Name: Pirinç Bir TILLING Popülasyonyüksek Çözünürlükte Erime mutasyonları belirlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Öğrenin, pirinç bitkilerinde yüksek çözünürlüklü erime analizi tabanlı TILLING yöntemiyle mutasyon tespiti için etkili bir protokol. Bu teknik, genomik varyasyonları taramada yüksek verimlilik sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (No. 2016YFD0102103) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No.31701394) tarafından desteklenmiştir.

1. Hazırlıklar
<ol><li>
Γ-ışınları mutajenize popülasyonların gelişimi
	<ol>
<li>Yaklaşık 20.000 kurutulmuş pirinç tohumu (%14) nem içeriği ile tedavi bir γ ışınlama tesisinde (örneğin, gama hücresi) 100 Gy (1 Gy/dk) ilejaponica pirinç hattı (örn. DS552). NOT: Tedavi için kullanılan tohumlar yüksek canlılığa sahip olmalıdır (örn. çimlenme oranı >%85). Indica pirinç için ışınlama dozu 150 Gy artırılabilir.</li>
		<li>Bir fide yatağında çimlenme ve bir çeltik tarlasına ayrı ayrı fide nakli sonra ışınlanmış tohumek ve M1 nüfus haline büyümek. NOT: M1 bitkilerinin doğrudan tohumlanması da işçilik maliyetini korumak için uygulanabilir. Fiziksel veya biyolojik izolasyon araçlarını kullanarak M1 bitkilerinin diğer pirinç çeşitleriyle geçişini önleyin.</li>
		<li>Toplu hasat M2 tohumları M1 bitkilerden, her M1 panik 1-2 tohum ile, bir M2 popülasyon oluşturmak için. NOT: Uygulamada ve basitlik için, M1 bitkilerin tüm tohumları hasat ve tamamen karıştırıldıktan sonra, bir kısmı M2 popülasyonu oluşturmak için örneklenir.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 24 (indica pirinç)-36 (japonica pirinç) h için suda yaklaşık 5.000 M2 tohum ıslatın. Daha sonra petri kaplarında nemli filtre kağıdı üzerinde 2 gün boyunca 37 °C'de çimlenmeye izin verin. NOT: Daha fazla M2 tohumu mutantların belirlenmesi olasılığını artırmak için analiz için çimlenebilir.</li>
		<li>Çimlenmiş tohumları küçük deliklerli tohumlama panellerine yerleştirin ve Yoshida ve ark. 15'ten değiştirilen bir kültür çözümünde 3-4 hafta hidroponik olarak 12 saatlik fotoperi [gündüz (30±2) °C ve gece (24±2) °C] olan bir cam evde yetiştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yaprak dokularının örneklemesi: Bir delik zımba layıcı kullanarak her tohumlamanın tamamen uzatılmış yaprağından bir disk (Φ ~2 mm) kesin.</li>
	<li>
DNA ekstraksiyon çözeltilerinin hazırlanması
	<ol>
<li>Tampon A: 50 mL'lik son hacmi yapmak için 2 mL 5 M NaOH ve %20 Ara 20 mL ekleyin. DNA çıkarmadan önce a arabelleği yeni hazırlayın.</li>
		<li>Tampon B: 100 mL'lik son hacim yapmak için 1 M Tris-HCl (pH 8.0) ve 0.5 M EDTA'dan 80 μL 20 mL ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR astarlar
	<ol>
<li>HRM analizi için astarlar: Yazılım (örneğin, Primer Premier5) kullanarak hedef sıranın yükseltilmesi için astarlar ve ticari bir şirket tarafından sentezleme. NOT: HRM uzun parçaların analizi için daha az uygulanabilir olduğundan ve dolayısıyla, amplicons az olmalıdır 400 bp. Çok yüksek (>75%) ile parçalar veya çok düşük (<25%) GC içeriği de HRM analizi için iyi değildir.</li>
		<li>Kalite kontrolü için astarlar: Peng ve ark. 16'dan 12 pirinçkromozomuna dağıtılan 24 SSR belirteçlerini kullanın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. DNA Çıkarma
<ol><li>96 kuyulu BIR PCR plakanın her kuyuya 4 yaprak disk yerleştirin, arabellek A çözeltisi (50 mL/iyi) ekleyin. Plakayı -80 °C'lik bir dondurucuda 10 dakika dondurun.</li>
	<li>Oda sıcaklığında plakayı defreeze ve sonra 95 °C'de 10 dakika kuluçka.</li>
	<li>Her kuyuya 50 μL arabellek B ekleyin ve girdap ile iyice karıştırın.</li>
	<li>1.500 x g 1 dakika için plaka santrifüj. Supernatant PCR için hazırdır.</li>
</ol>3. PCR Amplifikasyon
<ol><li>
PCR Optimizasyonu
	<ol>
<li>Her PCR'ye aşağıdaki reaktifleri iyi ekleyin: 1 μL DNA (adım 2.4'teki süpernatant), 5 μL 2x Master Mix(2x PCR tampon, 4 mmol/L MgCl 2, 0.4 mmol/L 2'-deoksiribonükleoside trifosfatlar (dNTPs) ve 50 U/mL Taq DNA polimeraz, 0.2 000 000 000 000 μmol/L astarlar ve nükleaziçermeyen su kullanarak 10°L'ye kadar son bir hacim yapın.</li>
		<li>Aşağıdaki PCR programını kullanarak her hedef parçası için en uygun tavlama sıcaklığını belirlemek için degrade özelliğine sahip bir termal blok kullanın: 94 °C'de 5 dk, ardından 94 °C'de 30 s, 52-62 °C'de 30 s (degrade sıcaklık) ve 72 °C'de 30 s , 8 dk için 72 °C'de son uzatma ve 16 °C'de tutun.</li>
		<li>Optimum tavlama sıcaklığının belirlenmesi için %1 agarose jeller üzerindeki amperonları inceleyin. NOT: Optimal bir tavlama sıcaklığı, spesifik amplifikasyon ve astar dimerizasyonu olmaksızın hedef parçanın spesifik amplifikasyonunu sağlamalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
HRM analizi için PCR NOT: 2.4 adımda açıklandığı şekilde çıkarılan M2 fidelerinin HRM uyumlu plakaları ve DNA'sı PCR için kullanılmaktadır.<ol>
<li>1 μL DNA (supernatant), 5 μL 2x Master Mix, 0,2 μL her 10 μmol/L astar ve 1 0x floresan boya 1 0°L ile 10 μL son hacimde PCR gerçekleştirin. Her plaka bir yabani tip (WT) ebeveynli örnek ve bir negatif (DNA olmadan) kontrol içerir.</li>
		<li>Buharlaşmayı önlemek için her kuyuya bir damla mineral yağ ekleyin.</li>
		<li>1 dk için 1.000 x g yapışkan film ve santrifüj ile plaka mühür.</li>
		<li>PcR'yi optimize edilmiş annealing sıcaklığını kullanarak çalıştırın. NOT: Birkaç durumda floresan boya PCR amplifikasyonunu etkileyebilir, bu nedenle boya PCR tamamlandıktan sonra eklenir. Bu gibi durumlarda boya, PCR sonrası denatüre ve annealing ile DNA iplikçiklerine dahil edilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. HRM Tarama ve Mutasyon Onayı
<ol><li>Yapışkan filmi plakadan çıkarın ve plakayı bir HRM makinesine takın.</li>
	<li>Dosya menüsünden Yeni Çalıştır'ı seçin veya ekranın üst kısmındaki Çalıştır düğmesine basın.</li>
	<li>Erimenin başlangıç ve bitiş sıcaklıklarını 55 °C ile 95 °C arasında belirtiniz. NOT: İlk çalıştırmadan sonra, erime sıcaklığı nın aralığı belirli bir parça için belirlenebilir; bu nedenle, erime sıcaklığı zaman kazanmak için aynı parçanın sonraki analizi için ayarlanabilir.</li>
	<li>Yüksek çözünürlüklü erime analizi için örnekleri seçin, negatif denetime benzer örnekleri hariç tayın.</li>
	<li>Aynı başlangıç ve floresan biten için erime eğrileri normalleştirin. Alt Min ve Alt Maksı İmlatörlerinin eğrilerin bir bölgesinde olduğunu görsel olarak doğrulayın.</li>
	<li>0,05 varsayılan ayarında F (floresan farkı) düzeyini tutun.</li>
	<li>Standartlar seçim listesinden Ortak ve Varyant'ı seçin ve Normal duyarlılığı seçin.</li>
	<li>WT'yi kontrol olarak kullanın; WT'den ≥0.05 değerinde ki numunelerin mutant bitki içerdiği kabul edilir. </li>
	<li>
Mutant bitkilerin tanımlanması ve onaylanması.
	<ol>
<li>Her mutant havuzunun yapıldığı dört bitkiyi tanımlayın.</li>
		<li>Allen ve ark. 17'ye göre bazı değişikliklerle ctab yöntemi kullanarak bu bitkilerin her birinden DNA ayıklayın. NOT: DNA kalitesi daha fazla PCR amplifikasyon için yeterli olduğundan, Allen ve ark.17tarafından tanımlanan CTAB yöntemi kullanılarak DNA ayıklanırken DNA'sız RNase ve NaAc kullanılmaz. Dna'yı bir spektrofotometre kullanarak nicelleştirmeden sonra ~25 ng/μL'lik son konsantrasyona ayarlayın.</li>
		<li>PCR astarlarını kullanarak hedef parçayı yükseltin ve HRM analiziyle aynı programı yapın.</li>
		<li>Amplikonrların Sanger dizilimi ile spesifik moleküler lezyonları tanımlayın. NOT: PCR amplifikasyon tamamlandıktan sonra, Sanger sıralama için bir şirkete amplicons gönderin. Moleküler lezyon, M2 bitkisi ile WT arasındaki diziler karşılaştırılarak tanımlanabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Moleküler Belirteçli Seçilmiş Mutantların Kalite Kontrolü
<ol><li>24 SSR belirteçleri için 25 ng genomik DNA (CTAB protokolü kullanılarak çıkarılan), 5 μL 2x ana karışım, 10 μM SSR astarın her birinin 0,2 μL'si ile 10°L'lik son hacimde PCR gerçekleştirin.</li>
	<li>Aşağıdaki programı kullanarak PCR çalıştırın: 94 °C'de 5 dk, 94 °C'de 30 s, 55 °C'de 30 s ve 72 °C'de 30 s, 7 dk için 72 °C'de son uzatma ile takip edin.</li>
	<li>% 8 poliakrilamid jeller üzerinde amplicons ayırın ve gümüş boyama18amplifiye parçalarıpolimorfizm ortaya .</li>
	<li>Seçilen varyantların SSR haplotiplerini ve WT'yi karşılaştırın. NOT: İndüklenen mutantlar genellikle WT ile aynı SSR haplotiplerine sahiptir, eğer birden fazla SSR belirteci bir varyant ile WT arasında farklılık gösterirse, varyantın indüklenen bir bitki yerine genetik bir kirletici (örn. karışım veya çaprazdan çıkmış bir bitki) olma olasılığı yüksektir. mutant18.</li>
</ol>

<ol><li>McCallum, C. M., Comai, L., Green, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+induced+local+lesions+IN+genomes+%28TILLING%29+for+plant+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics.</a> Plant Physiology. 123, 439-442 (2000).</li>
<li>Taheri, S., Abdullah, T. L., Jain, S. M., Sahebi, M., Azizi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TILLING%2C+high-resolution+melting+%28HRM%29%2C+and+next-generation+sequencing+%28NGS%29+techniques+in+plant+mutation+breeding%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Breeding%22%5BJournal%5D)">TILLING, high-resolution melting (HRM), and next-generation sequencing (NGS) techniques in plant mutation breeding.</a> Molecular Breeding. 37 (3), 40(2017).</li>
<li>Till, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+discovery+of+induced+point+mutations+with+high+throughput+TILLING%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Large-scale discovery of induced point mutations with high throughput TILLING.</a> Genome Research. 13 (3), 524-530 (2003).</li>
<li>Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TILLING%3A+practical+single+nucleotide+mutation+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">TILLING: practical single nucleotide mutation discovery.</a> The Plant Journal. 45 (4), 684-694 (2006).</li>
<li>Comai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+discovery+of+DNA+polymorphisms+in+natural+populations+by+Ecotilling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Efficient discovery of DNA polymorphisms in natural populations by Ecotilling.</a> The Plant Journal. 37, 778-786 (2004).</li>
<li>Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion-based+reverse+genetics+in+Medicagotruncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Deletion-based reverse genetics in Medicagotruncatula.</a> Plant Physiology. 151 (3), 1077(2009).</li>
<li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ITILLING%3A+a+personalized+approach+to+the+identification+of+induced+mutations+in+arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">ITILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in arabidopsis.</a> Physiology. 154 (1), 25-35 (2010).</li>
<li>Colasuonno, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DHPLC+technology+for+high-throughput+detection+of+mutations+in+a+durum+wheat+TILLING+population%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genetics%22%5BJournal%5D)">DHPLC technology for high-throughput detection of mutations in a durum wheat TILLING population.</a> BMC Genetics. 17 (1), 43(2016).</li>
<li>Tsai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+rare+mutations+in+populations%3A+TILLING+by+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Discovery of rare mutations in populations: TILLING by sequencing.</a> Plant Physiology. 156, 1257-1268 (2011).</li>
<li>Kumar, A. P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TILLING+by+Sequencing+%28TbyS%29+for+targeted+genome+mutagenesis+in+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Breeding%22%5BJournal%5D)">TILLING by Sequencing (TbyS) for targeted genome mutagenesis in crops.</a> Molecular Breeding. 37, 14(2017).</li>
<li>Dong, C., Vincent, K., Sharp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+mutation+detection+of+three+homoeologous+genes+in+wheat+by+High+Resolution+Melting+analysis+and+Mutation+Surveyor%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous mutation detection of three homoeologous genes in wheat by High Resolution Melting analysis and Mutation Surveyor.</a> BMC Plant Biology. 9, 143(2009).</li>
<li>Gady, A. L., Herman, F. W., Wal, M. H. V. D., Loo, E. N. V., Visser, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+two+high+through-put+techniques+in+a+novel+application%3A+detecting+point+mutations+in+large+EMS+mutated+plant+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Implementation of two high through-put techniques in a novel application: detecting point mutations in large EMS mutated plant populations.</a> Plant Methods. 5 (41), 6974-6977 (2009).</li>
<li>Ririe, K. M., Rasmussen, R. P., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product+differentiation+by+analysis+of+DNA+melting+curves+during+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction.</a> Analytical Biochemistry. 245, 154-160 (1997).</li>
<li>Lochlainn, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+melt+%28HRM%29+analysis+is+an+efficient+tool+to+genotype+EMS+mutants+in+complex+crop+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">High resolution melt (HRM) analysis is an efficient tool to genotype EMS mutants in complex crop genomes.</a> Plant Methods. 7, 43(2011).</li>
<li>Yoshida, S., Forno, D. A., Cock, J. H., Gomez, K. A. Laboratory manual for physiological rice. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYoshida%2C+S+%22The+International+Rice+Research+Institute%22">The International Rice Research Institute</a>. , Manila, the Philippines. (1976).</li>
<li>Peng, S. T., Zhuang, J. Y., Yan, Q. C., Zheng, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SSR+markers+selection+and+purity+detection+of+major+hybrid+rice+combinations+and+their+parents+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Rice+Science%22%5BJournal%5D)">SSR markers selection and purity detection of major hybrid rice combinations and their parents in China.</a> Chinese Journal of Rice Science. 17, 1-5 (2003).</li>
<li>Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+protocol+for+rapid+DNA+isolation+from+plant+tissues+using+cetyltrimethymmonium+bromide%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethymmonium bromide.</a> Nature. 1 (5), 2320-2325 (2006).</li>
<li>Fu, H. W., Li, Y. F., Shu, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revisit+of+mutation+induction+by+gamma+rays+in+rice+%28Oryza+sativa+L.%29%3A+implications+of+microsatellite+markers+for+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Breeding%22%5BJournal%5D)">A revisit of mutation induction by gamma rays in rice (Oryza sativa L.): implications of microsatellite markers for quality control.</a> Molecular Breeding. 22 (2), 281-288 (2008).</li>
<li>Li, S., Liu, S. M., Fu, H. W., Huang, J. Z., Shu, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+melting-based+tilling+of+%CE%B3+ray-induced+mutations+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Zhejiang+University-Science+B%22%5BJournal%5D)">High-resolution melting-based tilling of γ ray-induced mutations in rice.</a> Journal of Zhejiang University-Science B. 19 (8), 620-629 (2018).</li>
<li>Acanda, Y., Óscar, M., Prado, M. J., González, M. V., Rey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMS+mutagenesis+and+qPCR-HRM+prescreening+for+point+mutations+in+an+embryogenic+cell+suspension+of+grapevine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">EMS mutagenesis and qPCR-HRM prescreening for point mutations in an embryogenic cell suspension of grapevine.</a> Cell Reports. 33 (3), 471-481 (2014).</li>
<li>Si, H. J., Wang, Q., Liu, Y. Y., Huang, J. Z., Shu, Q. Y., Tan, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+an+HRM-based%2C+safe+and+high-throughput+genotyping+system+for+photoperiod+sensitive+genic+male+sterility+gene+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Agricultural+Sciences%22%5BJournal%5D)">Development and application of an HRM-based, safe and high-throughput genotyping system for photoperiod sensitive genic male sterility gene in rice.</a> Journal of Nuclear Agricultural Sciences. 31 (11), 2081-2086 (2017).</li>
<li>Li, S., Zheng, Y. C., Cui, H. R., Fu, H. W., Shu, Q. Y., Huang, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+and+type+of+inheritable+mutations+induced+by+%CE%B3+rays+in+rice+as+revealed+by+whole+genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Zhejiang+University-Science+B%22%5BJournal%5D)">Frequency and type of inheritable mutations induced by γ rays in rice as revealed by whole genome sequencing.</a> Journal of Zhejiang University-Science B. 17 (12), 905(2016).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

TILLING gen fonksiyonel analizi ve bitki ıslahı için indüklenen mutasyonları tanımlamak için güçlü bir ters genetik araç olduğunu kanıtlamıştır. Kolay gözlenmeyen veya belirlenemeyen bazı özellikler için, yüksek iş itrılişli PCR tabanlı mutasyon tespiti ile TILLING farklı genler için mutantlar elde etmek için yararlı bir yöntem olabilir. HRM-TILLING yöntemi mutasyon taraması için domates12,buğday11 ve üzüm20 EMS-mutajenize edilmiş popülasyonlarda kul...

Mutantlar bitki fonksiyonel genomik araştırma ve yeni çeşitlerin ıslahı için önemli genetik kaynaklardır. İleri genetik yaklaşım (yani mutant seçiminden gen klonlama veya çeşitli gelişime kadar) yaklaşık 20 yıl önce indüklenen mutasyonların kullanımında ana ve tek yöntem olarak kullanılmıştır. McCallum ve ark.1 tarafından yeni bir ters genetik yöntemi, TILLING (Hedefleme Kaynaklı Lokal Lezyonlar Genomlar) gelişimi yeni bir paradigma açıldı ve o zamandan beri hayvan ve bitki türlerinin çok sayıda uygulanmıştır2. TILLING özellikle teknik olarak zor veya maliyetli olan (örneğin, hastalık direnci, mineral içeriği) üreme özellikleri için yararlıdır.
TILLING başlangıçta kimyasal mutajenler tarafından indüklenen tarama noktası mutasyonları için geliştirilmiştir (örn. EMS1,3). Aşağıdaki adımları içerir: bir TILLING nüfus (lar) kurulması; DNA hazırlama ve bireysel bitkilerin havuzlanması; Hedef DNA parçasının PCR amplifikasyonu; PCR amplikonve dekoltesinin CEL I nükleaz tarafından denatürasyonu ve tavallanması ile heteroduplexes oluşumu; ve mutant bireylerin ve spesifik moleküler lezyonların tanımlanması3,4. Ancak, bu yöntem hala nispeten karmaşık, zaman alıcı ve düşük iş için. Daha verimli ve daha yüksek iş ile yapmak için, silme TILLING (De-TILLING) ( Tablo1,3,5,6, 7,8,9,10,11,12.
DNA dupleksinin erimesi sırasında floresan değişikliklerine dayanan HRM eğrisi analizi, mutasyon taraması ve genotipleme için basit, uygun maliyetli ve yüksek iş lenme yöntemidir13. HRM zaten yaygın Olarak EMS mutagenez 14 tarafından indüklenen SBS mutasyonları taranması için HRMtabanlı TILLING (HRM-TILLING) dahil olmak üzere bitki araştırmalarında kullanılmıştır. Burada, pirinçteki gama (γ) ışınları ile indüklenen mutasyonların (Hem Indel hem de SBS) taranması için ayrıntılı HRM-TILLING protokolleri sunduk.

<table><tbody><tr><td>2 kez; Taq plus PCR Master Mix</td><td>Tiangen, Çin</td><td>KT201</td><td>PCR tamponu, PCR amplifikasyonu için dNTP ve polimeraz</td></tr><tr><td>96 oyuklu plaka</td><td>Bio-rad, Amerika</td><td>MSP-9651</td><td>İnsan kaynakları analizi analizinde PCR için özel plaka</td></tr><tr><td>Mastercycler nexus</td><td>Eppendorf, Alman</td><td>6333000073</td><td>PCR amplifikasyonu</td></tr><tr><td>LightScanner</td><td>Idaho Technology, ABD</td><td>LCSN-ASY-0011</td><td>Floresan örneklemesi için ve işleme</td></tr><tr><td>CALL-IT 2.0</td><td>Idaho Technology, ABD</td><td></td><td>Floresan değişiminin analizi için</td></tr><tr><td>EvaGreen</td><td>Biotium, ABD</td><td>31000-T</td> HRM Nanodrop 2000 Thermo Scientific, ABD ND2000 <td>floresan boyası</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>DNA miktar tayini için</td></tr></tbody></table>

pirinç bir tilling popülasyonyüksek Çözünürlükte erime mutasyonları belirlenmesi

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Genomlarda Hedef Kaynaklı Lokal Lezyonlar (TILLING), indüklenen mutasyonların yüksek iş lenme taraması için ters genetik stratejisidir. Ancak TILLING sistemi ekleme/silme (Indel) tespiti için daha az uygulanabilirliğe sahiptir ve geleneksel TILLING'in CEL I nükleaz sindirimi ve jel elektroforez gibi daha karmaşık adımlara ihtiyacı vardır. Verim ve seçim verimliliğini artırmak ve hem Indels hem de tek baz ikamelerinin (SBSs) taranmasını mümkün kılmak için, yeni bir yüksek çözünürlüklü erime (HRM) tabanlı TILLING sistemi geliştirilmiştir. Burada ayrıntılı bir HRM-TILLING protokolü sunmakta ve mutasyon taramasında uygulamamızı gösteriyoruz. Bu yöntem, yüksek sıcaklıklarda çift iplikli DNA denatürasyonu ölçerek PCR amplicons mutasyonları analiz edebilirsiniz. HRM analizi ek işleme gerek kalmadan doğrudan PCR sonrası gerçekleştirilir. Ayrıca, basit, güvenli ve hızlı (SSF) DNA çıkarma yöntemi HEM Indels ve SBSs tanımlamak için HRM-TILLING ile entegre edilmiştir. Sadeliği, sağlamlığı ve yüksek iş kalitesi, pirinç ve diğer ürünlerde mutasyon taraması için potansiyel olarak yararlı olmasını sağlayabilir.

HRM Tarama ve Analiz
Toplamda 4.560 M2 fideden 1.140 havuzdna örneği üretildi ve PCR amplifikasyonuna tabi tutuldu. OsLCT1 ve SPDTiçin sırasıyla 195 bp ve 259 bp boyutunda iki parça yükseltildi (Tablo 2). Örneklerin çoğunda WT'den önemli ölçüde farklı olmayan erime eğrileri vardı (ΔF &lt; 0.05). WT'den önemli ölçüde farklı OLAN HRM eğrileri (ΔF &gt; 0.05) yazılım tarafından WT'den farklı renk(ler) ile gruplandı (Şekil<strong class=...

Bu makalede, Genomlarda Yüksek Çözünürlüklü Erime Analizi (HRM) tabanlı Hedef Kaynaklı Lokal Lezyonlar (TILLING) olarak tanımlanan protokolü satılmaktadır. Bu yöntem, DNA dupleksinin erimesi sırasında floresan değişikliklerini kullanır ve hem ekleme/silme (Indel) hem de tek baz ikamesi (SBS) yüksek işlem li tarama için uygundur.

Pirinç Bir TILLING Popülasyonyüksek Çözünürlükte Erime mutasyonları belirlenmesi

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Teknik olarak zor veya maliyetli olan hastalık direnci, mineral içeriği gibi belirlenmesi zor veya maliyetli olan ıslah özellikleri için oldukça yararlı olacaktır. Oldukça basit, uygun maliyetli ve yüksek iş yapma tekniğidir. Başlamak için, 96 kuyulu BIR PCR plakanın her kuyuya dört yapraklı disk yerleştirin.Her kuyuya 50 mililitre arabellek bir çözüm ekleyin. Tabağı eksi 80 derecelik dondurucuda 10 dakika dondurun. Daha sonra, oda sıcaklığında tabağı defreeze.95 derecede 10 dakika kuluçkaya yat. Her kuyuya 50 mikrolitre tampon B ekleyin ve girdap yaparak iyice karıştırın. 1, 500 kez g bir dakika için plaka santrifüj.PCR için DNA olarak supernatant toplamak. İlk olarak, dna supernatant yanı sıra PCR şablonu annealing sıcaklığı optimize etmek için kullanın. Her PCR kuyusuna reaktifler ve bir mikrolitre DNA süpernatant ekleyin.PCR tüplerini degrade özellikli bir termal blota yerleştirin ve her hedef parça için en uygun tavlama sıcaklığını belirlemek için ısıtma programını el yazmasına göre ayarlayın. Amperonları incelemek için PCR ürünü için %1 agarose jelüzerinde elektroforez yapın. Hedef parçanın özel amplifikasyonuna olanak tanıyan en uygun tavlama sıcaklığını belirleyin.HRM analizini gerçekleştirmek için, hrm uyumlu plakaların her kuyusunda 10 kez floresan boyanın bir mikrolitresi ve bir mikrolitre DNA süpernatantı dahil olmak üzere reaktifleri birleştirir. Her plaka, bir vahşi tip ebeveynli örnek ve DNA olmadan bir negatif kontrol içerir. Buharlaşmayı önlemek için her kuyuya bir damla mineral yağ ekleyin.Daha sonra plakayı yapışkan filmle kapatın ve 1000 kez g'de bir dakika santrifüj edin. PcR'yi optimize edilmiş annealing sıcaklığını kullanarak çalıştırın. Şimdi, yapışkan filmi plakadan çıkarın ve plakayı bir HRM makinesine takın.Yazılımda, dosya menüsünden Yeni Çalıştır'ı seçin veya ekranın üst kısmındaki Çalıştır düğmesine basın. Erimenin başlangıç ve bitiş sıcaklıklarını 55 ila 95 santigrat derece ye belirtin. Yüksek çözünürlüklü erime çözümlemesi için örnekleri seçin ve negatif denetime benzer örnekleri hariç tayın.Aynı başlangıç ve floresan biten için erime eğrileri normalleştirin. Alt minimum ve daha düşük maksimum sıcaklık imleçlerinin eğrilerin bir bölgesinde olduğunu görsel olarak doğrulayın. Delta F,floresan farkı, 05 varsayılan ayarında düzeyi tutun.Standartlar seçim listesinden, ortak karşı varyantı seçin ve normal duyarlılığı seçin. Denetim olarak vahşi türünü kullanmak için H12'yi seçin. Delta F değeri 05'ten büyük olan numuneler mutant bitki içerdiği kabul edilir.Daha sonra, bir CTAB yöntemi kullanarak, erime eğrisi vahşi tip önemli ölçüde farklı mutant havuzundan dört bitkilerin her birinden DNA ayıklayın. Bir spektrofotometre kullanılarak sayısallaştırmadan sonra, NanoDrop 2000 ile DNA'yı mikrolitre başına yaklaşık 25 nanogramlık son konsantrasyona ayarlayın. PCR tüplerdeki DNA örneğine 0,4 mikrolitre PCR astar ekleyin, termal bir döngüye yerleştirin ve hedef parçayı yükseltmek için programı ayarlayın.Ardından, PCR ürünlerini sıralama için bir şirkete gönderin. Sanger diziliminden sonra, M2 bitkisi ile yabani tip arasındaki dizileri karşılaştırarak moleküler lezyonu karşılaştırın. Bu çalışmada, OSLCT1 veya SPDT genlerinde mutasyonlar için M2 fidelerinin hrm taraması ve analizi, örneklerin çoğunun 05'ten az delta F ile yabani tipten önemli ölçüde farklı olmayan erime eğrileri olduğunu göstermiştir.Mutantlar delta Fs 05'ten büyük 90 ila 92 santigrat derece ve 81,5 ila 83,5 santigrat derece sıcaklıklarda, sırasıyla önemli ölçüde farklı HRM eğrileri gösterdi. 4, 560 M2 fidesinin genlerdeki mutasyon tipi ve pozisyonu sıralanan kromatogramlar tarafından doğrulandı. 4'te G ile A mutasyonu olan heterozigot bir bölge, OsLCT1'in 304 baz çifti saptandı.Tek nükleotid OsLCT1'in 4, 240 baz çiftinde bir nükleotit insersiyon, 5, 948-5, 950 baz spdt baz çifti pozisyonunda TTC trinükleotid delesiyonu gözlendi. HRM analizinden önce PCR'yi optimize ediyorum. Jel boya biraz zararlıdır.Jeli çalıştırırken eldiven giymeyi unutmayın.

identifying-mutations-high-resolution-melting-tilling-population

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Hücre biyolojisinde temel bir arayış ökaryotik hücrelerin yapmak organellerin kimliği altında yatan mekanizmaları belirlemektir. Burada floresan mikroskobu ve yeni nesil dizileme araçlarını kullanarak bitki organel morfolojik ve fonksiyonel bütünlüğü sorumlu genleri tanımlamak için bir yöntem öneriyoruz.

Floresans-mikroskopi Tarama ve nesil Sekanslama: organel Bütünlüğü ile ilgilendim Genlerin belirlenmesi için Faydalı Araçlar

Bu videoda, erime sıcaklığı analizine dayalı olarak farklı dizi uzunluklarına sahip DNA fragmanlarının uzunluk polimorfizmini belirlemek için yüksek çözünürlüklü bir erime PCR tekniğini açıklıyoruz.

Mutant DNA Dizilerindeki Dizi Varyasyonlarını Belirlemek için Yüksek Çözünürlüklü Eritme PCR

Yüksek çözünürlüklü erime analizi (HRMA) ile bir araya PCR zebrafish genotip için hızlı ve etkili bir yöntem olarak gösterilmiştir.

Yüksek çözünürlüklü Melt Analizi ile PCR kullanarak hızlı ve verimli Zebra Genotiplemesi

Yüksek çözünürlüklü erime analizi heterojen nüfus içinde tek nükleotid polimorfizmlerinin ayırt yeteneği sunarken, mutant alel amplifikasyon önyargı, bir numune içinde nispeten düşük oranlarda bulunan allel tespit kabiliyetini artırabilir. Bu protokol, yüksek çözünürlüklü erime analizinin duyarlılığını artırmak geliştirmeleri açıklanır.

Yöntemler sıtma Tek Nükleotid Polimorfizm Genotipleme Erime Yüksek Çözünürlük Duyarlılığının Artırma

Bu iletişim kuralı kopya numarası değişimler tüm genom dizi tabanlı Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH) analizi yürütmektedir ilgilenen araştırmacılar için deneysel adımlar ve reaktifler, ekipman ve çözümleme araçları hakkında bilgi sağlar bitkiler.

Dizi tabanlı Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon için bir Platform verimli algılama varyasyonları kopya numarası hızlı nötron kaynaklı Medicago truncatula mutantlar içinde

Açıklanan bir mutajen olarak etil methanesulfonate (EMS) kullanımı ile küçük tahıl bitkileri nüfus (TILLING) nüfusun hedefleme kaynaklı yerel lezyonlar geliştirmek için bir protokoldür. Ayrıca sağlanan cel-1 tahlil kullanarak mutasyon algılama için bir protokoldür.

Genomlarda (TILLING) küçük tahıl bitkilerinin etil methanesulfonate Mutagenezinde kaynaklı lokal lezyonların hedeflemesinin geliştirilmesi

Bu yöntem, toplam RNA ekstresinden miRNA'ları tespit etmek için kuzey hibridizasyon tekniğinin kullanımını göstermektedir.

Bitki MikroRNAlarının Saptanması ve Ölçülmesi için RNA Leke Analizi

Bu protokol, taramalı elektron mikroskopisi kullanılarak endosperm ve nişaste granül morfolojisinin analizi için tahıl tohumlarının enine bölümlerinin (örneğin pirinç) hazırlanmasına izin verir.

Olgun Pirincin Enine Kesiti (Oryza sativa L.) Hareketsizleştirme Desteği Olarak Pipet İpuçlarını Kullanarak Elektron Mikroskopi Görüntülemesini Taramak için Çekirdekler

Yüksek çözünürlüklü erime analizi (HRM), genetik varyant tespiti için hassas ve hızlı bir çözümdür. Erime eğrisinin şeklini değiştiren heteroduplexes ile sonuçlanan sıra farklılıklarına bağlıdır. HRM ve agarose jel elektroforezi taranarak, indels gibi farklı genetik varyantlar tanımlanabilir.

Yüksek Çözünürlüklü Erime Analizi Kullanarak CALR Geninde Genetik Varyant Tespiti

Bu makalede, CRISPR/Cas9 tarafından indüklenen indellerin hızlı tanımlanması ve sivrisinek Aedes aegypti'deki mutant çizgilerinin yüksek çözünürlüklü eriyik analizi kullanılarak seçilmesi için bir protokol ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Sivrisinek Aedes aegypti'de Yüksek Çözünürlüklü Eriyik Analizi Kullanarak CRISPR/Cas9 Mutagenesis'i Takip Eden Indel Tespiti

Protokol, genom düzenleme teknolojilerini hassas, verimli ve teknik olarak basit bir şekilde kullanarak tasarım yoluyla ıslaha dirençli nişasta pirinç çeşitlerini açıklar.

Genom Düzenleme Teknolojileri ile Fonksiyonel Pirinç için Tasarım Yoluyla Islah

Öğrenin, pirinç bitkilerinde yüksek çözünürlüklü erime analizi tabanlı TILLING yöntemiyle mutasyon tespiti için etkili bir protokol. Bu teknik, genomik varyasyonları taramada yüksek verimlilik sağlar.

Pirinç Bir TILLING Popülasyonyüksek Çözünürlükte Erime mutasyonları belirlenmesi

Daha fazla video keşfet