Mersin Balığı Fin ve Çene Kemiği Matrislerinden Kortizol Ekstraksiyonu

Yöntemimiz yeni olmayan arsa ve saç matrisk kortizol ölçmek için çok sayıda gelecekteki çalışmalar için bir platform olabilir yeni bir alternatif stres göstergesi tanıttı. Bu tekniğin avantajları sadeliği ve kesilen hayvanlarda bile stres düzeylerini değerlendirmek için kullanılabilme yeteneğidir. Bu tekniği kullanarak yüksek kortizol düzeyleri ve sağlıklı hayvanlar veya insanlar arasında bir ilişki kurulması bazı hastalıkların tanısı ile yardımcı olabilir.

Bu yöntem aynı zamanda örnek yaşam süresi içinde stres düzeylerini değerlendirmek için bu eski fosiller gibi asırlık biyolojik örnekleri incelemek için kullanılabilir. Kortizol ekstraksiyonu için, numuneleri tek tek 15 mililitrelik konik tüplere yerleştirmeden önce, her numunenin 300 artı veya eksi 10 miligramını dijital analitik ölçekte 0,0001 doğrulukla tartın. Her numune tüpüne üç mililitre izopropanol ekleyin ve kortizolü yıkamak ve olası dış kirlenmeyi gidermek için tüpleri dakikada 80 dönüşte 2,5 dakika döndürün.

Son yıkamadan sonra, numuneleri her yıkama için taze ultra saf su kullanılarak gösterildiği gibi üç kez daha yıkamadan önce numuneleri oda sıcaklığında yedi gün boyunca hava kurutun. Kurutulmuş yüzgeç veya çene kemiği örnek 75 artı veya eksi beş miligram tartMak ve nihayet 32 dakika boyunca 50 hertz örnek öğütmek için bir boncuk çırpıcı kullanın. Daha sonra, toz yüzgeç veya çene kemiği her tüp metanol 1.5 mililitre teslim ve oda sıcaklığında 18 saat boyunca dakikada 40 rotasyonlar bir tüp rotator üzerinde örnekleri yerleştirin.

Kortizol ekstraksiyonundan sonra, numune dokularını santrifüj ile tortulat. Ve her örnekten tabaka içeren sarımsı, organik kortizolün üst mililitresini 1,5 mililitrelik mikro santrifüjlü tüplere aktarın. Kortizol örneklerini bir gecede duman kaputunda 38 derecede kurutun ve metanol buharlaşın.

Ertesi sabah, her tüp ve girdap ve kortizol toplamak için örnekleri santrifüj 400 mikrolitre PBS ekleyin. ELISA Analizi için, çıkarılan her standart kortizol numunesinin 25 mikrolitresini yükleyin ve 96 kuyulu ELISA plakasının uygun kuyularına yinelenen kontrol edin. Sıfır olarak hizmet etmek ve her spesifik olmayan bağlayıcı kuyuya hizmet etmek için 25 mikrolitre Assay diluent'i iki kuyuya yükleyin.

15 mikrolitre enzimi 24 mililitre Assay dilüent ile karıştırın ve her kuyuya 200 mikrolitre eşlegen ekleyin. Dakikada 500 dönüşte plakayı beş dakika boyunca bir rotator üzerinde karıştırın. Ardından oda sıcaklığında bir saatlik kuluçka.

Kuluçka sonunda, iyi başına 1x Yıkama Tampon 300 mikrolitre ile plaka dört kez yıkayın. Tampon atmak ve kağıt havlu yığını üzerinde plaka lekeleme her yıkama dan sonra hızlı bir şekilde lavabo üzerinde plaka ters. Son yıkamadan sonra, her kuyuya 200 mikrolitre TMB substrat çözeltisi ekleyin ve plakayı dakikada 500 dönüşte beş dakika rotatörüzerine yerleştirin.

Karıştırdıktan sonra, ışıktan korunan oda sıcaklığında 25 dakika boyunca plakakuluçka. Kuluçka sonunda, her kuyuya 50 mikrolitre stop çözeltisi ekleyin. Ve dakikada 500 dönüşler veya tüm kuyular yeşilden sarıya dönene kadar üç dakika boyunca rotator üzerinde plaka içeriğini karıştırın.

Daha sonra, örneklerin optik yoğunluğunu okuyun ve her örnekteki kortizol seviyelerini miligram başına pikograma dönüştürmek için mikro plaka yazılımını kullanın. Bu temsili analizde, izopropanol ile yıkanmış yüzgeç örneklerinde kortizol düzeyleri su ile yıkananlara göre daha yüksek olmakla birlikte, mersin türü arasında fin kortizol düzeylerinde anlamlı bir farklılık gözlenmemiştir. Yıkama çözücüleri ile mersin balığı türleri arasında anlamlı bir etkileşim yoktu.

H.Huso çene kemiklerinden gelen kortizollerin incelenmesi, mersin balığı çene kemiklerinin yüzgeçlere alternatif bir matris olarak kullanılıp kullanılamayacağını belirlemek için yıkama çözücüsünün H.Huso'nun mersin balığında ölçülen kortizol seviyesi üzerinde önemli bir etkisi olmadığını ortaya koymuştur. Ayrıca, veriler test edilen üç mersin balığı türünün yüzgeçleri ile H.Huso çene kemikleri arasında yüksek bir benzerlik olduğunu ortaya koymuştur. Numuneleri ince toz haline getirmek ve başarılı bir kortizol ölçümü için uygun bir ticari ELISA Test Kiti kullanmak için boncuk çırpıcıyı kullanmak önemlidir.

Kortizol seviyesi ölçümleri çevrenin hayvan biyolojisini nasıl etkilediği hakkında önemli bilgiler sağladığından, bu yöntem dişlerde ve diğer sert matrislerde kortizol saptamasında da kullanılabilir. Bu yöntem, insan süt dişlerinde ve pediatrik endokrinoloji, psiko biyoloji, davranışsal, arkeolojik ve adli çalışmalarda kortizol düzeylerinin değerlendirilmesinde yeni bir yaklaşım olarak kullanılabilir.