Name: Birincil İnsan Monositlerinin İzolasyon, Transfeksiyon ve Kültürü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Öğrenin, HIV enfekte bireylerden birincil insan monositlerinin izolasyonu, kültürü ve transfeksiyonu için optimize edilmiş bu protokolü. Bu yöntem, immün yanıt düzenleyicisi monosit fonksiyonunu incelemek ve immün disfonksiyon mekanizmalarını anlamak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar hiv Klinik / Tümör Biorepozitory Core hasta örnekleri ve hücresel immünoloji metabolizma çekirdek akış sitometri analizi sağlamak için sağlamak için teşekkür etmek istiyorum. Bu proje NIH P20GM121288 ve P30GM114732 tarafından finanse edilmiştir.

Aşağıda açıklanan tüm yöntemler Louisiana State University Sağlık Bilimleri Merkezi New Orleans Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır. Tüm kan bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra toplandı.
NOT: Biyolojik malzemelerin iştininde dikkatli olunması için tüm işlem biyogüvenlik seviyesi 2 (BSL2) tesisinde steril koşullar altında gerçekleştirilir. Özellikle, her adım bir biyogüvenlik kabine altında steril teknikler kullanılarak gerçekleştirilir. Kan, kan ürünleri, hücreler veya hücre ürünü pipetleme içeren her adımdan sonra, uygun bertaraf edilmeden önce kaputun içindeki bir atık kabından %10 çamaşır suyu ile tüm plastik malzemeyi (örneğin, serolojik pipetler, pipet uçları ve tüpler) durulamak önemlidir.
1. Primer insan monositlerinin immünomanyetik negatif seçilim ile izolasyonu
<ol><li>Dört 10 mL ethylenediaminetetraasetik asit (EDTA) vakum tüpleri (tüp başına 10 mL kan) taze, insan tam kan (ya bir HIV+ hasta veya sağlıklı kontrol) 40 mL toplamak. Bir biyogüvenlik kabini altında steril teknikler kullanarak, bir 50 mL konik propilen tüp içine kan tüm 40 mL transfer.</li>
	<li>Seçilen insan monosit izolasyon kiti(Malzeme Tablosu)için üreticinin protokolünden sonra, kan tüpüne kitte sağlanan 2 mL monosit izolasyon kokteyli ekleyin. Girdap manyetik boncuklar, ayrıca kiti sağlanan, 30 s, ve kan tüpüne 2 mL ekleyin.<ol>
<li>40 mL'den az kan varsa, eklenen reaktifleri küçültün. Çözeltiyi karıştırmak için pipet yukarı ve aşağı plastik 25 mL serolojik pipet ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka (RT).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kan karışımını dört adet 50 mL'lik tüplere eşit olarak ayırın ve her tüpe 1 mM EDTA içeren 30 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin. Plastik 25 mL serolojik pipet ile yukarı ve aşağı pipetleme ile karıştırın.</li>
	<li>Antikor konjuge manyetik boncukları çıkarmak için tüpleri 10 dk mıknatıs tutuculara yerleştirin. Her kan örneği için tutarlı kuluçka ve izolasyon süreleri sağlamak için aynı anda dört mıknatıs tutucuları kullanın, her tüp için bir.</li>
	<li>Onlar hala mıknatıs tutucuları iken, bir pipet kullanarak, her tüpün merkezinden içeriğini çizin. Kırmızı kan hücrelerini (10 mL başlangıç hacminin en fazla %10'u) hazırlamamaya ve içindekileri dört yeni 50 mL tüpten birine yerleştirmemeye dikkat edin.</li>
	<li>Her 50 mL tüpe 500 μL girdaplı manyetik boncuk ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı 25 mL pipet ve 5 dakika boyunca RT inkübat. Daha sonra tüpleri 5 dk boyunca mıknatıs tutuculara yerleştirin.</li>
	<li>Mıknatıs tutucularda yken içindekileri her tüpün merkezinden dört yeni 50 mL tüpten birine dikkatlice aktarın. Doğrudan 5 dakika boyunca mıknatıs tutucularda her yeni 50 mL tüp yerleştirin.</li>
	<li>Her tüpün ortasındaki içeriği dikkatlice dört yeni 50 mL tüpten birine aktarın. 5 dk. Süpernatant'ı aspire etmek ve toplam 10 mL steril PBS'de dört hücreli peleti yeniden askıya almak için 300 x g'de tüm yeni 50 mL tüpleri döndürün.</li>
	<li>Hemositometre kullanarak hücreleri trypan mavi hariç tutarak sayın. NOT: 8-20 x 106 hücre genellikle 40 mL tam kandan elde edilir.</li>
</ol>2. Birincil insan monositlerinin culturing
<ol><li>37 °C'lik su banyosu kullanarak, %1 penisilin-streptomisin (kalem/strep) ile desteklenen sıcak serumsuz RPMI 1640 ortam ve (biyogüvenlik kabini altında steril teknikler kullanmaya devam ederken) bu ortamda izole monositleri 1 x 106 hücre/mL konsantrasyonla askıya alır.</li>
	<li>6 kuyu plakasının her kuyusuna veya 35 mm'lik bir tabağa 1 mL'lik yeniden askıda hücreler ekleyin (son hücre sayısı 1 x 106 hücre/plaka olmalıdır) ve %5 CO2ile 37 °C'lik bir kuluçka makinesine yerleştirin. Hücrelerin yapışması için 0,5-1,0 h bekleyin.</li>
	<li>37 °C su banyosu, sıcak ısı-inaktive (HI) fetal büyükbaş serum (FBS) kullanarak. Her plakaya 100°L (%10 nihai konsantrasyon) FBS ekleyin. Makrofaj farklılaşmasını teşvik etmek için hücrelere büyüme faktörleri ekleyin.<ol>
<li>Ortama 25 ng/mL granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ekleyerek M1 benzeri fenotip için prime makrofajlar. Ortama 50 ng/mL makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ekleyerek M2 benzeri fenotip için prime makrofajlar28. NOT: Hem GM-CSF hem de M-CSF, m1 veya M2 için hücreleri astarlarken, genel bir makrofaj fenotip (M0) için monosit farklılaşmasına izin verir, sırasıyla7,28,30.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Kültürde birincil insan monositlerinin dönüştürülmesi
<ol><li>Polimer bazlı transfeksiyon reaktifi(Malzeme Tablosu)içeren bir kit kullanarak miRNA taklitçiveya inhibitörleri veya siRNA ile transfect monositler.<ol>
<li>Transfeksiyon kiti için üreticinin protokolüne (ve bir biyogüvenlik kabinesi altında steril tekniklerin kullanımına devam etme) ardından, ilk olarak seçilen miRNA mirna taklitlerini/inhibitörlerini veya siRNA'ları tamponda 1,83 μM'lik son konsantrasyona seyreltin. 1 x 106 hücrenin transfeksiyonu için 10 μL seyreltilmiş mimik/inhibitör hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sağlanan polimerin 1 μL'sini taze 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne ekleyerek transfeksiyon reaktifini hazırlayın ve hemen ardından 90 μL sağlanan tampon (transfeksiyon başına toplam 91°L reaktif için) ekleyin. Girdap 3-5 s.</li>
	<li>Pipet 90 μL transfection çözeltisi içeren tüp içine 10 μL seyreltilmiş miRNA miRNA mi/inhibitörü veya siRNA. Nazik pipetleme ile karıştırın ve RT 15 dakika kuluçka.</li>
	<li>1 x 106 kaplama monositten oluşan bir kuyuya (veya çanak) 100 μL transfeksiyon kompleksi ekleyin. 37 °C'de 4 saat boyunca inkütün hücreleri, daha sonra GM-CF veya M-CF içeren tam ortam (RPMI 1640% 1 penisilin-streptomisin ve% 10 ısı-inaktive FBS ile desteklenmektedir) ile orta değiştirin.</li>
</ol>4. M1/M2 farklılaşma ve aktivasyon
<ol><li>Monositler hemen kültürde kaplama üzerine geniş M0 makrofajlar ayırt başlar. Kaplamadan sonraki üçüncü gün, bir biyogüvenlik kabinesi altında steril teknikler kullanmaya devam edin ve ortamı 3 mL taze RMPI 1640 ortamla değiştirin (%1 penisilin-streptomisin, %10 ısı-inaktive FBS ve M1 benzeri polarizasyonu veya M2 benzeri kutuplaşmayı teşvik etmek için 25 ng/mL GM-CSF ile destekleyin). Kültür 37 °C, 5% CO2bir kuvöz de ilk kaplama itibaren 6 gün boyunca bu koşullarda hücreleri .</li>
	<li>Astarlanmış hücrelerin M1-makrofaj fenotipine polarizasyonunu ilerletmek için, hücre ortamını %5 ısı yalıtımlı FBS, %1 kalem/strep, 100 ng/mL E. coli-derivedlipopolysaccharide (LPS) ve 20 ng/mL interferon gama (IFN-γ) içeren yeni ortamla değiştirerek hücre ortamını 6.</li>
	<li>Astarlanmış hücrelerin M2-makrofaj fenotipine polarizasyonunu ilerletmek için, hücre ortamını %5 ısı yalıtımlı FBS, %1 kalem/strep, 10 ng/mL M-CSF ve 20 ng/mL interleukin 4 (IL-4) içeren yeni ortamla değiştirerek kuluçka gününün 6.</li>
	<li>24 saat sonra, RNA, protein veya akış sitometri analizleri için hücreleri hasat.<ol>
<li>Hücreler toplanmaya hazır olduğunda, hücreleri pbs ile çanak 2x yıkayın (RNA ekstraksiyonu için RT'de veya protein ekstraksiyonu için buzda soğutulur). Farklılaşmış makrofajlar artık plakalara sıkıca bağlandığından, plakadaki hücreleri doğrudan RNA ve protein analizleri için malzeme elde etmek için lyse.</li>
		<li>Akış sitometrisi için malzeme nin toplanması için, 2 mM EDTA içeren PBS'yi tabağa ekleyin, hücreleri 37 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın, hücreleri çanaktan nazikçe kazıyın ve standart protokollere geçmeden önce içindekileri 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde toplayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Akış sitometrisi
<ol><li>Culturing ortamını çıkarmak için PBS'deki hücreleri durula. 100.000 hücreyi (her akış sitometrisi durumu başına) aşağı doğru döndürün ve 2 μL HuFcR bağlayıcı inhibitörü içeren 100 μL PBS'de peleti yeniden askıya alın. 15 dakika RT'de kuluçka.</li>
	<li>Önerilen miktarlarda 50 μL boyama tamponu ve istenilen antikorlar (burada CD80, CD83, CD163 ve CD209 kullanılmıştır) ekleyin.</li>
	<li>Yavaşça karıştırın ve 30 dakika karanlıkta 4 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>2 x PBS ile yıkayın ve numuneyi sitoflorimetre de çalıştırmadan önce 150 μL PBS'de lekeli hücreleri yeniden askıya alın.</li>
</ol>

<ol><li>Slim, J., Saling, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+Management+of+Inflammation+in+the+HIV+Population%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Research+International%22%5BJournal%5D)">A Review of Management of Inflammation in the HIV Population.</a> Biomedical Research International. 2016, 3420638(2016).</li>
<li>Herskovitz, J., Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+and+the+Macrophage%3A+From+Cell+Reservoirs+to+Drug+Delivery+to+Viral+Eradication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).</li>
<li>Machado Andrade, V., Stevenson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+and+Viral+Factors+Influencing+Interplay+between+the+Macrophage+and+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).</li>
<li>Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Monocyte%2FMacrophages+during+HIV%2FSIV+Infection+in+Adult+and+Pediatric+Acquired+Immune+Deficiency+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1693(2017).</li>
<li>Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biology+of+Monocytes+and+Dendritic+Cells%3A+Contribution+to+HIV+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis.</a> Viruses. 10 (2), (2018).</li>
<li>Davis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+M1%2FM2+polarization+dynamically+adapts+to+changes+in+cytokine+microenvironments+in+Cryptococcus+neoformans+infection%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection.</a> MBio. 4 (3), e00264(2013).</li>
<li>Raggi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Human+Macrophage+M1-M2+Polarization+Balance+by+Hypoxia+and+the+Triggering+Receptor+Expressed+on+Myeloid+Cells-1%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1097(2017).</li>
<li>Van Overmeire, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-CSF+and+GM-CSF+Receptor+Signaling+Differentially+Regulate+Monocyte+Maturation+and+Macrophage+Polarization+in+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Research. 76 (1), 35-42 (2016).</li>
<li>Vogel, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+macrophage+polarization+in+vitro%3A+maturation+and+activation+methods+compared%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared.</a> Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).</li>
<li>Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+subsets+of+peripheral+blood+dendritic+cells+show+distinct+phenotypic+and+functional+abnormalities+in+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection.</a> AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).</li>
<li>Ciesek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+TRAIL-dependent+cytotoxicity+of+CD1c-positive+dendritic+cells+in+chronic+hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Viral+Hepatitis%22%5BJournal%5D)">Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection.</a> Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).</li>
<li>Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1-infected+monocyte-derived+dendritic+cells+do+not+undergo+maturation+but+can+elicit+IL-10+production+and+T+cell+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).</li>
<li>Hearps, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+infection+induces+age-related+changes+to+monocytes+and+innate+immune+activation+in+young+men+that+persist+despite+combination+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy.</a> AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).</li>
<li>Heggelund, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+toll-like+receptor+2+in+mononuclear+cells+from+HIV-infected+patients+induces+chemokine+responses%3A+possible+pathogenic+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences.</a> Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).</li>
<li>Hernandez, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+TLR2+and+TLR4+in+dendritic+cells+in+response+to+HIV+type+1+and+coinfection+with+opportunistic+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Research+and+Human+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).</li>
<li>Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+induces+the+first+signal+to+activate+the+NLRP3+inflammasome+in+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Intervirology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages.</a> Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).</li>
<li>Low, H. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR8+regulation+of+LILRA3+in+monocytes+is+abrogated+in+human+immunodeficiency+virus+infection+and+correlates+to+CD4+counts+and+virus+loads%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads.</a> Retrovirology. 13, 15(2016).</li>
<li>Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Impairment+of+Myeloid+Dendritic+Cells+during+Advanced+Stage+of+HIV-1+Infection%3A+Role+of+Factors+Regulating+Cytokine+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling.</a> PLoS ONE. 10 (10), e0140852(2015).</li>
<li>Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+negative+regulators+of+cytokine+signaling+during+chronic+HIV+disease+cause+functionally+exhausted+state+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells.</a> Cytokine. 91, 118-123 (2017).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li>
<li>Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Regulation+of+Macrophages+Polarization+by+MicroRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1175(2018).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Analyses+of+MicroRNA+Profiling+in+Interleukin-27+Treated+Monocyte-Derived+Human+Dendritic+Cells+Using+Deep+Sequencing%3A+A+Pilot+Study%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+miR-126-5p+Enhances+the+Inflammatory+Responses+of+Monocytes+to+Lipopolysaccharide+Stimulation+by+Suppressing+Cylindromatosis+in+Chronic+HIV-1+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection.</a> Journal of Virology. 91 (10), (2017).</li>
<li>Lodge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+MicroRNAs-221+and+-222+Inhibit+HIV-1+Entry+in+Macrophages+by+Targeting+the+CD4+Viral+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor.</a> Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).</li>
<li>Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA-1236+inhibits+HIV-1+infection+of+monocytes+by+repressing+translation+of+cellular+factor+VprBP%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP.</a> PLoS ONE. 9 (6), e99535(2014).</li>
<li>Riess, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferons+Induce+Expression+of+SAMHD1+in+Monocytes+through+Down-regulation+of+miR-181a+and+miR-30a%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).</li>
<li>Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M2+Polarization+of+Human+Macrophages+Favors+Survival+of+the+Intracellular+Pathogen+Chlamydia+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae.</a> PLoS ONE. 10 (11), e0143593(2015).</li>
<li>Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+profiles+of+human+M-CSF-generated+macrophages+and+comparison+of+M1-markers+in+classically+activated+macrophages+from+GM-CSF+and+M-CSF+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin.</a> Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).</li>
<li>Lacey, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+GM-CSF-+and+macrophage-CSF-dependent+macrophage+responses+by+in+vitro+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models.</a> Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).</li>
<li>Tarique, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic%2C+functional%2C+and+plasticity+features+of+classical+and+alternatively+activated+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Sunulan protokol, monosit ve makrofajların incelenmesinde bir model olarak HIV ile enfekte olmuş deneklerin birincil hücrelerinin kullanımını göstermektedir. HIV+ cART geçiren hastalar birden fazla yıl enfeksiyon ile yaşamak ve aynı zamanda diğer co-enfeksiyonlar tehlikeye bağışıklık sistemi ile ilgili olabilir. HIV kronik enfeksiyon varlığında immünomodülasyon çalışma için, hücreler doğrudan hastalardan hasat edildi. MiRNA'ların hücre gelişimi ve farklılaşmasında önemli rol oynadığı gösterildiği için protokol...

İnsan immün yetmezlik virüs-1 (HIV-1) enfeksiyonu fırsatçı enfeksiyonlara ve edinsel immün yetmezlik sendromuna (AIDS) yol açabilen ciddi immün fonksiyon bozukluğuna neden olur. Hiv-enfekte hastalar cART geçiren düşük viral yükler ve normal CD4+ T hücre sayıları ile karakterize olmasına rağmen, bağışıklık sisteminin işleyişi bu kişilerde tehlikeye olabilir, kanser gelişme riski ile bağlantılı olan işlevsiz bir bağışıklık yanıtına yol açan1. CART'taki HIV hastalarında immün disfonksiyon mekanizmaları büyük ölçüde bilinmemektedir. Bu nedenle, hasta kaynaklı bağışıklık hücrelerinin karakterize ve biyoloji ve fonksiyon araştırılması mevcut HIV araştırmanın önemli bir bileşenidir.
Monositler ve makrofajlar bağışıklık yanıtlarının temel düzenleyicileridir ve HIV enfeksiyonu2,3,4,5'tetemel rol oynarlar. Heterojen ve plastik doğada makrofajlar klasik olarak aktive (M1) veya alternatif olarak aktive (M2) olarak sınıflandırılabilir. Deneysel koşullar belirlenirken bu genel sınıflandırma gerekli olmakla birlikte, makrofajların polarizasyon durumu çeşitli sitokinler6,7,8,9ile tersine çevrilebilir. Çeşitli çalışmalar monositler ve dendritik hücreler üzerinde HIV enfeksiyonu etkilerini araştırmış olsa da, monosit aracılı yanıtların moleküler detayları büyük ölçüde bilinmemektedir6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Bağışıklık hücresi regülasyonu ve fonksiyonu ile ilgili faktörler arasında, mikroRNA'lar (miRNA'lar), transkripsiyon sonrası gen ekspresyonunu düzenleyen kısa kodlamayan RNA'ların, büyük hücresel yollar (yani büyüme, farklılaşma, gelişme ve apoptoz) bağlamında önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir20. Bu moleküller, makrofajların fonksiyonel polarizasyonunu dikte etmek için gerekli transkripsiyon faktörlerinin önemli düzenleyicileri olarak tanımlanmıştır21. CART uygulanan HIV enfekte bireylerin monositlerde miRNA potansiyel rolü araştırılmıştır, ancak alanında ilerleme çok daha fazla çalışma gerektirir22,23,24,25,26. Bu makalede, miRNA'ları ve siRNA'ları HIV ile enfekte olmuş hastalardan ve kontrollerden birincil insan monositlerine dönüştürmek için optimize edilmiş bir yöntem tartışılmaktadır.
Bu protokol, teknik prosedürdeki süreklilik klinik numunelerle çalışırken gereksiz deneysel değişkenlerin ortadan kaldırılmasına yardımcı olduğu için, ticari olarak kullanılabilen reaktiflere ve kitlere dayanır. Bununla birlikte, yöntem önemli ipuçları sağlar (yani, plaka hücrelerinin yapışmasını teşvik etmek için serumsuz medya ile kaplanmış veya kısa kuluçka hücre sayısı). Ayrıca, bu protokolde kullanılan polarizasyon koşulları yayınlanan çalışma27,28,29türetilmiştir.

<table><tbody><tr><td>0.5M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Plastik Kan Alma Tüpleri, K 2 </td><td>EDTA BD Biosciences</td><td>366643</td><td></td></tr><tr><td>Parlak Leke Tamponu</td><td>BD Horizon</td><td>563794</td><td>Akış sitometrisi</td></tr><tr><td>CD14 PerCP</td><td>Invitrogen</td><td>46-0149-42</td><td>Akış sitometrisi konjuge antikor</td></tr><tr><td>CD163 BV711</td><td>BD Horizon</td><td>563889</td><td>Akış sitometrisi- konjuge antikor</td></tr><tr><td>CD209 BV421</td><td>BD Horizon</td><td>564127</td><td>Akış sitometrisi- konjuge antikor</td></tr><tr><td>CD80 FITC</td><td>BD Horizon</td><td>557226</td><td>Akış sitometrisi- konjuge antikor</td></tr><tr><td>CD83 APC</td><td>BD Horizon</td><td>551073</td><td>Flow sitometrisi- konjuge antikor</td></tr><tr><td>Easy 50 EasySep Mıknatıslı</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>18002</td><td></td></tr><tr><td>Easy Sep Doğrudan İnsan Monosit İzolasyon</td><td>Kiti Kök Hücre Teknolojileri</td><td>19669</td><td></td></tr><tr><td>EIF4EBP1 mAb</td><td>Hücre Sinyalizasyonu</td><td>9644</td> Western blot EIF4EBP1 siRNA Santa Cruz sc-29594 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> için Monoklonal antikor <tr><td>Fetal Bovin Serum Tanımlı Isı İnaktive Edilmiş</td><td>Hiklon</td><td>SH30070.03HI</td><td></td></tr><tr><td>Gallios Akış Sitometresi</td><td>Beckman Coulter</td><td>B43618</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH mAb</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-47724</td> Western blot HuFcR Bağlanma İnhibitörü <td>için Monoklonal antikor</td></tr><tr><td></td><td>eBiosciences</td><td>14-9161-73</td><td>Akış sitometrisi bloke edici tampon</td></tr><tr><td>Kaluza Analiz Yazılımı</td><td>Beckman Coulter</td><td>B16406</td><td>Akış sitometrisi verilerini analiz etmek için yazılım</td></tr><tr><td>Escherichia coli O55'ten lipopolisakkaritler:B5</td><td>Sigma</td><td>L4524</td><td></td></tr><tr><td>miRCURY LNA microRNA Mimic has-miR-146a-5p</td><td>Qiagen</td><td>YM00472124</td><td></td></tr><tr><td>MİSYON miRNA Negatif</td><td>Kontrol Sigma</td><td>HMC0002</td><td>Yakın kızılötesi boya ile konjuge karıştırılmış şifreli miRNA</td></tr><tr><td>Nunc 35mm Hücre Kültürü Kabı Thermo</td><td>Scientific</td><td>150318</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012027</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> Rekombinant İnsan GM-CSF 15140122 <td></td>Penisilin-Streptomisin <td>Gibco</td></tr><tr><td></td><td>R& D Sistemleri</td><td>215-GM-050</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan IFN-&gama;</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>285-IF-100</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan IL-4</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>204-IL-010</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan M-CSF</td><td>R& D Systems</td><td>216-MC-025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640, L-Glutamin</td><td>Corning</td><td>10040CVMP</td><td></td></tr><tr><td>Şifreli Kontrol siRNA</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-37007</td><td></td></tr><tr><td>Viromer Mavi Transfeksiyon Reaktif Kiti</td><td>Lipocalyx</td><td>VB-01LB-01</td><td></td></tr><tr><td>WST-1 Hücre Proliferasyon Reaktifi</td><td>Roche</td><td>5015944001</td><td>Hücre canlılığını değerlendirmek için kolorimetrik test</td></tr></tbody></table>

birincil İnsan monositlerinin İzolasyon, transfeksiyon ve kültürü

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) 1990'ların ortalarında kombine antiretroviral tedavi (cART) getirilmesine rağmen önemli bir sağlık sorunu olmaya devam etmektedir. Antiretroviral tedavi sistemik viral yükü etkin bir şekilde düşürürken ve normal CD4+ T hücre sayılarını geri getirirken, tamamen işlevsel bir bağışıklık sistemini yeniden oluşturmaz. CART uygulanan HIV-enfekte bireylerde işlevsiz bir bağışıklık sistemi bağışıklık aktivasyonu ile karakterize olabilir, bağışıklık hücrelerinin erken yaşlanma, ya da kalıcı inflamasyon. Bu koşullar, HIV enfeksiyonu ile ilişkili komorbid faktörler ile birlikte, kolayca hücresel ve hayvan modellerinde çoğaltılamaz hastalık, karmaşıklık ekleyin. Bu hastalarda immün disfonksiyonun altında yatan moleküler olayları araştırmak için, insan primer monositlerini in vitro olarak manipüle eden bir sistem sunulmuştur. Özellikle protokol, cART uygulanan HIV bulaşmış bireylerden ve HIV-negatif kontrollerden elde edilen birincil CD14+ monositlerin kültür ve transfeksiyonuna olanak sağlar. Yöntem, monositlerin ve monosit kaynaklı makrofajların izolasyon, kültür ve transfeksiyonu içerir. Ticari olarak mevcut kitler ve reaktifler kullanılırken, protokol miRNA mimikleri ve inhibitörleri ile monositlerin başarılı bir şekilde yapışması ve transfeksiyonu için önemli ipuçları ve optimize edilmiş koşullar sağlar.

Açıklanan prosedür kullanılarak, HIV ile enfekte bireyler ve sağlıklı donörlerin birincil insan monositleri izole edildi. Burada sunulan tüm veriler düşük (&lt;20 kopya/mL) veya tespit edilemeyen viral yükler ve normal CD4+ T hücre sayıları ile cART uygulanan HIV+</stron...

Burada sunulan izole etmek için optimize edilmiş bir protokoldür, culturing, transfecting, ve HIV enfekte bireyler ve sağlıklı kontroller insan birincil monositayırt.

Birincil İnsan Monositlerinin İzolasyon, Transfeksiyon ve Kültürü

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...

HIV enfeksiyonu saptanabilir virüs ile antiretroviral tedavi gören bireylerde bile bağışıklık disfonksiyonu na neden olur. Bu yöntem bağışıklık yanıtının temel düzenleyicileri olan monosit fonksiyonunun incelenmesine olanak sağlar. Bu tekniği insan birincil monositlerinin izolasyonu, kültürü ve transfeksiyonu için optimize ettik.Biz HIV enfekte bireylerde bağışıklık disfonksiyonu moleküler mekanizmaları anlamak için bu yöntemi kullanmak, ancak monositler içeren diğer bağışıklık çalışmaları uygulanabilir. Bu insan kanı ile çalışan ilk kez ise, uygun biyogüvenlik protokolleri takip etmek ve muhtemelen bulaşıcı malzeme olarak tüm örnekleri tedavi etmek için unutmayın. Dört 10 mililitre EDTA vakum tüpleri taze insan tam kan 40 mililitre topladıktan sonra, bir biyogüvenlik kabine tek bir 50 mililitre konik propilen tüp içine tüm kan aktarmak için steril tekniği kullanın.Seçilen bir insan monosit izolasyon kiti üreticinin talimatları na göre, kitten kan tüpüne monosit izolasyon kokteyli iki mililitre ekleyin ve 30 saniye boyunca kiti manyetik boncuk girdap. Kana iki mililitre boncuk ekleyin ve boncukları kanla dikkatlice karıştırmak için 25 mililitrelik serolojik pipet kullanın. Oda sıca

isolation-transfection-and-culture-of-primary-human-monocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, monositlerin tam insan kanından immünmanyetik negatif ayırma ile izolasyonunu gösteriyoruz. İzole edilmiş monositler, daha fazla aşağı akış analizi için kullanılabilir.

Monositlerin Tam Kandan İmmünomanyetik Negatif Seleksiyon ile İzolasyonu

Bu video, birincil monositlerin makrofajlara hazırlanmasını göstermektedir. Birincil insan monositleri, granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) kullanılarak M1 benzeri bir pro-inflamatuar fenotipe veya makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) kullanılarak M2 benzeri bir anti-inflamatuar fenotipe izole edilebilir ve farklılaştırılabilir.

İn Vitro Kültür ve Primer Monositlerin Makrofajlara Farklılaşması

Monosit türevli histiositlerinden doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir hücrelerdir. Burada, kullanımı kolay...

Bir<em&gt; In vitro</emİnsan Makrofaj Farklılaşma ve Polarizasyon heterojenliği Eğitim için&gt; Model

Akış sitometresi ile bağışık hücrelerin tanımlanmış alt grupları ile nanopartikül etkileşim analizi.

Sitometrisi ile Primer İmmün hücre alt Floresan Nanoparçacık Etkileşimleri Algılama

İnsan makrofaj üretimi için basit ve etkin bir protokol sunuyoruz. İnce beyaz kat çifte yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile işlenir ve izole edilmiş monositlerin, sonra Teflon kaplı bir hücre kültürü torbalarda makrofajlara ayrılır. Bu makrofaj verim maksimize ve daha sonraki deneyler için hücre hasat kolaylaştırır.

İnsan Çift Gradient Santrifüj ile Monositlerinde ve teflon kaplı Hücre Kültürü Çantalar Makrofagların Onların Farklılaşma İzolasyonu

Burada, translasyonel uygulamalar için heterojen kemik iliğinden büyük miktarlarda murin monositleri üreten bir protokol sunuyoruz. Diğerleriyle karşılaştırıldığında, bu yeni yöntem, kurban edilen hayvan sayısını azaltmaya yardımcı olur ve yüksek gradyanlı manyetik hücre ayırma (MACS) gibi pahalı yöntemlerden kaçınarak maliyetleri düşürür.

İzolasyon ve Kemirgen Kemik İliği intravenöz enjeksiyon Türetilmiş Monositler

Makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) farklılaşmış insan monosit türevi makrofajların hücre kültürü için bir protokol sunulmuştur. Protokol, monositlerin makrofajlara toplu farklılaşması ile birlikte dondurularak saklanmasını kullanır. Daha sonra hasat edilen makrofajlar daha sonra deneyler yapmak için gerekli hücre yoğunluklarında kültür kuyularına ekilebilir.

Makrofaj koloni stimüle edici faktör farklılaştırılmış insan monosit türevli makrofajlar Kültür

Bu çalışma, in vitro dendritik hücreler (DC'ler) elde etmek için iki farklı insan monosit izolasyonu yöntemini karşılaştırmaktadır. Monositler yapışma ile seçilir veya manyetik ayırma ile negatif olarak zenginleştirilir. Monosit verimi ve canlılığı ile MDDC canlılığı, proliferasyonu ve CD11c/CD14 yüzey marker ekspresyonu her iki yöntem arasında karşılaştırılacaktır.

Görüntüleme Sitometrisi ile İnsan Monosit türetilmiş dendritik hücrelerle Karakterizasyonu: İki Monosit İzolasyon Protokoller Arasında Bir Karşılaştırma

Bu protokol, insan kan örneklerinden monosit türevi makrofajlar (MDM) elde etmek için iş akışını, enflamatuar kaspaz Bimoleküler Floresan Kompleman (BiFC) muhabirlerini hücre canlılığı ve davranışından ödün vermeden insan MDM'sine verimli bir şekilde tanıtmak için basit bir yöntemi ve canlı hücrelerde enflamatuar kaspaz aktivasyonunu ölçmek için görüntüleme tabanlı bir yaklaşımı açıklamaktadır.

İnsan Monosit Kaynaklı Makrofajlarda İnflamatuar Kaspazların İndüklenen Yakınlığının Görselleştirilmesi

Bu çalışma, beyin iltihabının dolaylı olarak değerlendirilmesini sağlayan insan monosit türevli mikroglia benzeri (iMG) hücrelerin kurulması için yeni bir yaklaşımı tanımlamaktadır. Bu, beynin potansiyel iltihabına ve ilişkili nöropsikiyatrik bozukluklara odaklanan araştırmalar için faydalı olabilecek bir hücresel model sunar.

Ters Translasyonel Beyin Araştırmaları için İnsan Kanı Kaynaklı Mikroglia Benzeri Hücrelerin Mühendisliği

Farmakolojik ajanların naif monosit türevli dendritik hücrelerden in vitro olarak tolerojenik dendritik hücreler üretme kapasitesini değerlendirmek ve otolog düzenleyici T hücresi üretimi ile potansiyellerini doğrulamak için bir prosedür tanımladık.

İnsan CD14+ Monositlerinden Tolerojenik Dendritik Hücrelerin Üretilmesi için İmmünomodülatör Ajanları Test Etmek İçin Basit ve Etkili Bir Yöntem

Öğrenin, HIV enfekte bireylerden birincil insan monositlerinin izolasyonu, kültürü ve transfeksiyonu için optimize edilmiş bu protokolü. Bu yöntem, immün yanıt düzenleyicisi monosit fonksiyonunu incelemek ve immün disfonksiyon mekanizmalarını anlamak için kullanılır.

Birincil İnsan Monositlerinin İzolasyon, Transfeksiyon ve Kültürü

Daha fazla video keşfet