp doku çok düşüktü. Böylece, kıyma doku örneklerinde kirpi olarak kendini gösteren yüksek hasarlı hücreler biyolojik bir sürecin sonucu değildi, ancak büyük olasılıkla mekanik bozulma ile tanıtıldı, ve, ya da dondurulmadan önce kıyma işlemi sırasında doku ısınması. Bu nedenle, kıyma doku için veri güvenilmez olarak kabul edildi.Buna karşılık, uzun süreli depolama sonra bile, dondurulmuş küp doku dan yüksek kaliteli veri elde edildi. Hasat edilen dokuları soğuk ve nemli tutmak ve numuneleri dondurmak için hızlı bir şekilde çalışmak çok önemlidir. Ayrıca, dondurulmuş küp doku homojenizasyon adımı hemen önce çözülmüş olmalıdır.Dondurulmuş doku örnekleri oksidatif hasarı veya çapraz bağlanmayı saptamak için kuyruklu yıldız testinin modifikasyonları ve gen ekspresyonundaki değişikliklerin değerlendirilmesi gibi diğer downstream uygulamaları için uygundur. Dokuları kesmek veya kazımak için neşter bıçaklarını kullanırken ve donma işlemi sırasında sıvı nitrojeni kullanırken dikkatli olunmalıdır.

use-frozen-tissue-comet-assay-for-evaluation-dna

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Video, zararlı ajanlara maruz kaldıktan sonra DNA hasarını tespit etmek için kuyruklu yıldız testini göstermektedir. Alkali koşullar altında, DNA gevşer ve denatüre olur ve elektroforez üzerine, hasar görmemiş ve hasar görmüş DNA, agaroz jeli içinde farklı şekilde göç ederek kuyruklu yıldız şeklinde bir yapı oluşturur. Yavaş göç eden hasarsız DNA, dairesel kuyruklu yıldız kafasını oluştururken, hızla göç eden hasarlı DNA parçaları, uzun kuyruklu yıldız kuyruğunu oluşturur.

Hücrelerde DNA Hasarı Tespiti için Comet Deneyi

Comet assay alkali labil siteleri ve hipokampal nöronlar da dahil olmak üzere tüm hücrelerde DNA üzerinde DNA-DNA/DNA-protein çapraz bağlantılar dahil tek ve çift zincir kırıkları, tespit etmenin en etkin yoludur. Yöntem DNA hasar miktarının farklılıklara bağlı olarak, bir elektrik alanı içinde DNA diferansiyel göç yararlanır.

Comet Assay kullanma Hipokampal Nöronlar DNA Hasarı assaying

Biz burada görülmemiş verimlilik ile DNA hasarı kuyrukluyıldız tahlil tespiti sağlayan bir platform açıklar. Cihaz desenler mikroarreylerinin içine memeli hücreleri ve 96 örneklerinin paralel işleme sağlar. Yaklaşımı temel düzeyde DNA hasarı, pozlama kaynaklı DNA hasarı ve DNA onarım kinetik analizini kolaylaştırır.

CometChip: İnsan Microarrayed hücrelerde DNA hasarına ölçülmesi için bir Yüksek verim 96 Oyuklu Platformu

Comet tahlil farklı faktörler tarafından uyarılan DNA kırılmaları, ölçer. DNA hasarına yol açan (oksidatif stres hariç) tüm faktörler sabit tutulması durumunda, DNA hasar miktarı oksidatif strese iyi bir dolaylı bir parametredir. Bu protokolün amacı, oksidatif stresin dolaylı ölçümü için kuyruklu yıldız tahlil kullanmaktır.

Sistemik Oksidatif Stresin bir Dolaylı Tedbir olarak Comet Assay

Kuyruklu yıldız tahlil tek ve çift iplikçikli DNA içeren DNA hasarı tatili algılamak için verimli bir yöntemdir. Kemoterapi tedavi edici etkisini değerlendirmek için kanser hücrelerinin DNA hasarı ölçmek için alkali ve tarafsız kuyruklu yıldız deneyleri tarif.

Vitro DNA hasarı kuyruklu yıldız tahlil kullanarak değerlendirmek

Kuyruklu yıldız tahlili, DNA hasarını tespit etmenin popüler bir yoludur. Bu çalışma, kuyruklu yıldız testinin temsili varyantlarında slaytları çalıştırmaya yönelik bir yaklaşımı açıklamaktadır. Bu yaklaşım, numune sayısını önemli ölçüde artırırken, tahlil çalışma süresini, slayt manipülasyonlarının sayısını ve jellere zarar verme riskini azalttı.

Hücresel DNA Hasarını Değerlendirmek için Yüksek Verimli Bir Kuyruklu Yıldız Testi Yaklaşımı

Bu protokol, kuyruklu yıldız tahlilinin uygulanması yoluyla FLT3 mutant hücrelerinde tip I ve tip II inhibitörlerin neden olduğu DNA hasarındaki farkı ölçmek için etkili bir yöntemi açıklamaktadır.

Tip I ve Tip II FLT3 İnhibitörlerine Maruz Kaldıktan Sonra FLT3 Mutant Eksprese Eden 32D Hücrelerde DNA Hasarını Ölçmek için Kuyruklu Yıldız Testi

Hedeflenen DNA hasarı, DNA'ya zarar veren bir ajanın tripleks oluşturan bir oligonükleotite (TFO) bağlanmasıyla elde edilebilir. Modifiye TFO'lar kullanılarak, DNA hasarına özgü protein ilişkisi ve DNA topolojisi modifikasyonu, burada açıklanan modifiye kromatin immünopresipitasyon testleri ve DNA süper sarma testlerinin kullanılmasıyla insan hücrelerinde incelenebilir.

Araçlar Helix bozan, site-spesifik DNA içi çapraz bağlantılar işlenmesi Mimari Protein HMGB1 Rolü Eğitim için

Bu protokol lazer microirradiation DNA hasar, nispeten basit kırılmalara ve DNA hasar sinyal ve onarım faktör montaj hasar sitelerde içinde vivo çalışmaya karmaşık hasarı gibi farklı türde ikna etmek için nasıl kullanılacağını açıklamak için hedeftir .

Vivo hücresel yanıt-e doğru basit ve karmaşık DNA hasarı incelemek için lazer Microirradiation

Bu makalede, DNA izolasyon ve yüksek işlem hacmi sıralama kitaplığı inşaat sulak malzeme son derece kalitesiz DNA'ın kurtarma dahil olmak üzere ayrıntılı bir protokol gösterilir.

Sağlam DNA izolasyon ve yüksek işlem hacmi sıralama kitaplığı inşaat sulak numuneler için

Öğrenin, kuyruklu yıldız testinde donmuş doku örneklerinin hazırlanması ve DNA hasarının değerlendirilmesi yöntemini. Bu teknik, genotoksisite araştırmalarında lojistik kolaylık sağlar ve örnek bütünlüğünü korur.

DNA Hasarının Değerlendirilmesinde Kuyruklu Yıldız Testinde Donmuş Dokunun Kullanımı

Daha fazla video keşfet