Dönüşüm, Genom Düzenleme ve Fenotipleme Azot sabitleme Tropikal Cannabaceae Ağaç Parasponia andersonii

Parasponia rizom ile bir azot sabitleme simbiyoz kurmak mümkün Esrar ailesinden tropikal bir ağaçtır. Parasponia ve baklagiller arasındaki karşılaştırmalı çalışmalar rhizobium simbiyoz altında yatan çekirdek genetik ağlar içine fikir sağlayabilir. Bu protokol ile, Parasponia andersonii kararlı transgenik mutant hatları iki ila üç aylık bir süre içinde oluşturulabilir.

Bu çizgiler in vitro yayılım yoluyla verimli bir şekilde yayılabilir. Bu protokol, bu tropik ağacın biyolojisinin diğer yönlerinin yanı sıra rizobiyal simbiyoz üzerinde çalışmak için deneysel bir platform sağlar. Doku kültürü ve moleküler klonlama temel becerileri bu protokolü uygulamak için yeterlidir.

Bu herhangi bir laboratuvar araştırma modeli olarak Parasponia adapte sağlar. Prosedürü gösteren doktora öğrencileri Titis Wardhani ve Yuda Roswanjaya marijke Hartog, bizim laboratuvarda bir teknisyen ile birlikte olacaktır. Parasponia andersonii ağaçları büyümek için, tohumları çimlenme ile başlar.

Bir çay eleğinin içine sürtünme veya kağıt mendil bir parça üzerinde ezme parasponia çilek tohumları çıkarın. 15 ila 20 dakika boyunca % 4 hipoklorit çamaşır suyu kullanarak tohumları dezenfekte edin ve sonra tohumları altı kez sterilsu ile yıkayın. Tohumları steril 200 mikrolitre PCR tüpüne aktarın ve tohumları batırmak için tüpleri steril suyla doldurun.

Tüpleri el yazması talimatlara göre bir termocycler 10 gün kuluçkaya yatırın. 10 günlük kuluçkadan sonra tohumları SH-0 plakalarına aktarın ve kurumasını önlemek için iki kat elastik sızdırmazlık folyosu ile kapatın. 28 derecede 16 saatlik bir gün, sekiz saatlik gece döngüsü ile üç ila dört hafta kuluçka.

Fideler ilk gerçek yapraklarını geliştirdikten sonra, onları ticari çömlekçilik toprağıyla dolu tencerelere aktarın ve kurumasını önlemek için yarı saydam plastik bir kap ile kaplayın. 16 saat, sekiz saatlik gece rejimi altında 28 derece santigrat, % 85 bağıl nem iklim odası veya sera tencere yerleştirin. Bir hafta sonra, plastik bardak çıkarın.

Düzenli olarak tencere su ve ağaç büyümesini sürdürmek için gübre ile ek. Serada yetişen ağaçlardan beş ila sekiz santimetrelik genç dalları toplayarak, sadece sağlıklı, enfekte olmayan dalları kullanmayı önleyerek dönüşüme hazırolun. Yaprakları kesin, her petiole sonunda yaprak dokusunun bir santimetre kare kare bırakarak.

15 dakika boyunca 2% hipoklorit ağartıcı ile polisorbat 20 birkaç damla içeren doku dezenfekte ve sonra otoklavlı su ile sekiz kez durulayın. Agrobacterium hücrelerini 25 mililitre lik bir infiltrasyon ortamıile yaklaşık beş optik yoğunluğa yeniden askıya alın. Kök ve petiole dokuyu hücre süspansiyonunun içinde bir santimetrelik parçalara kesin.

Yaprak dokuları çıkarın ve 10 ila 30 dakika hücre süspansiyon kök ve petiole parçaları inkübe. Doku parçalarını steril bir filtre kağıdı üzerine kurutun ve el yazması talimatlara göre hazırlanmış kökleme ortamına yerleştirin. Plakaları karanlıkta 21 derecede iki gün kuluçkaya yatırın.

İki gün sonra, mantar veya bakteriyel kontaminasyon için plakaları inceleyin ve kontamine plakaları atın. Doku parçalarını el yazması talimatlara göre hazırlanan 10 mililitre SH-10 ortamına aktarın. En az 10 dakika orta doku bırakın ve yavaşça yıkamak için her iki ila üç dakikada bir çalkalayın.

El yazması yönlere göre cefotaxime ve kanamisin ile kökleme ortamı hazırlayın ve plaka dökün. Steril filtre kağıdı parçaları üzerinde dokuları kurulayın ve plakalara aktarın. 16 saat, sekiz saatlik gece rejimi altında 28 santigrat derecede yedi gün boyunca kuluçka plakaları.

Her iki günde bir mantar veya bakteriyel kontaminasyon için plakaları kontrol edin. Kontaminasyon oluşursa, enfekte olmayan doku parçalarını yeni bir tabağa aktarın. Yedi gün sonra, el yazması talimatlara göre hazırlanan doku parçalarını yayılma ortamına aktarın ve 16 saat, sekiz saatlik bir gece rejimi altında 28 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.

Transgenik sürgünler gelişene kadar haftada bir tabakları yenileyin ve enfekte olmayan doku parçalarını yeni plakalara aktarın. Bir kez putatif transgenik sürgünler en az bir santimetre uzunluğunda, sürgünler kesmek ve antibiyotik ile yayılma orta bağımsız olarak kültür. Sürgünlerin bağımsız dönüştürücüleri temsil etmesini sağlamak için, bir ekstronun her iki tarafından yalnızca tek bir çekim çekin.

Yayılım orta taze bir plaka üzerinde yaklaşık 10 sürgünler yerleştirerek ve elastik sızdırmazlık folyo iki kat ile plaka kapatarak doku yaymak. Plakaları 16 saatlik, sekiz saatlik bir rejim altında 28 derecede kuluçkaya yatırın ve bu adımı dört haftada bir tekrarlayın. Sürgünler bir santimetre uzunluğa ulaştığında, tabanlarından kesin ve kökleme ortamına yerleştirin.

Çekimin bazal ucunu ortama yerleştirerek çekimleri dik olarak yerleştirin. Yaklaşık 10 sürgünler tek bir plaka üzerine yerleştirilebilir. Rhizobium inoculum hazırlayarak başlayın.

Mesorhizobium plurifarium BOR2 kolonisinden 10 mililitre sıvı YEM ortamı aşıla ve iki gün boyunca 28 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Sıvı YEM orta daha büyük bir hacim aşılamak için bu kültürü kullanın. Bir kez büyüdükten sonra, hücreleri hasat için 3, 500 kez g 10 dakika boyunca bakteri kültürü santrifüj.

Sıvı EKM ortamdaki bakteriyel peleti yeniden askıya alın ve optik yoğunluğunu belirleyin. Yaklaşık 20 tencere için yeterli olan üç litre EKM ortamı hazırlayın ve rizobial süspansiyon ile aşılamak. Orta ve 1,25 kilogram perliti karıştırın ve steril yarı saydam polipropilen kaplara bu karışımın 210 gramını ekleyin.

Her pota bir ila üç Parasponia andersonii plantlets bitki ve kontrol yapısı ile dönüştürülmüş plantlets ile çeşitli tencere hazırlamak. Tencerebirkaç tartMak ve ışık maruz kalma kökleri korumak için her tencerenin alt kapağı. Tencereleri 16 saat, sekiz saatlik gece rejimi altında 28 derecede, 16-6 hafta boyunca iklimlendirilmiş bir büyüme odasında kuluçkaya yatırın.

Haftada bir kez, su kaybını belirlemek için birkaç tencere tartın. Su kaybı 10 mililitreyi aşarsa, kaybı telafi etmek için ultra saf su ile tamamlayın. Kuluçkadan sonra, perlit kökleri temiz ve bir dürbün kullanarak nodül numaralarını belirlemek.

Bu teknik, Agrobacterium strain AGL1 ile petioles ve Parasponia andersonii kaynaklanıyor segmentleri başarıyla dönüştürmek için kullanılmıştır. İlk olarak, doku eksplants iki gün boyunca Agrobacterium ile birlikte yetiştirilir. Uzun süreli birlikte ekimi bakteriyel aşırı kolonizasyonla sonuçlanır ve önlenmelidir.

Birkaç hafta sonra, küçük yeşil mikro-calli orijinal yara yüzeyi boyunca gözlenir. Bu calli büyümeye devam ve dönüşümün başlamasından sonra altı ila sekiz hafta bir veya daha fazla putatif dönüştürülmüş sürgünler geliştirmek. Dönüşüm verimliliği, olgun dallardan doku ekspları için %10-30 ile genç ve hızla büyüyen dallardan gelen doku ekspları için %65-75 arasında değişmektedir.

Transgenik sürgünler in vitro yayılım yoluyla çarpılabilir, bu da bir ay içinde onlarca sürgüne yol açar. Bu sürgünler yaklaşık iki hafta içinde kök oluşumunu neden olacak ve deney için kullanılabilecek bitkiler verim köklendirme orta yerleştirilebilir. Kararlı bir dönüşüm denemesi başlatırken, kaynak malzeme olarak sağlıklı dalları seçmek önemlidir.

Parasponia T0 transgenik hatları in vitro olarak yayılır. Bu nedenle, iyice genotip Parasponia transgenik hatları esastır. Parasponia'nın deneysel bir model olarak kurulması, uzakbir şekilde birbirine bağlı iki nodulating soy, Parasponia ve baklagiller arasında karşılaştırmalı analiz sağlar.

Bu, rhizobium simbiyozun altında yatan genetik ağların korunmasını belirleyebilir. Parasponia da ahşap oluşumu, biseksüel çiçek gelişimi veya Cannabaceae özgü ikincil metabolitlerin biyosentezi gibi diğer araştırma konuları incelemek için değerli bir model olabilir.