Virüs subtypes arasında serum antikorların genişliğini ölçmek için bir Influenza antijen microarray kullanımı

Grip antijen mikrodizi sadece bir mikrolitre küçük bir kan örneği hacmi nden grip fazla 300 suşları karşı birden fazla antikor izotipleri eşzamanlı ölçüm sağlar. Mikrodizi, grip suşlarının antijenik arazisiboyunca grip antikorlarının genişliğinin yüksek iş bölümü ölçümlerini kolaylaştırır. Daha önce mümkün olandan daha ayrıntılı olarak grip antikorları karakterize ederek, Bu mikrodizi bazı insanlar bir grip enfeksiyonu geliştirmek ve diğerleri neden belirlemek yardımcı olabilir.

Antijen mikrodizi tekniği laboratuvarımızda 35 farklı patojene uygulanarak, dünya çapında ki bulaşıcı hastalık vakaları ve sağlıklı kontrollerden toplanan 50.000 serum örneğinden 60.000 antijen hedefine karşı antikor ölçümü sağlanmıştır. Bu tekniği yitim atölyeleri aracılığıyla öğrettikten sonra, tekniği görsel olarak gösterebilmenin anlayış ve performans açısından çok önemli olduğunu gördük. Prosedürü gösteren Al Jasinskas ve Rafael De Assis, bizim laboratuvar dan proje bilim adamları olacaktır.

Bir mikrodizi yazıcı kullanarak antijenleri yazdırmak için, 384 kuyudaki bir kaynak plakadan antijenleri numune kanalına aspire edebilen düşük hacimli mikrodizi tespit pimlerine sahip bir yazıcı seçin ve antijenleri doğrudan temas ve kılcal damar hareketi ile 16 pad nitroselüloz kaplı cam kaydırağa yatırın. Yazdırma yazılımında, plaka sayısı metin kutusuna kullanılacak örnek plaka sayısını girin ve analiz için kullanılacak plaka türünü seçin. Bir pin yapılandırması seçin ve kaynak uzaklıklarını slayt kaynağı ile yazdırma pimlerinin slaytlarda yazdırmaya başlayacağı konum arasındaki uzaklıklara ayarlayın.

Dizi tasarımı sekmesinin altında, dizilerin boyutunu ve şeklini tanımlayın ve yazdırma pimlerinin örnekleri nasıl alıp dağıtacağı parametrelerini seçin. Pin temizleme ve blotlama protokollerini yapılandırın ve örnek blokların slaytlara yazdırıldığı sırayı tanımlayın. Dizi yazılımı, her mikrodizideki antijenlerin düzenlenmesini tanımlamak için açıklamalı bir Kılavuz dizini dosyası oluşturacaktır.

Yazdırma yazılımını istenilen protokolle programladıktan sonra yazdırma çalışmasını başlatın. Tamamlandığında, oda sıcaklığında bir kurutucu dolap içinde ışık geçirmez bir kutu içinde sondasız mikrodizi slaytlar yerleştirin. Mikrodizideki antikorları araştırmak için, mikrodizi slaytlarını sondalama odalarının üzerine takmak ve odaları çerçevelere yerleştirmek için klipsler kullanın.

Kolayca kırıldığından ve rehidrasyon dan sonra herhangi bir sızıntı olup olmadığını kontrol edin, slaytlar montaj yaparken dikkatli olun. Gerekirse, sızıntıları gidermek için slaytları sökün ve yeniden birleştirin. 100 mikrolitre filtreli engelleme tamponu ile slaytları yeniden sulandırın ve serayı numune başına 100 mikrolitre engelleme tamponu oranında 100 ile 100 oranında seyreltin.

Daha sonra, oda sıcaklığında 30 dakika ve bir orbital shaker dakikada 100 ila 250 dönmeleri için rehydrated mikrodizi slaytlar ve seyreltilmiş sera kuluçka. Kuluçka sonunda, pedlere dokunmadan her odanın köşesinden engelleme tamponunu dikkatlice aspire etmek için ikincil bir toplama şişesi ile vakum hattına bağlı pipet uçlarını kullanın ve pedlerin kuruması için izin vermeden seyreltilmiş serayı hemen pedlere ekleyin. Daha sonra, nem korumak için mühürlü nemli kağıt havlu içeren tepsilere kapalı çerçeveler yerleştirin ve bir sallanan shaker üzerinde dört derece santigrat çerçeveleri bir gecede kuluçka.

Kuantum nokta konjuge ikincil antikor etiketleme için, dikkatle sera aspire gibi sadece gösterdi ve taze TTBS tampon 100 mikrolitre üç yıkar ile slaytlar durulayın beş dakika boyunca her bir orbital shaker üzerinde. Slaytlar daha sonra kuantum nokta konjuge ikincil antikorların bir karışımı ile kuluçkaya yatırılır ve daha sonra protokolde açıklandığı gibi üç kez yıkanır, sadece gösterildiği gibi aynı tekniği kullanarak. Son yıkamadan sonra, slaytları dikkatlice odalardan çıkarın ve süzülen çift distile suyla slaytları hafifçe durulayın ve her slaytı 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin.

Daha sonra, santrifüj ile slaytlar kuru. Mikrodizi slaytlarının görüntülerini elde etmek için, önce taşınabilir görüntüleyiciyi açın ve görüntülenecek slaytı görüntüleme odasındaki slayt tutucuya yüz üstü dikkatlice yerleştirin. Görüntüleme yazılımını açın ve görseli yapılandırın sekmesi altında uygun slayt yapılandırmasını seçin.

Görüntü kontrol sekmesinin altında, uygun floresan kanalı seçin ve seranın reaktivitesine bağlı olarak pozlama ve edinme sürelerini ayarlayın. Ardından, görüntü edinmebaşlatmak için yakalama'yı tıklatın. Edinmenin sonunda, dizi noktalarını algılamak için fiducial işaretçilere yönelik ızgaraları kullanın.

Nokta yoğunluğunu ölçmek için, dosya bilgi panelinde, gal dosyasını yükleyin ve analiz çıktısı dosyalarının analiz seçenekleri bölümüne kaydedilecek klasörü belirtin. Görüntü denetim sekmesinin altında, sayısallaştırılmak üzere edinilen görüntülerden birini açın ve otomatik olarak seçin. Dizi çözümlemesi bölümünde, yazılım tarafından talimat verildiği gibi güvenilir bir şablon oluşturun.

Ölçülecek görüntüleri içeren klasörü seçmek için toplu iş çözümlemesi'ni tıklatın ve yeni oluşturulan güvenilir şablonu seçin. Yazılım her görüntüyü analiz edecek ve nokta yoğunluğunu ölçecektir. Daha sonra, antijenler ve serum örnekleri arasında antikor bağlayıcı karşılaştırmak için ham verileri analiz.

Bu temsili çalışmada, kullanılan ikincil antikorlar 800 nanometre de kuantum nokta yayan keçi anti-insan IgG ve Keçi Anti-İnsan IgA sırasıyla IgG ve IgA antikorların multipleks tespiti için 585 nanometre de yayan kuantum nokta yayan konjuge konjuge keçi Anti-Human IgG edildi. Ortaya çıkan ısı haritasında, yalnızca yüksek temsili olan klinik olarak alakalı alt tipler, daha yüksek bir sayının kalan alt türlerinin tümünün artı işaretiyle yer kazanmak için etiketlenmiştir. Serum IgA ve IgG hemagglutinin ve nöraminidaz moleküler formları ve alt tiplerine göre gruplandı.

Klinik alt tipler için hemagglutinin kafa grubu antikorların yüksek özgüllüğünü ve tüm hemagglutinin ve triamerized bütün hemagglutinin antikorlarının yüksek çapraz reaktivitesini stok bölgenin dahil edilmesiyle göstermek. Mikrodizide ölçülen influenza antikor yanıtları, hemagglutinasyon inhibisyonu ve mikronötrizasyon denemeleri de dahil olmak üzere geleneksel teknikler ile doğrulanabilir. Bu teknik, antikorların influenza kafa grubuna karşı alt tip özgüllüğü ve IgA ve IgG antikorlarının influenza yatkınlığına karşı göreceli önemi hakkında bilgiler üretmiştir.

Malzemelerin hiçbiri son derece tehlikeli olmamakla birlikte, tüm insan serum örnekleri kurumsal biyogüvenlik protokollerine uygun olarak ele alınmalıdır.