Pirinç Bir TILLING Popülasyonyüksek Çözünürlükte Erime mutasyonları belirlenmesi
2 Eylül 2019
Bu makalede, Genomlarda Yüksek Çözünürlüklü Erime Analizi (HRM) tabanlı Hedef Kaynaklı Lokal Lezyonlar (TILLING) olarak tanımlanan protokolü satılmaktadır. Bu yöntem, DNA dupleksinin erimesi sırasında floresan değişikliklerini kullanır ve hem ekleme/silme (Indel) hem de tek baz ikamesi (SBS) yüksek işlem li tarama için uygundur.
Teknik olarak zor veya maliyetli olan hastalık direnci, mineral içeriği gibi belirlenmesi zor veya maliyetli olan ıslah özellikleri için oldukça yararlı olacaktır. Oldukça basit, uygun maliyetli ve yüksek iş yapma tekniğidir. Başlamak için, 96 kuyulu BIR PCR plakanın her kuyuya dört yapraklı disk yerleştirin.
Her kuyuya 50 mililitre arabellek bir çözüm ekleyin. Tabağı eksi 80 derecelik dondurucuda 10 dakika dondurun. Daha sonra, oda sıcaklığında tabağı defreeze.
95 derecede 10 dakika kuluçkaya yat. Her kuyuya 50 mikrolitre tampon B ekleyin ve girdap yaparak iyice karıştırın. 1, 500 kez g bir dakika için plaka santrifüj.
PCR için DNA olarak supernatant toplamak. İlk olarak, dna supernatant yanı sıra PCR şablonu annealing sıcaklığı optimize etmek için kullanın. Her PCR kuyusuna reaktifler ve bir mikrolitre DNA süpernatant ekleyin.
PCR tüplerini degrade özellikli bir termal blota yerleştirin ve her hedef parça için en uygun tavlama sıcaklığını belirlemek için ısıtma programını el yazmasına göre ayarlayın. Amperonları incelemek için PCR ürünü için %1 agarose jelüzerinde elektroforez yapın. Hedef parçanın özel amplifikasyonuna olanak tanıyan en uygun tavlama sıcaklığını belirleyin.
HRM analizini gerçekleştirmek için, hrm uyumlu plakaların her kuyusunda 10 kez floresan boyanın bir mikrolitresi ve bir mikrolitre DNA süpernatantı dahil olmak üzere reaktifleri birleştirir. Her plaka, bir vahşi tip ebeveynli örnek ve DNA olmadan bir negatif kontrol içerir. Buharlaşmayı önlemek için her kuyuya bir damla mineral yağ ekleyin.
Daha sonra plakayı yapışkan filmle kapatın ve 1000 kez g'de bir dakika santrifüj edin. PcR'yi optimize edilmiş annealing sıcaklığını kullanarak çalıştırın. Şimdi, yapışkan filmi plakadan çıkarın ve plakayı bir HRM makinesine takın.
Yazılımda, dosya menüsünden Yeni Çalıştır'ı seçin veya ekranın üst kısmındaki Çalıştır düğmesine basın. Erimenin başlangıç ve bitiş sıcaklıklarını 55 ila 95 santigrat derece ye belirtin. Yüksek çözünürlüklü erime çözümlemesi için örnekleri seçin ve negatif denetime benzer örnekleri hariç tayın.
Aynı başlangıç ve floresan biten için erime eğrileri normalleştirin. Alt minimum ve daha düşük maksimum sıcaklık imleçlerinin eğrilerin bir bölgesinde olduğunu görsel olarak doğrulayın. Delta F,floresan farkı, 05 varsayılan ayarında düzeyi tutun.
Standartlar seçim listesinden, ortak karşı varyantı seçin ve normal duyarlılığı seçin. Denetim olarak vahşi türünü kullanmak için H12'yi seçin. Delta F değeri 05'ten büyük olan numuneler mutant bitki içerdiği kabul edilir.
Daha sonra, bir CTAB yöntemi kullanarak, erime eğrisi vahşi tip önemli ölçüde farklı mutant havuzundan dört bitkilerin her birinden DNA ayıklayın. Bir spektrofotometre kullanılarak sayısallaştırmadan sonra, NanoDrop 2000 ile DNA'yı mikrolitre başına yaklaşık 25 nanogramlık son konsantrasyona ayarlayın. PCR tüplerdeki DNA örneğine 0,4 mikrolitre PCR astar ekleyin, termal bir döngüye yerleştirin ve hedef parçayı yükseltmek için programı ayarlayın.
Ardından, PCR ürünlerini sıralama için bir şirkete gönderin. Sanger diziliminden sonra, M2 bitkisi ile yabani tip arasındaki dizileri karşılaştırarak moleküler lezyonu karşılaştırın. Bu çalışmada, OSLCT1 veya SPDT genlerinde mutasyonlar için M2 fidelerinin hrm taraması ve analizi, örneklerin çoğunun 05'ten az delta F ile yabani tipten önemli ölçüde farklı olmayan erime eğrileri olduğunu göstermiştir.
Mutantlar delta Fs 05'ten büyük 90 ila 92 santigrat derece ve 81,5 ila 83,5 santigrat derece sıcaklıklarda, sırasıyla önemli ölçüde farklı HRM eğrileri gösterdi. 4, 560 M2 fidesinin genlerdeki mutasyon tipi ve pozisyonu sıralanan kromatogramlar tarafından doğrulandı. 4'te G ile A mutasyonu olan heterozigot bir bölge, OsLCT1'in 304 baz çifti saptandı.
Tek nükleotid OsLCT1'in 4, 240 baz çiftinde bir nükleotit insersiyon, 5, 948-5, 950 baz spdt baz çifti pozisyonunda TTC trinükleotid delesiyonu gözlendi. HRM analizinden önce PCR'yi optimize ediyorum. Jel boya biraz zararlıdır.
Jeli çalıştırırken eldiven giymeyi unutmayın.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, yüksek çözünürlüklü erime analizi (HRM) tabanlı Genomlarda Hedefe Yönelik Yerel Lezyonlar Oluşturma (TILLING) için bir protokol sunmaktadır. Bu yöntem, insersiyon/delesyon (Indel) ve tek baz sübstitüsyon (SBS) mutasyonlarının yüksek kapasiteli taranmasında etkilidir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Genomik
- Bitki Islahı
- Moleküler Biyoloji
Arka Plan
- Yüksek çözünürlüklü erime analizi, genetik varyasyonları tespit etmek için kullanılan bir tekniktir.
- TILLING, mutasyonların maliyet etkin bir şekilde tanımlanmasına olanak tanır.
- Bu yöntem, değerlendirilmesi zor olan özellikler için özellikle kullanışlıdır.
- Tarım ve genetik dahil olmak üzere çeşitli alanlarda uygulanabilir.
Çalışmanın Amacı
- TILLING'de HRM kullanımı için bir protokol sağlamak.
- Genetik varyasyonların yüksek kapasiteli taramasını kolaylaştırmak.
- Önemli özelliklerle ilişkili mutasyonların tanımlanma verimliliğini artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- 96 kuyucuklu PCR plakasına yaprak disklerinin hazırlanması.
- Her kuyucuğa tampon A çözeltisinin uygulanması.
- Numuneleri hazırlamak için PCR plakasının dondurulması ve çözdürülmesi.
- DNA erimesi sırasındaki floresans değişimlerinin izlenmesi.
Ana Sonuçlar
- Protokol, Indel'lerin ve SBS'lerin etkili bir şekilde tespit edilmesine olanak tanır.
- Yüksek veri üretim kapasitesi, tarama verimliliğini artırır.
- Çeşitli araştırma uygulamaları için uygun, maliyet etkin bir yöntemdir.
- Hastalık direnci gibi özellikler için ıslah çalışmalarını kolaylaştırır.
Sonuçlar
- HRM tabanlı TILLING, genetik araştırmalarda değerli bir araçtır.
- Bu yöntem, mutasyonların tanımlanma sürecini kolaylaştırır.
- Geliştirilmiş bitki çeşitlerinin geliştirilmesine önemli ölçüde yardımcı olabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Yüksek çözünürlüklü erime (HRM) tabanlı TILLING, bitki genomlarındaki hem tek baz değişimlerinin hem de insersiyon/delesyon mutasyonlarının yüksek kapasiteli ve düşük maliyetli bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Bu yaklaşım, hastalık direnci ve besin içeriği gibi karmaşık özelliklere yönelik ıslah kararlarına temel oluşturan kantitatif mutasyon tarama verileri sunarak, erken aşama hedef doğrulamayı destekler. Basit DNA ekstraksiyonu ile entegrasyonu, keşif hatlarındaki iş akışı verimliliğini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: OsLCT1 ve SPDT gibi hedef genlerde indüklenen mutasyonların tespiti yoluyla terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: PCR sonrası ek işlem gerektirmeyen HRM analizini kullanarak uygulamalı süreyi azaltır ve işlem hacmini artırır.
- Tahminleyici Değer: 0,5'in üzerindeki Delta F değerleri mutant örnekleri belirleyerek, sonraki doğrulama aşamaları için güvenilir hit seçimine destek sağlar.
Tarama ve Deney Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Mineral yağ tabakalı HRM uyumlu plakalar, buharlaşmayı önler ve tekrarlanabilir erime eğrisi elde edilmesini sağlar.
- Kantitatif Çıktı: Normalize edilmiş erime eğrileri ve delta F ölçümleri, vahşi tip ile varyant örnekler arasında objektif karşılaştırma yapılmasına olanak tanır.
- Ölçeklenebilirlik: 96 kuyucuklu plaka formatı, 4.560 örnekle gösterildiği üzere, binlerce M2 fidesinin taranmasına imkan verir.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Sanger dizileme ile doğrulanmış mutasyonlar, ıslah programlarında genotipi fenotipe bağlayan moleküler lezyon verileri sağlar.
- Biyobelirteç Hizalaması: Tanımlanan SNP'ler ve indel'ler, ürün iyileştirme çalışmalarında özellik ilişkisi için saptanabilir belirteçler olarak hizmet eder.
- Risk Azaltma: Erken mutasyon saptaması, saha denemelerinden önce özellik kalıtımıyla ilgili belirsizliği azaltır.
Hat ve İş Akışı Entegrasyonu
HRM-TILLING, mutajenez sonrası ve fenotipik doğrulama öncesinde mutasyon taramasına olanak tanıyarak, tarımsal biyoteknolojide öncü adayların belirlenmesini destekler ve böylece keşiften preklinik aşamaya kadar olan sürece entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Hassas erime eğrisi analizi yoluyla hedef genlerdeki alelik varyantları belirleyerek hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Büyük popülasyonlarda mutasyon tespitini standartlaştıran, tekrarlanabilir ve kantitatif HRM çıktıları sağlar.
- Analizler: Delta F eşik değeri (>0.5), mutant örnekleri yabanı tip örneklerden ayırt etmek için istatistiksel bir temel sunar.
- Translasyonel Araştırma: Dizileme ile doğrulanmış mutasyonlar, özellik bağlantılı ıslah kararları için genotip-fenotip haritalamasına olanak tanır.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Protokol, pirinç dışındaki farklı gen hedeflerine ve ürün türlerine uyarlanabilir olduğundan platformun yeniden kullanımını teşvik eder.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hem SNP'leri hem de indel'leri yüksek hassasiyetle tespit ederek mutasyon taramalarındaki yanlış negatifleri azaltır.
- Operasyonel Değer: HRM ile birleştirilmiş basit, güvenli ve hızlı (SSF) DNA ekstraksiyonu, reaktif kullanımını ve ekipman gereksinimlerini minimize eder.
- Stratejik Değer: Faydalı allelik varyantları hızla tanımlayarak ıslah programlarında daha hızlı karar verme süreçlerini mümkün kılar.
- Portföy Etkisi: Doğrulanmış mutasyonlara sahip hatların geliştirilmesine yönelik güveni artırarak geç aşama başarısızlık riskini azaltır.
Uygulama Hususları
- HRM cihaz kurulumu ve erime eğrisi normalizasyonu konusunda bilgi sahibi olmayı gerektirir.
- Bağlanma sıcaklığı optimizasyonu için gradyan termal döngüleyiciye erişim gereklidir.
- Hassas erime analizi için HRM uyumlu plaklara ve floresan boyalara bağımlıdır.
- HRM ile belirlenen mutasyonların doğrulanması için sekanslama kapasitesi gerektirir.
- Performans, amplikon uzunluğuna ve GC içeriğine göre değişiklik gösterebilir; bu durum hedefe özgü optimizasyonu gerektirir.
