Name: Dönüşüm, Genom Düzenleme ve Fenotipleme Azot sabitleme Tropikal Cannabaceae Ağaç Parasponia andersonii (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Keşfedin Parasponia andersonii'de Agrobacterium tümefaciens aracılığıyla stabil dönüşüm ve CRISPR/Cas9 genom düzenleme protokolü. Bu yöntem, azot sabitleme simbiyozu ve bitki biyolojisi araştırmaları için transgenik mutant hatlar oluşturmayı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Mark Youles, Sophien Kamoun ve Sylvestre Marillonnet'i Addgene veritabanı nda Golden Gate klonlama parçalarını kullanıma savurduklarından dolayı kabul etmek isterler. Ayrıca, P. andersonii tohumları için E. James, P. Hadobas ve T. J. Higgens'a teşekkür ederiz. Bu çalışma Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü (NWO-VICI hibe 865.13.001; NWO-Açık Yarışma hibe 819.01.007) ve Endonezya Cumhuriyeti Araştırma, Teknoloji ve Yüksek Öğretim Bakanlığı (RISET-PRO hibe 8245-ID).

<ol><li>Clason, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((THE+VEGETATION+OF+THE+UPPER-BADAK+REGION+OF+MOUNT+KELUT+%28EAST+JAVA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+du+Jardin+Botanique+de+Buitenzorg%22%5BJournal%5D)">THE VEGETATION OF THE UPPER-BADAK REGION OF MOUNT KELUT (EAST JAVA).</a> Bulletin du Jardin Botanique de Buitenzorg. Serie III, 509-518 (1936).</li>
<li>Soepadmo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ulmaceae%5BTitle%5D)+AND+%22Flora+Malesiana-Series+1%2C+Spermatophyta%22%5BJournal%5D)">Ulmaceae.</a> Flora Malesiana-Series 1, Spermatophyta. 8, 31-76 (1974).</li>
<li>Becking, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rhizobium+symbiosis+of+the+nonlegume+Parasponia%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Nitrogen+Fixation%22%5BJournal%5D)">The Rhizobium symbiosis of the nonlegume Parasponia.</a> Biological Nitrogen Fixation. , 497-559 (1992).</li>
<li>Oldroyd, G. E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speak%2C+friend%2C+and+enter%3A+signalling+systems+that+promote+beneficial+symbiotic+associations+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Speak, friend, and enter: signalling systems that promote beneficial symbiotic associations in plants.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 252-263 (2013).</li>
<li>Gutjahr, C., Parniske, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+developmental+biology+of+arbuscular+mycorrhiza+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell and developmental biology of arbuscular mycorrhiza symbiosis.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 593-617 (2013).</li>
<li>van Velzen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+of+the+nonlegume+Parasponia+reveals+insights+into+evolution+of+nitrogen-fixing+rhizobium+symbioses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics of the nonlegume Parasponia reveals insights into evolution of nitrogen-fixing rhizobium symbioses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, E4700-E4709 (2018).</li>
<li>van Velzen, R., Doyle, J. J., Geurts, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Resurrected+Scenario%3A+Single+Gain+and+Massive+Loss+of+Nitrogen-Fixing+Nodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">A Resurrected Scenario: Single Gain and Massive Loss of Nitrogen-Fixing Nodulation.</a> Trends in Plant Science. 24, 49-57 (2019).</li>
<li>Griesmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenomics+reveals+multiple+losses+of+the+nitrogen-fixing+root+nodule+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phylogenomics reveals multiple losses of the nitrogen-fixing root nodule symbiosis.</a> Science. 1743, eaat1743(2018).</li>
<li>Becking, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root-Nodule+Symbiosis+Between+Rhizobium+And+Parasponia+%28Ulmaceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Soil%22%5BJournal%5D)">Root-Nodule Symbiosis Between Rhizobium And Parasponia (Ulmaceae).</a> Plant and Soil. 51, 289-296 (1979).</li>
<li>van Zeijl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-Mediated+Mutagenesis+of+Four+Putative+Symbiosis+Genes+of+the+Tropical+Tree+Parasponia+andersonii+Reveals+Novel+Phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis of Four Putative Symbiosis Genes of the Tropical Tree Parasponia andersonii Reveals Novel Phenotypes.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 284(2018).</li>
<li>Cao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+Agrobacterium+rhizogenes%E2%80%93mediated+root+transformation+of+Parasponia+and+Trema+is+temperature+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Growth+Regulation%22%5BJournal%5D)">Efficiency of Agrobacterium rhizogenes–mediated root transformation of Parasponia and Trema is temperature dependent.</a> Plant Growth Regulation. 68, 459-465 (2012).</li>
<li>Limpens, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+Agrobacterium+rhizogenes-transformed+roots+of+Arabidopsis+and+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">RNA interference in Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula.</a> Journal of Experimental Botany. 55, 983-992 (2004).</li>
<li>Boisson-Dernier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+rhizogenes-Transformed+Roots+of+Medicago+truncatula+for+the+Study+of+Nitrogen-Fixing+and+Endomycorrhizal+Symbiotic+Associations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium rhizogenes-Transformed Roots of Medicago truncatula for the Study of Nitrogen-Fixing and Endomycorrhizal Symbiotic Associations.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 14, 695-700 (2001).</li>
<li>Kumagai, H., Kouchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Silencing+by+Expression+of+Hairpin+RNA+in+Lotus+japonicus+Roots+and+Root+Nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 16, 663-668 (2003).</li>
<li>Nilsson, O., Olsson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+root%3A+The+role+of+the+Agrobacterium+rhizogenes+rol+genes+in+the+formation+of+hairy+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Physiologia+Plantarum%22%5BJournal%5D)">Getting to the root: The role of the Agrobacterium rhizogenes rol genes in the formation of hairy roots.</a> Physiologia Plantarum. 100, 463-473 (1997).</li>
<li>Davey, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+Nodulation+of+Micro-Propagated+Shoots+of+the+Non-Legume+Parasponia+andersonii+by+Bradyrhizobium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Effective Nodulation of Micro-Propagated Shoots of the Non-Legume Parasponia andersonii by Bradyrhizobium.</a> Journal of Experimental Botany. 44, 863-867 (1993).</li>
<li>Webster, G., Poulton, P. R., Cocking, E. C., Davey, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nodulation+of+micro-propagated+plants+of+Parasponia+andersonii+by+tropical+legume+rhizobia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">The nodulation of micro-propagated plants of Parasponia andersonii by tropical legume rhizobia.</a> Journal of Experimental Botany. 46, 1131-1137 (1995).</li>
<li>Op den Camp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LysM-type+mycorrhizal+receptor+recruited+for+rhizobium+symbiosis+in+nonlegume+Parasponia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">LysM-type mycorrhizal receptor recruited for rhizobium symbiosis in nonlegume Parasponia.</a> Science. 331, 909-912 (2011).</li>
<li>Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modular+Cloning+System+for+Standardized+Assembly+of+Multigene+Constructs%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Modular Cloning System for Standardized Assembly of Multigene Constructs.</a> PLOS ONE. 6, e16765(2011).</li>
<li>Nekrasov, V., Staskawicz, B. J., Weigel, D., Jones, J. D. G., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+the+model+plant+Nicotiana+benthamiana+using+Cas9+RNA-guided+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in the model plant Nicotiana benthamiana using Cas9 RNA-guided endonuclease.</a> Nature Biotechnology. 31, 691-693 (2013).</li>
<li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+On+Lysogenesis.+I.+The+Mode+Of+Phage+Liberation+By+Lysogenic+Escherichia+Coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Studies On Lysogenesis. I. The Mode Of Phage Liberation By Lysogenic Escherichia Coli.</a> Journal of Bacteriology. 62, 293-300 (1951).</li>
<li>Engler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Golden+Gate+modular+cloning+toolbox+for+plants%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">A Golden Gate modular cloning toolbox for plants.</a> ACS Synthetic Biology. 3, 839-843 (2014).</li>
<li>Fauser, F., Schiml, S., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+CRISPR%2FCas-based+nucleases+and+nickases+can+be+used+efficiently+for+genome+engineering+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Both CRISPR/Cas-based nucleases and nickases can be used efficiently for genome engineering in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 79, 348-359 (2014).</li>
<li>Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+Transformation-Competent+Arabidopsis+Genomic+Library+in+Agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A DNA Transformation-Competent Arabidopsis Genomic Library in Agrobacterium.</a> Biotechnology. 9, 963-967 (1991).</li>
<li>Op den Camp, R. H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N+Nonlegume+Parasponia+andersonii+Deploys+A+Broad+Rhizobium+Host+Range+Strategy+Resulting+in+Largely+Variable+Symbiotic+Effectivenes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">N Nonlegume Parasponia andersonii Deploys A Broad Rhizobium Host Range Strategy Resulting in Largely Variable Symbiotic Effectivenes.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 25, 954-963 (2012).</li>
<li>Graham, P. H., Viteri, S. E., Mackie, F., Vargas, A. T., Palacios, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+acid+soil+tolerance+among+strains+of+Rhizobium+phaseoli%5BTitle%5D)+AND+%22Field+Crops+Research%22%5BJournal%5D)">Variation in acid soil tolerance among strains of Rhizobium phaseoli.</a> Field Crops Research. 5, 121-128 (1982).</li>
<li>Martinez-Romero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhizobium+tropici%2C+A+Novel+Species+Nodulating+Phaseolus+vulgaris+L.+Beans+and+Leucaena+sp.+Trees%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Systematic+and+Evolutionary+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rhizobium tropici, A Novel Species Nodulating Phaseolus vulgaris L. Beans and Leucaena sp. Trees.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 41, 417-421 (1991).</li>
<li>Felten, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ectomycorrhizal+Fungus+Laccaria+bicolor+Stimulates+Lateral+Root+Formation+in+Poplar+and+Arabidopsis+through+Auxin+Transport+and+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Ectomycorrhizal Fungus Laccaria bicolor Stimulates Lateral Root Formation in Poplar and Arabidopsis through Auxin Transport and Signaling.</a> Plant Physiology. 151, 1991-2005 (1991).</li>
<li>Trouvelot, A., Kough, J. L., Gianinazzi-Pearson, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesure+du+taux+de+mycorhization+VA+d%E2%80%99un+systeme+radiculaire.+Recherche+de+methods+d%E2%80%99estimation+ayant+une+signification+fonctionnelle%5BTitle%5D)+AND+%22Aspects+Physiologiques+et+Genetiques+des+Mycorhizes%22%5BJournal%5D)">Mesure du taux de mycorhization VA d’un systeme radiculaire. Recherche de methods d’estimation ayant une signification fonctionnelle.</a> Aspects Physiologiques et Genetiques des Mycorhizes. , 217-221 (1986).</li>
<li>Schenk, R. U., Hildebrandt, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium+and+techniques+for+induction+and+growth+of+monocotyledonous+and+dicotyledonous+plant+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures.</a> Canadian Journal of Botany. 50, 199-204 (1972).</li>
<li>Becking, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parasponia+parviflora+-+Rhizobium+symbiosis.+Host+specificity%2C+growth+and+nitrogen+fixation+under+various+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Soil%22%5BJournal%5D)">The Parasponia parviflora - Rhizobium symbiosis. Host specificity, growth and nitrogen fixation under various conditions.</a> Plant and Soil. 75, 309-342 (1983).</li>
<li>Hoagland, D. R., Arnon Revised, D. I., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Water-Culture+Method+for+Growing+Plants+without+Soil%5BTitle%5D)+AND+%22Circular+California+Agricultural+Experiment+Station%22%5BJournal%5D)">The Water-Culture Method for Growing Plants without Soil.</a> Circular California Agricultural Experiment Station. 347, 1-32 (1950).</li>
<li>Wang, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWang%2C+K+%22Methods+in+Molecular+Biology%3A+Agrobacterium+Protocols%22">Methods in Molecular Biology: Agrobacterium Protocols</a>. 1, Humana Press. (2015).</li>
<li>Smulders, M. J. M., de Klerk, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+in+plant+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Growth+Regulation%22%5BJournal%5D)">Epigenetics in plant tissue culture.</a> Plant Growth Regulation. 63, 137-146 (2011).</li>
<li>Larkin, P. J., Scowcroft, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somaclonal+variation+%E2%80%94+a+novel+source+of+variability+from+cell+cultures+for+plant+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Theoretical+and+Applied+Genetics%22%5BJournal%5D)">Somaclonal variation — a novel source of variability from cell cultures for plant improvement.</a> Theoretical and Applied Genetics. 60, 197-214 (1981).</li>
<li>Cannon, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legume+genome+evolution+viewed+through+the+Medicago+truncatula+and+Lotus+japonicus+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Legume genome evolution viewed through the Medicago truncatula and Lotus japonicus genomes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 14959-14964 (2006).</li>
<li>Tuskan, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genome+of+Black+Cottonwood%2C+Populus+trichocarpa+%28Torr.+%26+Gray%29%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Genome of Black Cottonwood, Populus trichocarpa (Torr. & Gray).</a> Science. 313, 1596-1604 (2006).</li>
<li>Young, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Medicago+genome+provides+insight+into+the+evolution+of+rhizobial+symbioses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses.</a> Nature. 480, 520(2011).</li>
<li>Sato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Structure+of+the+Legume%2C+Lotus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Research%22%5BJournal%5D)">Genome Structure of the Legume, Lotus japonicus.</a> DNA Research. 15, 227-239 (2008).</li>
<li>Xing, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR%2FCas9+toolkit+for+multiplex+genome+editing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants.</a> BMC Plant Biology. 14, 327(2014).</li>
<li>Lowder, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR%2FCas9+Toolbox+for+Multiplexed+Plant+Genome+Editing+and+Transcriptional+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">A CRISPR/Cas9 Toolbox for Multiplexed Plant Genome Editing and Transcriptional Regulation.</a> Plant Physiology. 169, 971(2015).</li>
<li>van Zeijl, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avan+Zeijl%2C+A+%22Dissecting+Hormonal+Pathways+in+Nitrogen-Fixing+Rhizobium+Symbioses%22">Dissecting Hormonal Pathways in Nitrogen-Fixing Rhizobium Symbioses</a>. , Wageningen University. (2017).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Baklagiller ve uzaktan ilişkili Cannabaceae cinsi Parasponia, azot sabitleme rizobiası ile endosimbiyotik ilişki kurabilen ve kök nodülleri oluşturabilen bitki türlerinin sadece iki clad'ını temsil eder. Her iki clades türleri arasındaki karşılaştırmalı çalışmalar son derece bu simbiyoz sağlayan çekirdek genetik ağlar içine anlayışlar sağlamak için ilgilidir. Şu anda, genetik çalışmalar ağırlıklı olarak baklagiller yapılır; özellikle iki model tür M. truncatula ve L. japonicus. Ek bir deneysel platform sağlamak ve bir nodulating olmayan baklagil ile karşılaştırmalı çalışmaları kolaylaştırmak için, burada p. andersoniiistikrarlı dönüşüm ve ters genetik analizler için ayrıntılı bir protokol açıklar. Sunulan protokolde T0 transgenik P. andersonii hatlarının in vitro yayılımı, A. tumefaciens co-cultivation'dan sonra 4 ay içinde fenotipik analize başlanmasına olanak tanımıştır. Bu baklagiller33istikrarlı dönüşümü için kurulmuş olan mevcut protokoller önemli ölçüde daha hızlıdır. Bu P. andersonii çekici bir araştırma modeli yapar.
Burada açıklanan protokol birkaç kritik adım içerir. Bunlardan ilki tohum çimlenmesiyle ilgilidir. Çimlenme için P. andersonii tohumları hazırlamak için, tohumlar meyveleri izole edilmesi gerekir. Bu bir kağıt mendil parçası veya bir çay elek içine karşı çilek sürtünme tarafından yapılır. Bu işlemin, tohum katın zarar görmesini önlemek için nazikçe yapılması gerekir. Eğer tohum kat zarar görürse, çamaşır suyu sterilizasyon sırasında tohum girebilirsiniz, hangi tohum canlılığını azaltır. Tohum atıllığını kırmak için tohumlar 10 günlük sıcaklık döngüsüne tabi tutulur. Ancak, bu tedaviye rağmen, çimlenme tamamen senkronize değildir. Genellikle, ilk tohumları radicle ortaya çıkması göstermek 7 gün sonra, ama diğerleri çimlenmek için birkaç gün daha uzun sürebilir.
Dönüşüm prosedüründeki kritik noktalar başlangıç materyalinin seçimi ve ortak yetiştirme adımının süresi ile ilgilidir. Verimli dönüşümulaşmak için, başlangıç malzemesi olarak steril olmayan sera yetiştirilen bitkilerin sağlıklı ve genç kaynaklanıyor veya petioles kullanmak en iyisidir. Genç dalların büyümesini sağlamak için, parasponia ağaçlarını her 2-3 ayda bir kesmeniz ve yılda bir kez ağaçları yenilemeleri tavsiye edilir. Ayrıca, ortak yetiştirme adımı sadece 2 gün için yapılmalıdır. Uzun süreli birlikte yetiştirme A. tumefaciens tarafından doku ekbitkileri aşırı kolonizasyon teşvik ve genellikle dönüşüm verimliliğini azaltır. A. tumefaciens tarafından aşırı kolonizasyon önlemek için de düzenli olarak eksültasyon ekili olan plakaları yenilemek için önemlidir. Aşırı kolonizasyon meydana gelirse, doku eksperiler yıkanabilir (Bkz. Bölüm 3.8) A. tumefaciens hücreleri kaldırmak için. Yıkamada kullanılan SH-10 çözeltisine çamaşır suyu eklemenizi tavsiye ederiz (son konsantrasyon: ~%2 hipoklorit). Bu ek yıkama adımının ağır enfekte ekbitkilerde işe yaramayabileceğini unutmayın (Şekil 2B). CRISPR/Cas9 yapısı ile yapılan bir dönüşümün sadece sınırlı sayıda putatif olarak dönüştürülmüş sürgünler üretmesi veya belirli bir genin mutagenezinin rejenerasyonda sorunlara yol açması bekleniyorsa, boş bir vektör kontrol yapısının pozitif kontrol. Son olarak, seçilen tüm transgenik çizgilerin bağımsız T-DNA tümleştirme olaylarından kaynaklandığından emin olmak önemlidir. Bu nedenle, bir eksplantın her iki tarafından sadece tek bir putatif-transgenik çekim almak için talimat. Ancak, bunun potansiyel bağımsız hat sayısını azalttığının farkındayız. Birçok satır gerekirse, araştırmacılar bu calli 'nin ≥2 mm boyutu ve kültürü bu calli bağımsız olduğunda putatif olarak dönüştürülmüş calli'yi orijinal ekspekten ayırmaya karar verebilirler. Bu şekilde, her eksplanttan birden fazla hat izole edilebilir, bu da potansiyel transgenik çizgilerin sayısını yükseltir.
Mevcut protokolde P. andersonii'nin transgenik çizgileri in vitro yayılım yoluyla bitkisel olarak yayılır. Bunun avantajı birçok transgenik plantlets nispeten kısa bir süre içinde oluşturulabilir olmasıdır. Ancak, bu yöntemde de çeşitli sınırlamalar vardır. Öncelikle, in vitro yayılım yoluyla T0 transgenik hatların bakımı emek yoğun ve istenmeyen genetik veya epigenetik değişikliklere neden olabilir34,35. İkinci olarak, T0 çizgileri hala Antibiyotik direnci kaseti de dahil olmak üzere T-DNA'sının bir kopyasını içerir. Bu, her yeniden dönüştürme için farklı seçim işaretleri gerektiğinden, olası yeniden dönüşüm lerin sayısını sınırlar. Şu anda, biz sadece kanamisin veya higromisin seçimi (veri gösterilmez) kullanarak dönüşüm test ettik. Ayrıca, T0 transgenik hatlarında Cas9 kodlama dizisi nin ve sgRNA'ların varlığı tamamlayıcı çalışmaları karmaşıkhale getirmiştir. Tamamlayıcı tahliller mümkündür, ancak sgRNA hedef alanının(lar) mutasyona uğramasını gerektirir, çünkü tamamlayıcı yapının gen düzenlemesi engellenir. Üçüncü olarak, T0 hatları ile çalışan bir dezavantajı CRISPR / Cas9 mutantlar chimeric olabilir. Simerik mutant hatlarının henotik analizini önlemek için, en az 3 farklı çekimde in vitro yayılım sonrası genotipleme analizini tekrarlamanızı öneririz. Burada açıklanan protokol kullanılarak elde edilen şimerik mutantların sayısı sınırlı olmasına rağmen, zaman zaman10gözlenir. T0 hatları ile çalışma sınırlamaları aşmak için, P. andersonii mutant hatları generatively yayılabilir. P. andersonii ağaçları dioecious ve rüzgar-tozlaşma2. Bu, her transgenik çizginin erkek ve dişi çiçeklerin tek bir birey üzerinde üretilmesi ve daha sonra çapraz tozlaşmanın oluşmaması gibi yetiştirilmesi gibi manipüle edilmesi gerektiği anlamına gelir. P. andersonii hızlı büyüyen bir ağaç olduğu için tropikal bir serada (28 °C, ~%85 bağıl nem) önemli miktarda yer gerektirir. Bu nedenle, teknik olarak mümkün olsa da, P. andersonii transgenik hatlarının generatif yayılımı lojistik açıdan zordur.
Protokol bölümünde P. andersoniinodulation için 3 yöntem açıklanmıştır. Plaka ve kese sistemlerinin avantajı, köklerin kolayca erişilebilir olmasıdır, bu da bakterilerin nokta aşılanmasına ve zamanla nodül oluşumunu takiben izin verebilir. Ancak, plaka sistemi oldukça emek yoğun, hangi daha az büyük ölçekli nodulation deneyler için uygun hale getirir. Kese sisteminin bir dezavantajı mantar kontaminasyonunu önlemenin zor olmasıdır. Keseler steril değildir ve bu nedenle poğaçanın üst yarısında genellikle mantar büyümesi görülür. Ancak, bu P. andersonii büyümesini etkilemez, ve bu nedenle nodulation tahlilleri ile müdahale etmez. Ayrıca, kese sistemi sadece fideler için uygundur. Çeşitli girişimlere rağmen, biz torbalarda in vitro yayılım yoluyla elde edilen plantlets büyümek mümkün olmuştur.
Burada açıklanan P. andersonii ters genetik boru hattı mevcut A. rhizogenestabanlı kök dönüşüm yöntemi11ile karşılaştırıldığında önemli bir iyileşme sunuyor. Açıklanan prosedürler kullanılarak, kararlı transgenik hatlar verimli bir şekilde oluşturulabilir ve in vitro yayılım yoluyla muhafaza edilebilir. Buna karşılık, A. rhizogenes dönüşümü geçicidir ve sadece transgenik köklerin oluşumuna neden olabilir. Çünkü her transgenik kök bağımsız bir dönüşümden kaynaklanır, A. rhizogenes transformasyon tabanlı tahliller önemli bir henotik varyasyon muzdarip. Bu varyasyon kararlı çizgiler durumunda çok daha azdır, ancak in vitro yayılım da bir miktar varyasyon oluşturur. Bu azaltılmış varyasyon ve birden fazla plantlets her kararlı çizgi için fenotip olabilir gerçeği nedeniyle, kararlı çizgiler a. rhizogenes-dönüştürülmüş kökleri ile karşılaştırıldığında nicel tahliller için daha uygundur. Ayrıca, kararlı dönüşüm endojen hormon dengesini etkileyen A. rhizogenes kök indükleyici lokus giriş bağlı değildir (rol) endojen hormon dengesini etkiler15. Bu nedenle, kararlı çizgiler daha iyi hormon homeostaz dahil genlerin ters genetik analizi için uygundur A. rhizogenes-dönüştürülmüş kökleri ile karşılaştırıldığında. Araştırma modeli olarak P. andersonii daha genel bir avantajı yeni bir bütün genom çoğaltma (WGD) yaşamadı olmasıdır. Baklagil Papilionoideae alt familyası, model baklagiller M. truncatula ve L. japonicusiçerir, yanı sıra Salicaceae (sipariş Malpighiales) model ağaç Populus trichocarpa deneyimli WGDs ~65 içerir milyon yıl önce36,37. Bu WGD'lerden kaynaklanan birçok paralog gen kopyası M. truncatula, L. japonicus ve P. trichocarpa37,38,39, ters genetik analizleri zorlaştırabilecek fazlalık. P. andersonii yeni bir WGD deneyimi yoktu gibi, P. andersonii üzerinde ters genetik analizler paralogous gen kopyalarının gereksiz işleyişinden daha az etkilenebilir.
Birlikte ele alındığında, Biz P. andersoniiters genetik analiz için ayrıntılı bir protokol sağlar. Bu protokol kullanılarak, tek mutant hatları verimli bir zaman dilimi içinde oluşturulabilir 2-3 ay10. Bu protokol, diğer bitki türleri40,41,42için gösterildiği gibi, aynı anda farklı genleri hedefleyen sgRNA'ların çoklama yoluyla daha yüksek sıra mutantlar oluşturmak için uzatılabilir. Ayrıca, burada açıklanan kararlı dönüşüm prosedürü CRISPR/Cas9 gen hedeflemesi ile sınırlı değildir, ancak diğer yapı türlerini tanıtmak için de kullanılabilir (örn. organizatör-muhabir tahlilleri, ektopik ifade veya trans- tamamlayıcı). Azot sabitleme rhizobia veya endomycorrhizal mantarları ile karşılıklı ortakyaşamları incelemek için karşılaştırmalı bir araştırma modeli olarak P. andersonii'yi kurduk. Ancak, burada açıklanan protokoller aynı zamanda bu tropik ağacın biyolojisinin diğer yönlerini incelemek için araçlar sağlar, örneğin odun oluşumu, bi-cinsel çiçeklerin geliştirilmesi veya Cannabaceae'ye özgü ikincil metabolitlerin biyosentezi gibi.

Parasponia andersonii, Kenevir ailesine (Cannabaceae) ait tropik bir ağaçtır vePapua Yeni Gine ve birkaç Pasifik Adaları 1,2,3'e özgüdür. 4 ek Parasponia türü ile birlikte, rhizobia ile azot sabitleme nodül simbiyoz kurabilirsiniz sadece non-baklagiller soy temsil eder. Bu simbiyoz iyi baklagiller (Fabaceae) modelleri Medicago truncatula ve Lotus japonicusçalışılmıştır , hangi nodül oluşumu moleküler genetik doğası ayrıntılı bilgi edinme sonuçlandı ve işleyişi4. Ayrıca baklagillerde kök nodül simbiyozçok çok daha eski ve yaygın arbusküler micorrhizal simbiyoz5üzerine kurulduğu gösterilmiştir. Filogenomik karşılaştırmalar, baklagiller, Parasponia,azot sabitleme nodül simbiyozlar yanı sıra, diazotrofik Frankia bakteri barındıran sözde actinorhizal bitki türleri, ortak bir evrimsel kökene sahip olduğunu göstermektedir 6,7,8. Baklagil nodül oluşumunda rol aldığı tespit edilen genlerin korunmuş genetik temelin bir parçası olup olmadığını belirlemek için baklagil dışı türler üzerinde yapılan çalışmalar esastır. Bu amaçla, p. andersonii'yi baklagillerin yanı sıra, kök nodül oluşumu ve işleyişinin altında yatan çekirdek genetik ağları tanımlamak için karşılaştırmalı bir araştırma modeli olarak kullanmayı öneriyoruz.
P. andersonii volkanik tepelerin yamaçlarında bulunabilir bir öncüdür. Ayda 45 cm'lik büyüme hızlarını karşılayabilir ve 10metreyekadar 9 metreye ulaşabilir. P. andersonii ağaçları rüzgar-tozlaşma, hangi ayrı erkek ve dişi çiçekler3,10oluşumu ile kolaylaştırılır. Yakın zamanda P. andersonii'nindiploid genomunu (2n = 20; 560 Mb/1C) sıraladık ve açıklamaladık ve 2 ek Parasponia türünün taslak genom dizilerini bir araya getirdik; P. rigida ve P. rugosa6. Bu ortaya ~ 35,000 P. andersonii gen modelleri içinde kümelenebilir >20,000 ortogruplar m. truncatulagenleri ile birlikte , soya (Glisin max), Arabidopsis thaliana, ormanlık çilek ( Fragaria vesca), Trema orientalis, siyah pamuk kavak (Populus trichocarpa) ve okaliptüs (Okaliptüs grandis)6. Ayrıca, M. truncatula ve P. andersonii arasındaki transkripsiyon karşılaştırmaları, her iki türde de nodül geliştirilmiş ifade deseni gösteren 290 putatif ortolog kümesini tanımlamışlardır6. Bu karşılaştırmalı çalışmalar için mükemmel bir kaynak sağlar.
P. andersonii kökleri ve nodüllerde gen fonksiyonunu incelemek için Agrobacterium rhizogenes-aracılı kök dönüşümü için bir protokol oluşturulmuştur11. Bu protokol kullanılarak, transgenik kökleri taşıyan bileşik bitkiler nispeten kısa bir zaman diliminde oluşturulabilir. Bu yöntem, aynı zamanda, yaygın baklagil-simbiyoz araştırma12,13,14uygulanır. Ancak, bu yöntemin dezavantajı sadece köklerin dönüştürülmesi ve her transgenik kökün bağımsız bir dönüşüm olayını temsil ederek önemli bir değişime yol açarak ortaya çıkan bir durumdur. Ayrıca, dönüşüm geçicidir ve transgenik çizgiler sürdürülemez. Bu, A. rhizogenesbazlı kök dönüşümünü CRISPR/Cas9 aracılı genom düzenlemesi için daha az uygun hale getirir. Ayrıca, A. rhizogenes kök indükleyen locus aktarAn (rol) bitki genomuna genler, hangi kez hormon homeostaz15müdahale ifade . Bu a. rhizogenes-dönüştürülmüş kökleri zorlu bitki hormonlarının rolünü çalışma yapar. Bu sınırlamaları aşmak için, son zamanlarda Agrobacterium tumefaciens-tabanlı dönüşüm ve CRISPR / Cas9-P. andersonii10aracılı mutagenezi için bir protokol geliştirdi.
Burada, P. andersoniiiçin geliştirilen A. tumefacienstabanlı dönüşüm prosedürü ve ters genetik boru hattının ayrıntılı bir açıklamasını salıyoruz. Ayrıca, simbiyotik etkileşimleri incelemek için tahliller de dahil olmak üzere transgenik plantetlerin aşağı doğru kullanımı için protokoller salıyoruz. Burada açıklanan protokol kullanılarak, 2-3 aylık bir süre içinde birden fazla transgenik hat oluşturulabilir. CRISPR/Cas9 aracılı mutagenez ile birlikte, bu nakavt mutant hatları verimli nesil sağlar. Bu mutant çizgiler vegetatif in vitro 10,16,17, dönüşüm prosedürü sonra 4 ay içinde henotipik karakterizasyon başlatmak için oluşturulacak yeterli malzeme sağlar yayılır olabilir 10başlatıldı . Birlikte, bu prosedürler insa edilen bu laboratuvar, herhangi bir laboratuvarın, bu tropik ağacın biyolojisinin potansiyel olarak diğer yönlerini nisabı ve mikizobial ilişkime yönelik çalışmalar için bir araştırma modeli olarak p. andersonii'yi benimsemesine olanak vermelidir.

<table><tbody><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0640</td><td>NAA</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biyokimya</td><td>M1503.0250</td><td>MES</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td>Asetosyringone</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>X1402.1000</td><td>X-Gal</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>101236</td><td>Nükleik asit elektroforez jeli</td><td></td></tr> <tr><td>için -</td><td></td> <td>Torbalar kutu malzemesi, askılar</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>101188</td><td>NH4NO3</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3408-1G</td><td>BAP</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>100156</td><td>H 3BO 3</td><td></td></tr> <tr><td>Thermo-Fisher</td><td>ER1011</td><td>Golden Gate klonlama düzeneğinde</td><td></td>kısıtlama enzimi olarak kullanılır</tr><tr><td>Thermo-Fisher</td><td>15561020</td><td>Golden Gate klonlama düzeneğinde</td><td></td>kullanılan</tr><tr><td>Merck</td><td>137101</td><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>C0111.0025</td><td>C16H16N5O7S2Na</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-Fisher</td><td>K1231</td><td>Genotipleme prosedüründe künt uçlu PCR amplikonlarının klonlanması için kullanılır</td> Agronutrition AP2011 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Mikorizasyon testi için kullanılan Rhizophagus irregularis DAOM 197198 (1.000 spor/mL) içeren</td> Merck 102790 CuSO4&middot;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> 5H2O</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>D1004.1000</td><td>Bitki doku kültürü için kullanılır agar bazlı ortam</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>105101</td><td>K2HPO4</td><td></td></tr><tr><td>VWR Kimyasalları</td><td>20302.293</td><td>Na2&middot; EDTA</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biyokimya</td><td>M0803.1000</td><td>C6H14O6</td><td></td></tr> <tr><td>Thermo-Fisher</td><td>ER0291</td><td>Golden Gate klonlama düzeneğinde</td><td></td>kısıtlama enzimi olarak kullanılır</tr><tr><td>Merck</td><td>100983</td><td>C 2H 5OH</td><td></td></tr><tr><td>VWR Kimyasalları</td><td>BDH9232-500G</td><td>EDTA</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377600-1PAK</td><td>Selofan membran</td><td></td></tr><tr><td>Biomatters, Ltd.</td><td>R9 veya üstü</td><td>sgRNA'ların in silico klonlanması ve tasarımı için biyoinformatik yazılımı</td> Mega Uluslararası-Teknik bilgiler https://mega-international.com/tech-info/ Sigma-Aldrich 65882'de Nodül dokularını sabitlemek için kullanılır VWR Kimyasalları 24385.295-Vink 219341 Torbalar kutu malzemesi, alt <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> parça</td><td></td></tr><tr><td>Leica Biosystems</td><td>14702218311</td><td>Plastik gömme</td><td></td>için şablon olarak kullanılır</tr><tr><td>Merck</td><td>100317</td><td>HCl</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5386-1G</td><td>IBA</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>103862</td><td>C6H54FeO7</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>103965</td><td>FeSO<alt>4</alt>O&orta nokta; 7H < alt > 2 < / alt > O</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa</td><td>Biyokimya I1401.0005</td><td>IPTG</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biyokimya</td><td>K0126.0010</td> <td>ve nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2000</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>105886</td><td>MgSO4O&middot; 7H2O</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>105934</td><td>MnCl2&middot; 4H2O</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>102786</td><td>MnSO4O</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>M1002.1000</td><td>Bakteri kültürü için kullanılır agar bazlı ortam</td><td></td></tr><tr><td>Manutan</td><td>92007687</td><td>Torbalar malzeme</td><td></td></tr><tr><td>Paraxisdienst</td><td>130774</td><td>Elastik sızdırmazlık folyosu</td><td></td></tr><tr><td>Rhenen</td><td>Agra-Perlit No.3'ü</td> <td>çekinNodülasyon tahlili için saksılarda yetiştirme substratı olarak kullanılır</td> VWR Chemicals 391-0581 Selofan membranlar için kap olarak kullanılır Thermo-Fisher F130WH Transgenik hatların genotiplenmesi için Addgene 50337 Seviye 0 sonlandırıcı, 3'<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> </td><td></td><td> UTR, 35s (Karnabahar Mozaik Virüsü)</td><td></td></tr> <tr><td>Addgene </td><td>48017</td><td>2 seviye bir parçayı seviye 2 alıcıya</td><td></td>monte etmek için uç bağlantı 2</tr><tr><td>Addgene </td><td>48018</td><td>3 seviye bir parçayı seviye 2 alıcıya</td><td></td>monte etmek için uç bağlantı</tr> 3 <tr><td>Addgene </td><td>48001</td><td>Seviye 1 alıcı. Pozisyon 5. İleri yönlendirme</td><td></td></tr><tr><td>Addgene </td><td>48007</td><td>Seviye 1 Alıcı. Pozisyon 1. Ters yönlendirme</td><td></td></tr><tr><td>Addgene </td><td>50268</td><td>Seviye 0 promotör (0.4 kb), 35s (Karnabahar Mozaik Virüsü) + 5' UTR ve Omega; (Tütün Mozaik Virüsü)</td><td></td></tr><tr><td>Addgene </td><td>46966</td><td>CRISPR/Cas9 modülü</td><td></td>tasarlamak için kullanılır</tr><tr><td>Addgene </td><td>46968</td><td>CRISPR/Cas9 modülü</td><td></td>tasarlamak için kullanılır</tr><tr><td>Addgene </td><td>50334</td><td>Seviye 0 Kanamisin/Neomisin/Paromomisin direnç kaseti</td><td></td></tr><tr><td>Topzeven-Spor</td><td></td> süspansiyonunu <td></td><td>yıkamak için filtre olarak kullanılır</td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>8.17003</td><td>PEG400</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>E1674.0001</td><td>Büyümek için saksılar Parasponia fidancıklar</td><td></td>/fideler</tr><tr><td>Merck</td><td>104871</td><td>KH2PO4</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>105033</td><td>KOH</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>105153</td><td>K2SO4O</td><td></td></tr><tr><td>Van Leusden bv </td><td>-</td><td>Mikorizasyon testi için büyüyen substrat olarak kullanılır</td>: Duchefa Biochemie S0225.0050 SH-bazal tuz ortamı Duchefa Biochemie S0411.0250 SH-vitamin karışımı Lehle Tohumları VIS-02 Kararlı dönüşümün yıkama aşamasında iyonik olmayan yüzey aktif madde olarak kullanılır Merck 137017 NaCl <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VWR Kimyasalları</td><td>89230-072</td><td>C6H11NaO7</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>106521</td><td>Na2MoO4&middot; 2H2O</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>106574</td><td>Na2HPO4&middot; 7H2O</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>567549</td><td>NaH2PO4&middot; H2O</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>239313</td><td>Na2SO4O</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biyokimya</td><td>S0809.5000</td><td>C12H22O11</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-Fisher</td><td>B69</td><td>Golden Gate klonlama düzeneğinde</td><td></td>kullanılır Thermo-Fisher</tr><tr><td></td><td>EL0013</td><td>Golden Gate klonlama düzeneğinde</td><td></td>kullanılır</tr><tr><td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td><td>64708806</td><td>Metil metakrilat bazlı reçine tozu</td><td></td></tr><tr><td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td><td>64709003</td><td>HEMA (2-hidroksietil metakrilat) bazlı reçine çözeltisi</td><td></td></tr><tr><td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td><td>66022678</td><td>Metil metakrilat bazlı reçine çözeltisi</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>1159300025</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Acros</td><td>189350250</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>VWR Kimyasalları</td><td>663684B</td><td>Polisorbat 20</td><td></td></tr><tr><td>Stout Perspex-torbalar</td><td></td> <td>kutu malzemesi, kapak</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>Y1333.1000</td> <td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>108816</td><td>ZnCl2</td><td></td></tr><tr><td>Alfa Aesar</td><td>33399</td><td>ZnSO4O&middot; 7H<alt>2</alt>O</td><td></td></tr></tbody></table>

dönüşüm, genom düzenleme ve fenotipleme azot sabitleme tropikal cannabaceae ağaç parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii, Kenevir ailesine (Cannabaceae) ait hızlı büyüyen bir tropikal ağaçtır. 4 ek tür ile birlikte, rhizobium ile azot sabitleme nodül simbiyoz kurmak mümkün bilinen tek baklagil olmayan soy oluşturur. Baklagiller ve P. andersonii arasındaki karşılaştırmalı çalışmalar kök nodül oluşumunun altında yatan genetik ağlara değerli bir bakış açısı sağlayabilir. Karşılaştırmalı çalışmaları kolaylaştırmak için, yakın zamanda P. andersonii genomunu sıraladık ve Agrobacterium tumefaciens-aracılı kararlı dönüşüm ve CRISPR/Cas9 tabanlı genom düzenlemesini kurduk. Burada P. andersoniiiçin geliştirilen dönüşüm ve genom düzenleme prosedürlerinin ayrıntılı bir açıklamasını salıyoruz. Buna ek olarak, simbiyotik fenotiplerin tohum çimlenmesi ve karakterizasyonu için prosedürleri açıklar. Bu protokol kullanılarak 2-3 aylık bir sürede stabil transgenik mutant hatları oluşturulabilir. T0 transgenik hatlarının vitro yayılımı nda vegetatif, A. tumefaciens co-cultivation'dan 4 ay sonra fenotilik deneylerin başlatılmasını sağlar. Bu nedenle, bu protokol sadece marjinal geçici Agrobacterium rhizogenesdaha uzun sürer -P. andersoniiiçin kullanılabilir tabanlı kök dönüşüm yöntemi , ancak birkaç net avantajlar sunuyor. Burada açıklanan prosedürler, P. andersonii'nin simbiyotik çağrışımları ve bu tropik ağacın biyolojisinin potansiyel olarak diğer yönlerini anlamayı amaçlayan çalışmalarda bir araştırma modeli olarak kullanılmasına izin verebilmektedir.

P. andersonii trees 28 °C ve ~% 85 bağıl nem (Şekil1A)şartlı serada yetiştirilebilir. Bu şartlar altında ağaçlar dikimden 6-9 ay sonra çiçeklenmeye başlarlar. Dişi P. andersonii çiçekleri her biri tek bir tohum içeren meyveleri üretir. Olgunlaşma sırasında, çilek renk değiştirir; önce yeşilden beyaza, daha sonra beyazdan kahverengiye (Şekil1B). Olgunlaşmış kahverengi meyvelerden elde edilen tohumlar, 10 günlük sıcaklık döngüsü nden ve SH-0 plakalarında 7 günlük kuluçkadan sonra iyice çimlenir (Şekil1C). Çimlenmiş tohumlar ~ 4 hafta sonra deney için kullanılabilir genç fideler haline gelişmeye devam (Şekil1D).
Daha önce genç P. andersonii saplarının petiollerinin ve segmentlerinin A. tumefaciens zorlanma AGL110kullanılarak verimli bir şekilde dönüştürülebileceğini göstermiştir. Dönüşüm işleminin başlangıcında doku eksplandisi 21 °C'de 2 gün boyunca A. tumefaciens (Şekil2A)ile birlikte yetiştirilir. Uzun süreli birlikte ekim, doku eksedelerinin A. tumefaciens tarafından aşırı kolonizasyonuna neden olur ve bu nedenle önlenmelidir (Şekil 2B). Ortak ekim döneminden sonra, doku ekspertisi selektif ortama aktarılır, bu da dönüştürülmüş dokunun büyümesini teşvik eder. İki ila üç hafta sonra, küçük yeşil mikro-calli genellikle orijinal yara yüzeyi boyunca gözlenir (Şekil2C). Bu calli, dönüşüm prosedürü başlatıldıktan 6-8 hafta sonra 1 veya daha fazla putatif olarak dönüştürülmüş sürgünler geliştirmeye ve büyümeye devam etmelidir (Şekil2D). Bu aşamada, dönüşüm verimliliği genellikle olgun ve kısmen odunsu dallardan alınan doku ekspları ile başlatılan dönüşümler için~10-30% arasında değişmektedir (Tablo 7). Henüz çiçek taşımayan dalların genç ve hızla büyüyen uçlarından alınan eksültasyonlarla dönüşümler başlatılırsa , ~65-75% dönüşüm verimliliği elde edilebilir (Tablo7). Bazen, beyazımsı calli orta ile temas halinde olmayan bir eksplant tarafında oluşur ve bu nedenle, kanamisin seçimi deneyimi yok. Bu calligenellikle transgenik değildir ve bu calli oluşan herhangi bir sürgünler genellikle çamaşır suyu ve kanamisin içeren orta ile doğrudan temas tan sonra ölür (Şekil2E). Dönüşüm oranının düşük olması ve/veya başlangıç materyalinin suboptimal olması durumunda, doku parçaları kahverengiye dönüşebilir (Şekil2F) ve A. tumefaciens (Şekil2G)tarafından aşırı çoğalma görülebilir. A. tumefaciens yayılmasını önlemek için ve yakındaki ekstesyenler overgrowing, orta düzenli ferahlık gereklidir, ve ciddi enfekte eksültüle çıkarılması gerekir. Bireysel transgenik sürgünler yayılma ortamına yerleştirildikten sonra, A. tumefaciens tarafından aşırı çoğalma genellikle artık oluşmaz (Şekil2H). Transgenik sürgünler in vitro yayılım yoluyla çarpılabilir, bu da bir aylık bir süre içinde onlarca sürgüne yol açar (Şekil3A-B). Bu sürgünler ~ 2 hafta sonra kök oluşumunu neden olmalıdır kökleme orta, yerleştirilebilir (Şekil3C-D). Köklü plantasyonlar daha sonra deney için kullanılabilir.
Nakavt mutant hatları oluşturmak için, CRISPR / Cas9 aracılı mutagenez yararlanmak. Bu amaçla, kanamisin direnç geni NPTIIiçeren bir ikili vektör kullanmak , Bir Cas9 kodlama dizisi CaMV35S organizatörü ve 2 sgRNA hedef gen başına atU6pküçük RNA organizatörü ifade edilmektedir 2. P. andersonii'nin CRISPR/Cas9 aracılı mutagenezi için kullanılan yapının grafiksel gösterimi Şekil 4A'daverilmiştir. Bu yöntem kullanılarak, genom düzenleme putatif olarak dönüştürülmüş sürgünler ~% 40 gözlenir10. Mutant hatları tanımlamak için, putatif olarak dönüştürülmüş sürgünler, hedeflenen bölgeye yayılan astarlar kullanılarak sgRNA hedef bölgesinde mutasyonlar için genotiplenir. Beklenen sonuçların bir örneği Şekil4'te verilmiştir. Jel elektroforezinden sonra çekilen fotoğraftan da görüleceği gibi, çeşitli örnekler yabani tipe benzer büyüklükte bir PCR amplicon üretir (Şekil4B). Bu bitkiler agarose jel elektroforezi ile görüntülenemeyen veya Cas9 enzimi tarafından düzenlenmemiş kalan küçük indeller içerebilir. Ayrıca, çeşitli örnekler, vahşi tipten farklı boyutlarda bantlar verir (örneğin, Şekil 4B'dekisatır 2, 4, 7 ve 8). Bu satırlarda, 1 (satır 4, 7 ve 8) veya her ikisi (satır 2) aleller kolayca görüntülenebilen daha büyük indeller içerir. Hedef alandaki mutasyonların tam niteliği PCR amplicon dizilimi nden sonra ortaya konur. Şekil4C'den de görülebileceği gibi, hem 1-4 bp'lik küçük indeller, hem de CRISPR/Cas9 mutagenezinden sonra daha büyük silmeler elde edilebilir. Şekil4C'de, satır 1'in sırası, bu satırın düzenlemeden kaçtığını ve bu nedenle atılması gerektiğini belirten vahşi türle aynıdır. Mutasyon içeren çizgiler arasında heterozigot, homozigot ve çift allelik mutantlar saptanabilir (Şekil4C). Ancak, heterozigot mutantlar genellikle nadirdir10. Homozigot veya çift allelic nakavt mutantlar vegetatively phenotik analiz için yeterli malzeme elde etmek için yayılabilir. T0 kuşağında henotik analiz yapıldığından mutant hatlarının chimeric olup olmadığını nisbeten kontrol etmek önemlidir. Bu amaçla, genotipleme her mutant hattından alınan en az 3 farklı örnek üzerinde tekrarlanması gerekir. Genotipleme sonuçları birbiriyle aynı ysa ve orijinal genotipleme örneği (şekil 4D'deki 8. satır) çizgi homojen bir şekilde mutasyona uğrar ve daha fazla analiz için kullanılabilir. Ancak, genotipleme sonuçları bağımsız örnekler arasında farklılık gösterirse (örneğin, Şekil 4D'dekisatır 4), mutant çizgisi chimerictir ve atılması gerekir.
P. andersonii'nin M. plurifarium BOR2 ile aşılanması kök nodüllerinin oluşumuna neden olabilir (Şekil 5). Şekil5A'da da görüleceği gibi, bu nodüller kök sistemi boyunca dağıtılır. P. andersonii nodülleri açık kahverengi renktedir ancak şekillerine göre kök dokusundan kolayca ayırt edilebilirler (Şekil 5B). Saksılarda aşılama deneyleri ve 4-6 hafta sonraki büyüme genellikle ~10-30 nodül oluşumuna neden olabilir (Şekil6A). Benzer sayıda nodül, ekm plakalı p. andersonii bitkilerinin aşılamadan 4 hafta sonra aşılanmasından sonra oluşur (Şekil6A). Poşetlerde, P. andersonii fideleri genellikle 5 hafta sonra aşılamada ~5-15 nodül oluştururlar (Şekil5C-D, 6A). Nodül sitomimarisini analiz etmek için nodüller kesitlenebilir ve parlak alan mikroskobu ile gözlenebilir. Şekil 6B, P. andersonii nodülünün ortasından boylamsal bir kesit örneği gösterir. Bu bölümde, enfekte hücreleri içeren nodül lobları ile çevrili bir P. andersonii nodülün merkezi vasküler demeti gösterilmektedir (Şekil6B).
P. andersonii plantlets de mycorrhized olabilir. R. irregularis<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59971/59971fig01.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59971/59971fig01large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59971/59971fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59971/59971fig02large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59971/59971fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59971/59971fig03large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59971/59971fig4v2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59971/59971fig4v2large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59971/59971fig05.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59971/59971fig05large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59971/59971fig06.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59971/59971fig06large.jpg" target="_blank"></a><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59971/Supplementary_Table%201.xlsx" target="_blank"></a>

Parasponia andersonii, Kenevir ailesine (Cannabaceae) ait olan ve rizobium ile birlikte azot sabitleme kökü nodülleri oluşturabilen hızlı büyüyen tropikal bir ağaçtır. Burada, Agrobacterium tumefaciens-aracılı kararlı dönüşüm ve CRISPR/Cas9 tabanlı genom düzenlemesine dayalı P. andersonii'de ters genetik analizler için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Dönüşüm, Genom Düzenleme ve Fenotipleme Azot sabitleme Tropikal Cannabaceae Ağaç Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Parasponia rizom ile bir azot sabitleme simbiyoz kurmak mümkün Esrar ailesinden tropikal bir ağaçtır. Parasponia ve baklagiller arasındaki karşılaştırmalı çalışmalar rhizobium simbiyoz altında yatan çekirdek genetik ağlar içine fikir sağlayabilir. Bu protokol ile, Parasponia andersonii kararlı transgenik mutant hatları iki ila üç aylık bir süre içinde oluşturulabilir.Bu çizgiler in vitro yayılım yoluyla verimli bir şekilde yayılabilir. Bu protokol, bu tropik ağacın biyolojisinin diğer yönlerinin yanı sıra rizobiyal simbiyoz üzerinde çalışmak için deneysel bir platform sağlar. Doku kültürü ve moleküler klonlama temel becerileri bu protokolü uygulamak için yeterlidir.Bu herhangi bir laboratuvar araştırma modeli olarak Parasponia adapte sağlar. Prosedürü gösteren doktora öğrencileri Titis Wardhani ve Yuda Roswanjaya marijke Hartog, bizim laboratuvarda bir teknisyen ile birlikte olacaktır. Parasponia andersonii ağaçları büyümek için, tohumları çimlenme ile başlar.Bir çay eleğinin içine sürtünme veya kağıt mendil bir parça üzerinde ezme parasponia çilek tohumları çıkarın. 15 ila 20 dakika boyunca % 4 hipoklorit çamaşır suyu kullanarak tohumları dezenfekte edin ve sonra tohumları altı kez sterilsu ile yıkayın. Tohumları steril 200 mikrolitre PCR tüpüne aktarın ve tohumları batırmak için tüpleri steril suyla doldurun.Tüpleri el yazması talimatlara göre bir termocycler 10 gün kuluçkaya yatırın. 10 günlük kuluçkadan sonra tohumları SH-0 plakalarına aktarın ve kurumasını önlemek için iki kat elastik sızdırmazlık folyosu ile kapatın. 28 derecede 16 saatlik bir gün, sekiz saatlik gece döngüsü ile üç ila dört hafta kuluçka.Fideler ilk gerçek yapraklarını geliştirdikten sonra, onları ticari çömlekçilik toprağıyla dolu tencerelere aktarın ve kurumasını önlemek için yarı saydam plastik bir kap ile kaplayın. 16 saat, sekiz saatlik gece rejimi altında 28 derece santigrat, % 85 bağıl nem iklim odası veya sera tencere yerleştirin. Bir hafta sonra, plastik bardak çıkarın.Düzenli olarak tencere su ve ağaç büyümesini sürdürmek için gübre ile ek. Serada yetişen ağaçlardan beş ila sekiz santimetrelik genç dalları toplayarak, sadece sağlıklı, enfekte olmayan dalları kullanmayı önleyerek dönüşüme hazırolun. Yaprakları kesin, her petiole sonunda yaprak dokusunun bir santimetre kare kare bırakarak.15 dakika boyunca 2% hipoklorit ağartıcı ile polisorbat 20 birkaç damla içeren doku dezenfekte ve sonra otoklavlı su ile sekiz kez durulayın. Agrobacterium hücrelerini 25 mililitre lik bir infiltrasyon ortamıile yaklaşık beş optik yoğunluğa yeniden askıya alın. Kök ve petiole dokuyu hücre süspansiyonunun içinde bir santimetrelik parçalara kesin.Yaprak dokuları çıkarın ve 10 ila 30 dakika hücre süspansiyon kök ve petiole parçaları inkübe. Doku parçalarını steril bir filtre kağıdı üzerine kurutun ve el yazması talimatlara göre hazırlanmış kökleme ortamına yerleştirin. Plakaları karanlıkta 21 derecede iki gün kuluçkaya yatırın.İki gün sonra, mantar veya bakteriyel kontaminasyon için plakaları inceleyin ve kontamine plakaları atın. Doku parçalarını el yazması talimatlara göre hazırlanan 10 mililitre SH-10 ortamına aktarın. En az 10 dakika orta doku bırakın ve yavaşça yıkamak için her iki ila üç dakikada bir çalkalayın.El yazması yönlere göre cefotaxime ve kanamisin ile kökleme ortamı hazırlayın ve plaka dökün. Steril filtre kağıdı parçaları üzerinde dokuları kurulayın ve plakalara aktarın. 16 saat, sekiz saatlik gece rejimi altında 28 santigrat derecede yedi gün boyunca kuluçka plakaları.Her iki günde bir mantar veya bakteriyel kontaminasyon için plakaları kontrol edin. Kontaminasyon oluşursa, enfekte olmayan doku parçalarını yeni bir tabağa aktarın. Yedi gün sonra, el yazması talimatlara göre hazırlanan doku parçalarını yayılma ortamına aktarın ve 16 saat, sekiz saatlik bir gece rejimi altında 28 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Transgenik sürgünler gelişene kadar haftada bir tabakları yenileyin ve enfekte olmayan doku parçalarını yeni plakalara aktarın. Bir kez putatif transgenik sürgünler en az bir santimetre uzunluğunda, sürgünler kesmek ve antibiyotik ile yayılma orta bağımsız olarak kültür. Sürgünlerin bağımsız dönüştürücüleri temsil etmesini sağlamak için, bir ekstronun her iki tarafından yalnızca tek bir çekim çekin.Yayılım orta taze bir plaka üzerinde yaklaşık 10 sürgünler yerleştirerek ve elastik sızdırmazlık folyo iki kat ile plaka kapatarak doku yaymak. Plakaları 16 saatlik, sekiz saatlik bir rejim altında 28 derecede kuluçkaya yatırın ve bu adımı dört haftada bir tekrarlayın. Sürgünler bir santimetre uzunluğa ulaştığında, tabanlarından kesin ve kökleme ortamına yerleştirin.Çekimin bazal ucunu ortama yerleştirerek çekimleri dik olarak yerleştirin. Yaklaşık 10 sürgünler tek bir plaka üzerine yerleştirilebilir. Rhizobium inoculum hazırlayarak başlayın.Mesorhizobium plurifarium BOR2 kolonisinden 10 mililitre sıvı YEM ortamı aşıla ve iki gün boyunca 28 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Sıvı YEM orta daha büyük bir hacim aşılamak için bu kültürü kullanın. Bir kez büyüdükten sonra, hücreleri hasat için 3, 500 kez g 10 dakika boyunca bakteri kültürü santrifüj.Sıvı EKM ortamdaki bakteriyel peleti yeniden askıya alın ve optik yoğunluğunu belirleyin. Yaklaşık 20 tencere için yeterli olan üç litre EKM ortamı hazırlayın ve rizobial süspansiyon ile aşılamak. Orta ve 1,25 kilogram perliti karıştırın ve steril yarı saydam polipropilen kaplara bu karışımın 210 gramını ekleyin.Her pota bir ila üç Parasponia andersonii plantlets bitki ve kontrol yapısı ile dönüştürülmüş plantlets ile çeşitli tencere hazırlamak. Tencerebirkaç tartMak ve ışık maruz kalma kökleri korumak için her tencerenin alt kapağı. Tencereleri 16 saat, sekiz saatlik gece rejimi altında 28 derecede, 16-6 hafta boyunca iklimlendirilmiş bir büyüme odasında kuluçkaya yatırın.Haftada bir kez, su kaybını belirlemek için birkaç tencere tartın. Su kaybı 10 mililitreyi aşarsa, kaybı telafi etmek için ultra saf su ile tamamlayın. Kuluçkadan sonra, perlit kökleri temiz ve bir dürbün kullanarak nodül numaralarını belirlemek.Bu teknik, Agrobacterium strain AGL1 ile petioles ve Parasponia andersonii kaynaklanıyor segmentleri başarıyla dönüştürmek için kullanılmıştır. İlk olarak, doku eksplants iki gün boyunca Agrobacterium ile birlikte yetiştirilir. Uzun süreli birlikte ekimi bakteriyel aşırı kolonizasyonla sonuçlanır ve önlenmelidir.Birkaç hafta sonra, küçük yeşil mikro-calli orijinal yara yüzeyi boyunca gözlenir. Bu calli büyümeye devam ve dönüşümün başlamasından sonra altı ila sekiz hafta bir veya daha fazla putatif dönüştürülmüş sürgünler geliştirmek. Dönüşüm verimliliği, olgun dallardan doku ekspları için %10-30 ile genç ve hızla büyüyen dallardan gelen doku ekspları için %65-75 arasında değişmektedir.Transgenik sürgünler in vitro yayılım yoluyla çarpılabilir, bu da bir ay içinde onlarca sürgüne yol açar. Bu sürgünler yaklaşık iki hafta içinde kök oluşumunu neden olacak ve deney için kullanılabilecek bitkiler verim köklendirme orta yerleştirilebilir. Kararlı bir dönüşüm denemesi başlatırken, kaynak malzeme olarak sağlıklı dalları seçmek önemlidir.Parasponia T0 transgenik hatları in vitro olarak yayılır. Bu nedenle, iyice genotip Parasponia transgenik hatları esastır. Parasponia'nın deneysel bir model olarak kurulması, uzakbir şekilde birbirine bağlı iki nodulating soy, Parasponia ve baklagiller arasında karşılaştırmalı analiz sağlar.Bu, rhizobium simbiyozun altında yatan genetik ağların korunmasını belirleyebilir. Parasponia da ahşap oluşumu, biseksüel çiçek gelişimi veya Cannabaceae özgü ikincil metabolitlerin biyosentezi gibi diğer araştırma konuları incelemek için değerli bir model olabilir.

transforming-genome-editing-phenotyping-nitrogen-fixing-tropical

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

DNA, düzeneğini kullanarak çok CRISPR vektörleri CRISPR çok sayıda yapı yapım tek klonlama reaksiyonda paralel yapılabilir basit bir işlem vektörleri. Domates kıllı kökleri CRISPR vektörleri doğrulamak ve mutant malzemeleri üretmek için mükemmel bir model sistem.

Domates Tüylü Roots Üretimi ile yüksek verim CRISPR Vektör İnşaat ve DNA Değişiklikler Karakterizasyonu

Organizatörü ifade analizleri gen düzenlemesi anlayış ve hedef genlerin kronolojik zamanmekansal ifade geliştirmek için büyük önem taşımaktadır. Burada biz tanımlamak, ayırma ve bir bitki organizatörü klon için bir protokol mevcut. Ayrıca, ortak fasulye kıllı kökleri nodül özgü organizatörü karakterizasyonu açıklar.

Bitki organizatörü analizleri: Kimlik ve kök nodül belirli organizatörü ortak fasulye içinde karakterizasyonu

Bu iletişim kuralı kopya numarası değişimler tüm genom dizi tabanlı Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH) analizi yürütmektedir ilgilenen araştırmacılar için deneysel adımlar ve reaktifler, ekipman ve çözümleme araçları hakkında bilgi sağlar bitkiler.

Dizi tabanlı Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon için bir Platform verimli algılama varyasyonları kopya numarası hızlı nötron kaynaklı Medicago truncatula mutantlar içinde

Preassembled Cas9 kullanan karmaşık Ribonükleoprotein (RNP) kesin, verimli genom düzenleme için güçlü bir yöntemdir. Burada, biz yararını hücreleri ve organizmalar, geniş aralığında birincil insan hücreleri ve her iki klasik de dahil olmak üzere ve model organizmalar gelişmekte olan vurgulayın.

Gelişmiş genom Cas9 Ribonükleoprotein yılında çeşitli ile hücreleri ve organizmaların düzenleme

Agrobacterium aracılı dönüşümü daldırma çiçek yöntemini kullanarak başarılı bir şekilde Schrenkiella parvulaextremophyte modelinin kararlı transgenik satırları oluşturmak için istihdam edilebilir. Biz bundan farklı büyüme alışkanlıkları ve extremophyte fizyolojik özellikleri dikkate alınarak Arabidopsis thalianaiçin değiştirilmiş bir iletişim kuralı mevcut.

Bitki büyüme ve Floral daldırma dönüşümün Agrobacterium aracılı Extremophyte Schrenkiella parvula

Çeşitli çalışma alanlarında model bir tür olarak çok yönlü uygulaması nedeniyle, dar yapraklı muzda (Plantago lanceolata) genetik dönüşüm araç setine ihtiyaç vardır.  Burada, Agrobacterium tumefaciens aracılı transformasyon kullanılarak,% 20'lik bir dönüşüm verimliliğine sahip stabil transgenik çizgilerle sonuçlanan bir protokol sunulmuştur.

Agrobacterium tumefaciens-Dar Yapraklı Muzun Aracılı Genetik Transformasyonu

Bu çalışmada, bambuda Agrobacterium'un aracılık ettiği planta gen ekspresyonu ve gen düzenleme yönteminde yeni bir yöntem geliştirilmiştir. Bu yöntem, bambu ıslah sürecini hızlandırmak için önemli etkileri olan bambuda gen fonksiyon doğrulamasının verimliliğini büyük ölçüde artırdı.

Burada: Planta Moso Bambu Yapraklarında Gen İfadesi ve Gen Düzenleme

Protokol , Arabidopsis birincil çiçeklenme sapları ve Brassica napus hipokotilleri kullanılarak tüylü kök indüksiyonunu açıklar. Tüylü kökler kültürlenebilir ve transgenik bitkileri yenilemek için eksplant olarak kullanılabilir.

Arabidopsis thaliana ve Brassica napus'ta Tüylü Kök Dönüşümü ve Rejenerasyonu

Bu makale, entomopatonik (EPN: böcek-parazitik) nematod ve gelişmekte olan bir genetik model olan Steinernema hermaphroditum'da CRISPR-Cas9 aracılı genom mühendisliğini göstermektedir. Anlatılan teknoloji, mutantların yaratılması için faydalıdır ve nematod biyolojisinde karşılıklı ve parazitik simbiyozla ilgili gen fonksiyonlarının aydınlanmasını sağlar.

Entomopatotik Steinernema hermaphroditum nematodunda CRISPR-Cas9 tabanlı mutageze ve mutant hatların korunması

Burada, hücre izolasyonundan dizileme sonuçlarının temel analizine kadar, genom çapında memeli replikasyon zamanlamasını haritalamak için nispeten hızlı ve basit bir yaklaşımı açıklıyoruz. Protokolü takiben temsili bir replikasyon programının genomik haritası sağlanacaktır.

DNA İçerik Ölçüm tarafından Memeli Çoğaltma Zamanlama genom Tayini

Keşfedin Parasponia andersonii'de Agrobacterium tümefaciens aracılığıyla stabil dönüşüm ve CRISPR/Cas9 genom düzenleme protokolü. Bu yöntem, azot sabitleme simbiyozu ve bitki biyolojisi araştırmaları için transgenik mutant hatlar oluşturmayı sağlar.

Dönüşüm, Genom Düzenleme ve Fenotipleme Azot sabitleme Tropikal Cannabaceae Ağaç Parasponia andersonii

Daha fazla video keşfet