Name: Hastalık Modellerinde Hematopoetik Hücrelerin İncelemi için Lentiviral CRISPR/Cas9-Aracılı Genom Düzenleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-03T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Öğrenin, fare hematopoietik kök ve progenitör hücrelerinde CRISPR/Cas9 ile genom düzenleme yaparak hızlı ve ekonomik hastalık modelleri oluşturmayı. Bu yöntem, hematopoietik sistemde gen fonksiyonlarını incelemek için güçlü bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

S. S. bir Amerikan Kalp Derneği doktora sonrası burs 17POST33670076 tarafından desteklendi. K. W. NIH hiber01 HL138014, R01 HL141256 ve R01 HL139819 tarafından desteklendi.

Hayvan denekleri ile ilgili tüm prosedürler Virginia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Lentivirüs partiküllerinin üretimi ve saflaştırılması
NOT: Optimize edilmiş kılavuz RNA'yı içeren Lentivirus partikülleri Addgene tarafından sağlanan ayrıntılı protokollerle üretilebilir: <https://media.addgene.org/cms/files/Zhang_lab_LentiCRISPR_library_protocol.pdf)>. Yüksek titrelentivirus hazırlık ve depolama için optimize edilmiş yöntemler başka bir yerde tartışılır17,18. Kısaca, lentivirüsler hek 293T hücrelerine lentivirus vektör plazmid, psPAX2 ve pMD2.G'nin birlikte transfeksiyonu ile üretilir. Kültür supernatant 48 saat post-transfection toplanır ve ultracentrifugation tarafından yoğunlaşmıştır. Lentiviral titre ticari olarak mevcut qPCR tabanlı bir test ile belirlenir. Bu işlem biyogüvenlik sınıfı II kabinede yapılmalıdır.
<ol><li>Kollajen in 1:200 çözeltisi hazırlayın (%0.0005) 1x PBS olarak.</li>
	<li>Coat 6 kuyulu kollajen solüsyonu ile ve 37 °C'de kuluçka, ~30 dk için %5 CO2.</li>
	<li>Tohum 293T hücreleri kuyu başına 1 x 106 hücre yoğunluğunda ve 37 °C'de kuluçkaya yatırın, ~2 saat için %5 CO2.</li>
	<li>Üç transfeksiyon plazmidinin karışımını bir kuyu için hazırlamak için, 0,9 g lentivirus vektörünü, 0,6 g psPAX2'yi ve 0,3 g pMD2.G'yi birleştirin, ardından deiyonize su ekleyerek toplam 10 μL'lik bir hacim elde edin. Kuyu sayısına bağlı olarak miktarları buna göre ayarlayın. Her plazmidin miktarı ve oranının araştırmacıların ihtiyaçlarına uyacak şekilde daha da optimize edilmesi gerekebilir.</li>
	<li>Plazmid karışımına 50 μL 1x PBS ve seyreltilmiş PEI MAX'in (1,0 mg/mL) 5 000'ini dikkatlice ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın(TABLO 1).</li>
	<li>Karışıma 1 mL DMEM ekleyin.</li>
	<li>6 kuyu plakasından aspire ortamı, 1 mL plazmid karışımı ekleyin ve 37 °C'de %5 CO2~3 saat için kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Ortamı 2 mL taze DMEM ile değiştirin ve 37 °C'de %5 CO2 ila 24 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>37 °C'de 1 mL taze DMEM ve inkübat, ek 24 saat için %5 CO2 ekleyin (toplam kuluçka süresi 48 saattir).</li>
	<li>Herhangi bir serbest yüzen hücreleri kaldırmak için 15 dakika için 3.000 x g bir 50 mL tüp ve santrifüj kültür supernatant aktarın.</li>
	<li>Supernatant'ı 0,45 m'lik bir filtreden filtreleyin.</li>
	<li>Filtrat'ı polipropilen santrifüj tüplerine aktarın.</li>
	<li>Ultracentrifuge 4 °C ve 72.100 x g rmax 3 saat.</li>
	<li>Dikkatle supernatant aspire, beyaz pelet geride bırakarak.</li>
	<li>100 μL serumsuz hematopoetik hücre genişletme aracı ile peleti havalandırma olmadan yeniden askıya alın.</li>
	<li>Viral titreyi ölçmek için 10 μL aliquot tutun ve kalan tüm aliquotları -80 °C'de gerekli olana kadar saklayın.</li>
	<li>10 μL viral aliquot kullanarak üreticinin talimatlarına göre bir qPCR tabanlı test ile virüs titrat.</li>
</ol>2. Fare kemik iliğinden soy-negatif hücrelerin izolasyonu ve transdüksiyonu (Şekil 1A)
NOT: Tipik olarak, yeterli hücreleri izole etmek için, tibias çiftleri, uyluk ve humeri her fareden hasat edilir. Pelvik ve spinal kemikler de soy-negatif hücrelerin kaynağı olarak hasat edilebilir.
<ol><li>Kemik iliği hücrelerinin izolasyonu<ol>
<li>Ötanazi 8-10 haftalık erkek CRISPR/Cas9 knock-in fareler tarafından 5% izofluran servikal dislokasyon takip, sonra% 70 etanol ile cilt dezenfekte.</li>
		<li>Diseksiyon makası kullanarak, göğüs kafesinin hemen altındaki deride enine bir kesi yapın ve bacakları ve kolları ortaya çıkarmak için cildi her iki yönde de distal olarak soyun.</li>
		<li>Kalça eklemini yerinden çıkararak alt ekstremiteleri kalça kemiğinden dikkatlice ayırın. Kalça tamamen femur kaldırmak için femur baş boyunca kesin. Diz yerinden çıkarmak ve femur ve tibia ayırmak için eklemde kesilmiş, kemik epifizi sağlam tutarken. Ayak bileği eklemi çıkarmak ve ayak ve ekstra kas soyma.</li>
		<li>Kesme makası kullanarak, üst ekstremiteleri ayırmak için omzundan kesilmiş. Omuz çıkarmak, sonra humerus kemik hasat için dirsek ekleminde kesti.</li>
		<li>Dikkatle femurlar, tibias ve humeri kasları kaldırmak için selüloz-fiber mendil kullanın. Bu işlem sırasında kemiklerin kırılmadığından emin olmak için ekstra önlem alın.</li>
		<li>İzole kemikleri RPMI içeren 50 mL konik bir tüpe yerleştirin ve buza yerleştirin. NOT: Aşağıdaki adımlar bir biyogüvenlik sınıfı II kabine yapılmalıdır.</li>
		<li>Kemikleri steril, 100 mm kültür çanağı içine aktarın.</li>
		<li>Künt forseps ile kemik kavramak ve kesme makas kullanarak, dikkatle her iki epifiz kesti. NOT: Yetersiz bir kesim kemik iliği eksik bir floş yol açacaktır, aşırı agresif kesim hücre kaybına neden olurken.</li>
		<li>10 mL'lik bir şırıngayı buz gibi RPMI ile doldurun ve 22 G iğne kullanarak kemik iliğini şafttan 100 mm'lik yeni bir kültür kabına boşaltın. NOT: Kemik şaftı iyi temizlenmişse kemikler beyaz ve yarı saydam hale gelir. Değilse, kemik uçlarını yeniden kesin ve tekrar sifonu çek.</li>
		<li>Tüm kemik iliği toplandıktan sonra, 18 G iğne ile 10 mL şırınga ile kemik iliği birkaç kez geçerek tek hücreli süspansiyon yapmak. Tek hücreli süspansiyon sağlamak için 10x'i tekrarlayın.</li>
		<li>Hücre süspansiyonuna 70 m'lik bir hücre süzgeciaracılığıyla 50 mL konik bir tüpe filtre uygulayın.</li>
		<li>Santrifüj 310 x g için 10 dakika 4 °C'de.</li>
		<li>Supernatant aspirate ve aşağıdaki hücre ayırma işlemi için optimize ayırma tampon uygun bir hacimde hücre pelet resuspend.</li>
	</ol></li>
	<li>Soy-negatif hücrelerin izolasyonu ve lentivirüs transdüksiyonu NOT: Fare soy-negatif hücreleri, üreticinin talimatlarına göre bir soy tükenme kiti kullanılarak Cas9 transgenik fareler3veya diğer fare suşlarının kemik iliğinden izole edilir. Tipik olarak, soy-negatif hücreler tüm kemik iliği çekirdekli hücrelerin% 2-5'ini oluşturur ve saflık genellikle izolasyon dan sonra% 90'dan fazladır. İzole soy-negatif hücreler 20 ng/mL rekombinant murine TPO ve 50 ng/mL rekombinant murine SCF ile desteklenen serumsuz hematopoetik hücre genişletme ortamında kültürlenir, daha sonra 16 saat boyunca lentivirus vektörü ile enfeksiyon (MOI) = 100.<ol>
<li>Soy-negatif hücreleri izole etmek için, üreticinin talimatlarına göre soy hücresi tükenme kitikullanın.</li>
		<li>İzolasyon dan sonra serumsuz hematopoetik hücre genişletme aracının 1 mL'sinde soy-negatif hücreleri askıya alın.</li>
		<li>Hücreleri 1,5 x 106 hücre/mL yoğunlukta 6 kuyuplakasına yerleştirin (5 x 105 soy-negatif hücre/fare.)</li>
		<li>Rekombinant murine TPO ve SCF'yi sırasıyla 20 ng/mL ve 50 ng/mL'lik son konsantrasyonlarda kuyulara ekleyin.</li>
		<li>37 °C'de %5 CO2'de ~2 saat için kuluçka öncesi hücreler.</li>
		<li>MoI = 100, 4 μg/mL polibrene ve penisilin/streptomisin kuyulara lentivirus ekleyin ve 37 °C'de kuluçka, 16-20 saat için %5 CO2 (Şekil 1B).</li>
		<li>Ertesi gün, 15 mL konik tüp ve santrifüj içine lentivirus transduced hücreleri toplamak 300 g 10 dakika için.</li>
		<li>Supernatant'ı dikkatlice aspire edin ve fare başına 200°L RPMI'de peleti yeniden askıya alın. Hücreleri farelere nakledilene kadar RT'de tutun (bölüm 3).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Transeksed hücrelerin ölümcül ışınlanmış fareleriçine nakli
<ol><li>Kemik iliği nakli gününde, alıcı fareleri sekiz dilimlik bir pasta kafesine yerleştirin ve her ışınlama seansı arasında yaklaşık 4 saat olmak üzere tüm vücut ışınlaması (550 Rad/doz, toplam doz = 1100 Rad) iki dozmaruz bırakın.</li>
	<li>İkinci ışınlama seansından sonra, bir insülin şırıngası kullanarak retro-orbital ven pleksus (toplam 200°L) ile her anestezili alıcı fareye transekse line-negatif hücreleri enjekte ediniz(Şekil 1C).</li>
	<li>Işınlama sonra, fareler steril kafeslerde barındırılan ve yumuşak bir diyet ve içme suyu 14 d için antibiyotik ile takviye sağlanmalıdır.</li>
	<li>Kemik iliği naklinden 3-4 hafta sonra, transekte donör hücrelerin ingreftasyon kontrol etmek için periferik kan analiz (bölüm 4).</li>
</ol>4. Periferik kanın kimerizminin değerlendirilmesi
<ol><li>% 5 izofluran ile fareler anestezik ve kapiller tüpler kullanarak retro-orbital ven bir kan örneği almak, ve K içine toplamak2EDTA tüpleri (bir kılcal tüp hacmi aşağıdaki tahse için yeterlidir).</li>
	<li>K2EDTA tüplerinden 20 μL'lik kanı 5 mL yuvarlak alt polistiren test tüplerine aktarın ve buza koyun.</li>
	<li>Kırmızı kan hücrelerini lyse için RBC lysis tampon 1.5 mL ekleyin. Buz üzerinde 5 dakika kuluçka.</li>
	<li>Lysis tamponu nötralize etmek için, facs arabellek (1.5 mL/örnek) ile yıkama örnekleri.</li>
	<li>Santrifüj 609 x g rmax 4 °C'de 5 dakika. Supernatant atın.</li>
	<li>Hücreleri, karanlıkta 20 dakika boyunca RT'de monoklonal antikorlardan oluşan bir kokteylle (100°L FACS tamponu/numunede seyreltilmiş) kuluçkaya yatırın. Yukarıdaki Malzemeler bölümünde antikorların tam bir listesi verilmiştir.</li>
	<li>Hücreleri FACS arabelleğiyle (2 mL/örnek) bir kez yıkayın. Santrifüj 609 x g rmax (1.800 rpm) 4 °C'de 5 dakika için. Supernatant'ı tamamen atın.</li>
	<li>4 °C'de 10 dakika boyunca fiksasyon tamponu (100 μL/tüp) içeren paraformaldehit içeren hücreleri düzeltin.</li>
	<li>Hücreleri FACS arabelleğiyle (3 mL/örnek) bir kez yıkayın. Santrifüj 609 x g rmax (1.800 rpm) 4 °C'de 5 dakika için. Supernatant'ı tamamen atın.</li>
	<li>400 μL FACS arabelleğindeki peleti askıya alın.</li>
	<li>Numuneleri akış sitometrisi ile analiz edinceye kadar 4 °C'de tutun.</li>
</ol>

<ol><li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+immune+responses+in+mice+lacking+LUBAC-mediated+linear+ubiquitination+in+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Defective immune responses in mice lacking LUBAC-mediated linear ubiquitination in B cells.</a> EMBO Journal. 32, 2463-2476 (2013).</li>
<li>Ogilvy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+vav%2C+a+gene+expressed+throughout+the+hematopoietic+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of vav, a gene expressed throughout the hematopoietic compartment.</a> Blood. 91, 419-430 (1998).</li>
<li>Meyer, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNMT3A+Haploinsufficiency+Transforms+FLT3ITD+Myeloproliferative+Disease+into+a+Rapid%2C+Spontaneous%2C+and+Fully+Penetrant+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">DNMT3A Haploinsufficiency Transforms FLT3ITD Myeloproliferative Disease into a Rapid, Spontaneous, and Fully Penetrant Acute Myeloid Leukemia.</a> Cancer Discovery. 6, 501-515 (2016).</li>
<li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+targeting+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269, 1427-1429 (1995).</li>
<li>Cole, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PML-RARA+requires+DNA+methyltransferase+3A+to+initiate+acute+promyelocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">PML-RARA requires DNA methyltransferase 3A to initiate acute promyelocytic leukemia.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 85-98 (2016).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154, 1370-1379 (2013).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153, 910-918 (2013).</li>
<li>Quadros, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easi-CRISPR%3A+a+robust+method+for+one-step+generation+of+mice+carrying+conditional+and+insertion+alleles+using+long+ssDNA+donors+and+CRISPR+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins.</a> Genome Biology. 18, 92(2017).</li>
<li>Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easi-CRISPR+for+creating+knock-in+and+conditional+knock-out+mouse+models+using+long+ssDNA+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knock-out mouse models using long ssDNA donors.</a> Nature Protocols. 13, 195-215 (2018).</li>
<li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Mediated+Gene+Editing+to+Assess+the+Roles+of+Tet2+and+Dnmt3a+in+Clonal+Hematopoiesis+and+Cardiovascular+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Mediated Gene Editing to Assess the Roles of Tet2 and Dnmt3a in Clonal Hematopoiesis and Cardiovascular Disease.</a> Circulation Research. 123, 335-341 (2018).</li>
<li>Cante-Barrett, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+gene+transfer+into+human+and+murine+hematopoietic+stem+cells%3A+size+matters%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: size matters.</a> BMC Research Notes. 9 (312), (2016).</li>
<li>Chu, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+CRISPR-mediated+mutagenesis+in+primary+immune+cells+using+CrispRGold+and+a+C57BL%2F6+Cas9+transgenic+mouse+line%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 12514-12519 (2016).</li>
<li>Fuster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+hematopoiesis+associated+with+TET2+deficiency+accelerates+atherosclerosis+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice.</a> Science. 355, 842-847 (2017).</li>
<li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet2-Mediated+Clonal+Hematopoiesis+Accelerates+Heart+Failure+Through+a+Mechanism+Involving+the+IL-1beta%2FNLRP3+Inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Tet2-Mediated Clonal Hematopoiesis Accelerates Heart Failure Through a Mechanism Involving the IL-1beta/NLRP3 Inflammasome.</a> Journal of the American College of Cardiology. 71, 875-886 (2018).</li>
<li>Sano, S., Wang, Y., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+Hematopoiesis+and+Its+Impact+on+Cardiovascular+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Journal%22%5BJournal%5D)">Clonal Hematopoiesis and Its Impact on Cardiovascular Disease.</a> Circulatory Journal. 71, 875-886 (2018).</li>
<li>Heckl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mouse+models+of+myeloid+malignancy+with+combinatorial+genetic+lesions+using+CRISPR-Cas9+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing.</a> Nature Biotechnology. 32, 941-946 (2014).</li>
<li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+high-titer+lentivirus+preparations+without+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation.</a> Scientific Reports. 5, 13875(2015).</li>
<li>Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+production+and+concentration+of+lentiviral+vectors+to+achieve+high+transduction+in+primary+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells.</a> BMC Biotechnology. 13, 98(2013).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42, e168(2014).</li>
<li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Survey+of+Validation+Strategies+for+CRISPR-Cas9+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing.</a> Scientific Reports. 8, 888(2018).</li>
<li>Akcakaya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+CRISPR+editing+with+no+detectable+genome-wide+off-target+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations.</a> Nature. 561, 416-419 (2018).</li>
<li>Bae, S., Park, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas-OFFinder%3A+a+fast+and+versatile+algorithm+that+searches+for+potential+off-target+sites+of+Cas9+RNA-guided+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases.</a> Bioinformatics. 30, 1473-1475 (2014).</li>
<li>Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+double-strand+breaks+induced+by+CRISPR-Cas9+leads+to+large+deletions+and+complex+rearrangements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements.</a> Nature Biotechnology. 36, 765-771 (2018).</li>
<li>El-Brolosy, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+compensation+triggered+by+mutant+mRNA+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation.</a> Nature. 568, 193-197 (2019).</li>
<li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTC-bearing+mRNA+elicits+a+genetic+compensation+response+via+Upf3a+and+COMPASS+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components.</a> Nature. 568, 259-263 (2019).</li>
<li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154, 442-451 (2013).</li>
<li>Qi, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+CRISPR+as+an+RNA-guided+platform+for+sequence-specific+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.</a> Cell. 152, 1173-1183 (2013).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+simultaneous+transcriptional+activation+of+multiple+genes+in+the+brain+using+CRISPR-dCas9-activator+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice.</a> Nature Neuroscience. 21, 440-446 (2018).</li>
<li>Fuster, J. J., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+Mutations+and+Clonal+Hematopoiesis%3A+Unexpected+Potential+New+Drivers+of+Age-Related+Cardiovascular+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">Somatic Mutations and Clonal Hematopoiesis: Unexpected Potential New Drivers of Age-Related Cardiovascular Disease.</a> Circulatory Research. 122, 523-532 (2018).</li>
<li>Kahn, J. D., et al. PPM1D truncating mutations confer resistance to chemotherapy and sensitivity to PPM1D inhibition in hematopoietic cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKahn%2C+JD+%22Blood%22">Blood</a>. , (2018).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu protokolün avantajı, geleneksel fare transgenik yaklaşımlarına kıyasla hematopoetik hücrelerde spesifik mutasyonları barındıran hayvan modellerinin hızlı ve yüksek maliyetli bir şekilde oluşturulmasıdır. Bu metodolojinin 1 ay içinde hematopoetik hücre gen manipülasyonu yapan farelerin oluşumunu sağladığı bulunmuştur. Bu protokolde daha fazla dikkate alınması gereken birkaç kritik adım vardır.
gRNA dizisinin taranması
Vivo deneyleri gerçekleştirme...

Hematoloji ve immünoloji deki birçok çalışma, Mx1-Cre, Vav-Cre ve diğerleri gibi hematopoetik sisteme özgü Cre sürücülerini kullanan konvansiyonel ve koşullu transgenik/nakavt fareler de dahil olmak üzere genetiği değiştirilmiş farelerin bulunabilirliğine dayanır. 1,2,3,4,5. Bu stratejiler, zaman alıcı ve mali açıdan yük oluşturabilecek yeni fare suşlarının kurulmasını gerektirir. Genom düzenleme teknolojisindeki devrim niteliğindeki gelişmeler, uygun teknik uzmanlık6,7,8,9 ile 3-4 ay gibi az bir sürede yeni fare suşlarının oluşmasını sağlarken , deneyler takip edilmeden önce fare kolonisini güçlendirmek için çok daha fazla zaman gereklidir. Buna ek olarak, bu yordamlar pahalıya mal olur. Örneğin Jackson Laboratory, nakavt fare üretim hizmetlerinin geçerli fiyatını suuş başına 16.845 ABD doları olarak listelemaktadır (Aralık 2018 itibariyle). Böylece geleneksel murine transgenik yaklaşımlara göre daha ekonomik ve verimli yöntemler daha avantajlıdır.
Kümelenmiş düzenli olarak uzaya açık kısa palindromik tekrarlar/CRISPR ilişkili protein 9 (CRISPR/Cas9) teknolojisi, hızlı ve verimli RNA tabanlı, diziye özgü genom düzenlemesi için yeni araçların geliştirilmesine yol açmıştır. Başlangıçta istilacı patojen DNA yok etmek için bir bakteriyel adaptif bağışıklık mekanizması olarak keşfedilen, CRISPR / Cas9 sistemi ökaryotik hücreler ve hayvan modellerinde genom düzenleme etkinliğini artırmak için bir araç olarak kullanılmıştır. CRISPR/Cas9 makinelerinin hematopoetik kök hücrelere (elektroporasyon, nükleofection, lipofection, viral doğum ve diğerleri) iletilmesi için bir dizi yaklaşım kullanılmıştır.
Burada, cas9 ifade eden murine hematopoetik kök hücreleri etkili bir şekilde bulaştırabilme ve rna ifade yapısını, organizatörleri, düzenleyici dizileri ve kodlayan genleri bir araya getirebilme yeteneği nden dolayı hücreleri nakletmek için bir lentivirus sistemi kullanılmaktadır. floresan muhabir proteinler (yani, GFP, RFP). Bu yöntemle fare hematopoetik kök hücrelerinin ex vivo gen düzenlemesi sağlanmış, ardından ölümcül ışınlanmış farelerde kemik iliğin başarılı bir şekilde yeniden yapılandırılması10. Bu çalışma için kullanılan lentivirus vektörü, ortak çekirdek EF1a promotöründen Cas9 ve GFP muhabiri genlerini, muhabir geninden yukarı doğru bir iç ribozomal giriş alanı ile ifade eder. Kılavuz RNA dizisi ayrı bir U6 organizatöründen ifade edilir. Bu sistem daha sonra aday klonal hematopoiesis sürücü genleri Tet2 ve Dnmt3a10ekleme ve silme mutasyonları oluşturmak için kullanılır. Ancak, bu yöntemle transdüksiyon verimliliği nispeten düşüktür (~%5-%10) transdüksiyon verimliliğini sınırlayan ve üretim sırasında virüs titreğini azaltan vektör kesici ucun (13 Kbp) büyük boyutu nedeniyle.
Diğer çalışmalarda, daha büyük viral RNA boyutunun hem virüs üretimini hem de transdüksiyon verimliliğini olumsuz etkilediği gösterilmiştir. Örneğin, kesici uç boyutunda 1 kb'lik bir artışın virüs üretimini ~%50 oranında azalttığı ve fare hematopoetik kök hücrelerinde transdüksiyon verimliliğinin %50'den fazla azalacağı bildirilmiştir11. Böylece, mümkün olduğunca sistemin verimliliğini artırmak için viral eklemek boyutunu azaltmak için avantajlıdır.
Bu eksiklik Cas9 transgenik fareler istihdam ile aşılabilir, hangi Cas9 proteini ya bir kurucu veya indüklenebilir şekilde ifade edilir12. Kurucu CRISPR /Cas9 knock-in fareler cas9 enonuklezaz ve EGFP Rosa26 locus de CAG organizatörü her yerde bir şekilde ifade eder. Böylece, çekirdek EF1a organizatörü kontrolü altında U6 organizatörü ve RFP muhabiri gen kontrolü altında sgRNA ile bir yapı genom düzenleme elde etmek için lentivirus vektör kullanılarak teslim edilebilir. Bu sistemle hematopoetik kök hücrelerin genleri başarılı bir şekilde düzenlendi ve ~%90 transdüksiyon verimi gösterdi. Böylece bu protokol, hedeflenen gen mutasyonlarının hematopoetik sisteme girdiği farelerin yaratılması için hızlı ve etkili bir yöntem sağlamaktadır. Laboratuvarımız ağırlıklı olarak kardiyovasküler hastalık süreçlerinde klonal hematopoyis rolünü incelemek için bu tür teknolojiyi kullanırken13,14,15, aynı zamanda hematolojik çalışmalar için de geçerlidir malignite16. Ayrıca, bu protokol, HSPC'deki DNA mutasyonlarının hematopoetik sistemdeki diğer hastalıkları veya gelişimsel süreçleri nasıl etkilediğinin analizine kadar genişletilebilir.
Sağlam bir lentivirus vektör sistemi kurmak için, hematopoetik hücrelerin transdüksiyonve nakli için yüksek titre viral stoklar ve optimize edilmiş koşullar gereklidir. Protokolde, bölüm 1'de yüksek bir titreviral stoğun hazırlanması, bölüm 2'de murine hematopoetik kök hücrelerin kültür koşullarının optimize edilebisi, bölüm 3'te kemik iliği nakli için yöntemler ve bölüm 4'te engraftment.

<table><tbody><tr><td>RPMI Orta 1640 (1X)</td> <td>Gibco</td><td>11875-093</td><td>Orta</td></tr><tr><td>Sülfametoksazol ve Trimetoprim enjeksiyonu</td><td>TEVA</td><td>0703-9526-01</td><td></td></tr><tr><td>1/2 cc LO-DOZ İNSÜLİN ŞIRINGA</td><td>EXELINT</td><td>26028</td><td>genel tedarik</td></tr><tr><td>293T hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216 -</td> <td>Hücre hattı</td></tr><tr><td>APC-anti-fare Ly6C (Klon AL-21)</td> <td>BD Biosciences</td><td>560599</td><td>Antikor</td></tr><tr><td>APC-Cy7-anti-fare CD45R (RA3-6B2)</td> <td>BD Biosciences</td><td>552094</td><td>Antikorlar</td></tr><tr><td>BD Luer-Lok tek kullanımlık şırıngalar, 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td>genel tedarik</td></tr><tr><td>BD Microtainer kan alma tüpleri, K2EDTA BD</td><td>Bioscience</td><td>365974</td><td>genel tedarik</td></tr><tr><td>BD Precisionglide iğnesi, 18 G</td><td>BD</td><td>305195</td><td>genel tedarik</td></tr><tr><td>BD Precisionglide iğnesi eklendi, 22 G&nbsp;</td><td>BD</td><td>305155</td><td>genel tedarik</td></tr><tr><td>BV510-anti-fare CD8a (Klon 53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100752</td><td>Antikorları</td></tr><tr><td>BV711-anti-fare CD3e (Klon 145-2C11)</td><td>Biolegend</td><td>100349</td><td>Antikorları</td></tr><tr><td>Baldır derisinden kollajen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9007-34-5</td><td>genel tedarik</td></tr><tr><td>Corning Costar Ultra Düşük Bağlantılı Çoklu Kuyu Plakası, 6 kuyulu&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS3471</td><td>genel tedarik</td></tr><tr><td>CRISPR / Cas9 knock-in fareler</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>028555</td><td>fare</td></tr><tr><td>DietGel 76A</td><td>Clear H2O</td><td>70-01-5022</td><td>genel tedarik</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta (DMEM) - yüksek glikoz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6429</td><td>Orta</td></tr><tr><td>eBioscience 1X RBC Lizis Tamponu</td><td>Thermo fisher Scientific</td><td>00-4333-57</td><td>Çözelti</td></tr><tr><td>Falcon 100 mm TC ile İşlenmiş Hücre Kültürü Kabı</td><td>Yaşam Bilimleri</td><td>353003</td><td>genel tedarik</td></tr><tr><td>Falcon 5 mL yuvarlak tabanlı polistiren test tüpü</td><td>Yaşam Bilimleri</td><td>352054</td><td>genel tedarik</td></tr><tr><td>Falcon 50 mL Konik Santrifüj Tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>352098</td><td>genel tedarik</td></tr><tr><td>Falcon 6 Kuyu Temizle Düz Tabanlı TC ile Tedavi Edilmiş Çok Kuyulu Hücre Kültürü Plakası&nbsp;</td><td>Yaşam Bilimleri</td><td>353046</td><td>genel tedarik</td></tr><tr><td>Fisherbrand mikrohematokrit kılcal tüpler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-362566</td><td>genel tedarik</td></tr><tr><td>Fisherbrand steril hücre süzgeçleri, 70 & mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td>genel tedarik</td></tr><tr><td>FITC-anti-fare CD4 (Klon RM4-5)</td><td>Invitrogen</td><td>11-0042-85</td><td>Antikor</td></tr><tr><td>Fiksasyon Tamponu</td><td>BD Bioscience</td><td>554655</td><td>Solution</td></tr><tr><td>Guide-it Rekabet sgRNA Tarama Sistemleri</td><td>Clontech</td><td>632636</td><td>Kiti</td></tr><tr><td>Isothesia (Isoflurane) çözeltisi</td><td>Henry Schein</td><td>29404</td><td>Çözelti</td></tr><tr><td>Lenti-X qRT-PCR Titrasyon Kiti&nbsp;</td><td>Takara</td><td>631235</td><td></td></tr><tr><td>Kiti Soy Hücresi Tükenme Kiti, fare</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-858</td><td>Kiti</td></tr><tr><td>Millex-HV Şırınga Filtre Ünitesi, 0.45 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLHV004SL</td><td>genel tedarik</td></tr><tr><td>PBS pH7.4 (1X)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Çözeltisi</td></tr><tr><td>PE-Cy7-anti-fare CD115 (Klon AFS98)</td><td>eBioscience</td><td>25-1152-82</td><td>Antikorlar</td></tr><tr><td>PEI MAX</td><td>Polysciences</td><td>24765-1</td><td>Çözelti</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin Karışımı</td><td>Lonza</td><td>17-602F</td><td>Çözeltisi</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5-anti-fare Ly6G (Klon 1A8)</td><td>BD Biosciences</td><td>560602</td><td>Antikorları</td></tr><tr><td>pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>57823</td><td>Plazmid</td></tr><tr><td>pMG2D</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td>Plazmid</td></tr><tr><td>Polibren Enfeksiyonu/Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td>Çözeltisi</td></tr><tr><td>Polipropilen Santrifüj Tüpleri</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>326823</td><td>genel tedarik</td></tr><tr><td>psPAX2&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td>Plazmid</td></tr><tr><td>RadDisk &ndash; Kemirgen Işınlayıcı</td><td>Disk Braintree Scientific</td><td>IRD-P M</td><td>genel tedarik</td></tr><tr><td>Rekombinant Murin SCF</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td>Çözelti</td></tr><tr><td>Rekombinant Murin TPO&nbsp;</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>315-14</td><td>Çözüm</td></tr><tr><td>StemSpan SFEM</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>09600</td><td>Çözüm</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Kimyasal Olarak Yetkin E.coli</td><td>Thermo fisher Bilimsel</td><td>K457501</td><td>Kiti</td>ile sıralama için TOPO TA klonlama kiti</tr><tr><td>Zombie Aqua Tamir Edilebilir Canlılık Kiti</td><td>BioLegend</td><td>423102</td><td>Çözümü&nbsp;</td></tr></tbody></table>

hastalık modellerinde hematopoetik hücrelerin İncelemi için lentiviral crispr/cas9-aracılı genom düzenleme

Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models

Konvansiyonel transgenez yaklaşımları kullanarak hematopoetik kök hücrelerde genlerin manipüle edilmesi zaman alıcı, pahalı ve zorlu olabilir. Genom düzenleme teknolojisindeki gelişmelerden ve lentivirus aracılı transgen dağıtım sistemlerinden yararlanan, genlerin özellikle hematopoetik kök hücrelerde manipüle edildiği fareleri oluşturan etkili ve ekonomik bir yöntem burada tanımlanmıştır. Lentivirüsler, Cas9-ifade eden soyu negatif kemik iliği hücrelerini belirli genleri ve kırmızı floresan muhabiri geni (RFP) hedefleyen bir kılavuz RNA (gRNA) ile nakletmek için kullanılır, daha sonra bu hücreler ölümcül ışınlanmış C57BL/6 farelere nakledilir. Mercekleyici olmayan gRNA'yı ifade eden lentivirus ile nakledilen fareler kontrol olarak kullanılır. Transekte hematopoetik kök hücrelerin engreftlemesi periferik kanın RFP-pozitif lökositlerinin akış sitometrik analizi ile değerlendirilir. Bu yöntemle transplantasyondan 4 hafta sonra miyeloid hücrelerin ~%90 transdüksiyonu ve lenfoid hücrelerin ~%70'i elde edilebilir. Genomik DNA RFP-pozitif kan hücrelerinden izole edilir ve hedeflenen alan DNA'sının bazı bölümleri genom düzenlemesini doğrulamak için PCR tarafından yükseltilir. Bu protokol hematopoyonis düzenleyici genlerin yüksek iş bölümü değerlendirmesini sağlar ve hematopoetik hücre tutulumu olan çeşitli fare hastalığı modellerine genişletilebilir.

Yukarıda açıklanan protokol kullanılarak fare başına yaklaşık 0.8-1.0 x 108 kemik iliği hücresi elde edilmiştir. Elde ettiğimiz soy-negatif hücre sayısı fare başına yaklaşık 3 x 106 hücredir. Tipik olarak, kemik iliği soy-negatif hücrelerin verimi toplam kemik iliği nükleer hücrelerinin% 4-5'tir.
Transeksif hücrelerin kimerizmi (RFP-pozitif) periferik kanın akış sitometrisi ile değerlendirilir (<strong clas...

Hematopoetik kök ve ata hücrelerinin (HSPC) CRISPR/Cas9 sistemi tarafından hematopoetik sisteme özgü gen modifikasyonları ile fare model sistemlerini hızla geliştirmek için yüksek verimli genom düzenlemesi için protokoller tanımlanmıştır.

Hastalık Modellerinde Hematopoetik Hücrelerin İncelemi için Lentiviral CRISPR/Cas9-Aracılı Genom Düzenleme

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting ...

Genom düzenleme teknolojisini ve lentivirus aracılı transgen dağıtım sistemlerini kullanarak, özellikle hematopoetik kök hücrelerde gen manipülasyonu olan fareleri kurmak için etkili ve ekonomik bir yöntem geliştirdik. Bu protokolün avantajı, geleneksel fare transgenik yaklaşımlarına kıyasla hematopoetik hücrelerde spesifik mutasyonları barındıran hayvan modellerini hızlı ve uygun maliyetli bir şekilde oluşturabilmektir. Prosedürü gösteren Ying Wang, benim laboratuvarımdan bir araştırmacı olacak.Lentivirüs parçacıkları oluşturmak için, kollajen çözeltisi ile altı iyi plaka kodlama ve 30 dakika boyunca 37 derece santigrat ve% 5 karbondioksit kuluçka ile başlar. Sonra, 293T hücreleri tabağa yerleştirin ve iki saat daha kuluçkaya yatırın. Bu arada, lentivirus vektör0.9 mikrogram, psPAX2 0.6 mikrogram ve pMD2 0.3 mikrogram birleştirerek üç transfeksiyon plazmidkarışımı hazırlamak.G ve deiyonize 10 mikrolitre başına kuyu. Daha sonra, plazmid karışımına 50 mikrolitre 1X PBS ve seyreltilmiş PEI MAX beş mikrolitre ekleyin ve karışımı oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra bir mililitre DMEM ekleyin.Altı kuyu plaka medya aspire ve her kuyuya plazmid karışımı bir mililitre ekleyin. Tabağı üç saat daha kuluçkaya yatırın. Ortamı taze DMEM ile değiştirin ve 24 saat kuluçkaya yatırın.Bir mililitre taze DMEM ekleyin ve 24 saat daha kuluçkaya yatırın. Toplam 48 saatlik kuluçkadan sonra, süpernatant'ı 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve serbest yüzen hücreleri çıkarmak için 3000 kez G'de 15 dakika santrifüj edin. Süpernatant'ı 0,45 mikrometre filtreden geçirin ve ultra santrifüjünü üç saat boyunca filtreleyin.Dikkatle supernatant aspire, beyaz pelet geride bırakarak. 100 mikrolitre serumsuz hematopoetik hücre genişletme aracı ile peleti havalandırma olmadan yeniden askıya alın. Viral titreyi ölçmek için 10 mikrolitrelik bir aliquot tutun ve süspansiyonun geri kalanını kullanıma hazır olana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.Kemikleri izole ettikten sonra, RPMI ile 50 mililitrelik konik tüp içine yerleştirin ve buz üzerinde tüp yerleştirin. Bir biyo-güvenlik kabininde, kemikleri steril 100 milimetrelik bir kültür yemeğine aktarın. Sonra künt forseps ile bir kemik kavramak ve dikkatle her iki epifiz kesmek için diseksiyon makas kullanın.10 mililitrelik bir şırıngayı buz gibi RPMI ile doldurun ve kemik iliğini şafttan 100 milimetrelik yeni bir kültür yemeğine atmak için 22 kalibrelik bir iğne kullanın. Tüm kemik iliği toplandıktan sonra, 18 gauge iğne ile 10 mililitrelik bir şırınga ile kemik iliği geçirerek tek bir hücre süspansiyon yapmak. Hücre süspansiyonuna 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik konik bir tüpe süzün.Sonra el yazması yönlere göre tüp santrifüj ve supernatant aspire. Hücre peletlerini uygun bir birimde optimize edilmiş ayırma arabelleğinde yeniden askıya alın. Soy negatif hücreleri izole etmek için, üreticinin talimatlarına göre bir soy hücresi tükenme kiti kullanın.Serumsuz hematopoetik hücre genişletme ortamında izole edilmiş soy negatif hücrelerini yeniden askıya alın. Hücreleri 37 derecede,%5 karbondioksitte iki saat boyunca kuluçkaya yatırın. Sonra el yazması yöngöre lentivirus ekleyin ve başka bir 16-20 saat için kuvöz hücreleri bırakın.Ertesi gün, 15 mililitrelik konik tüp içinde lentivirus transduced hücreleri toplamak ve 10 dakika boyunca 300 kez G santrifüj. NHA yönergelerine göre, Reece Grubu düzey iki de lentivirus vektörleri işlemek için önemlidir. Tesis yönetmeliklerine göre önlemler alınmalıdır.Supernatant'ı dikkatlice aspire edin ve fare başına 200 mikrolitre RPMI'de peleti yeniden askıya alın. Fareleriçine nakli kadar oda sıcaklığında hücreleri tutun. İkinci ışınlama seansından sonra, retro-orbitally bir insülin şırınga kullanarak her anestezili fare içine transli delineage negatif hücreleri enjekte.Kemik iliği naklinden 3-4 hafta sonra, kılcal tüpler kullanarak retro-orbital venden kan örnekleri alın. 20 mikrolitre kanın yuvarlak alt polistiren test tüplerine aktarın ve buza yerleştirin. RBC lysis sonra, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca karanlıkta monoklonal antikorlar bir kokteyl ile hücreleri kuluçka.Kuluçkadan sonra hücreleri yıkayın, onarın ve santrifüj edin ve 400 mikrolitre FACS tamponunda hücre peletini yeniden askıya alın. Akış sitometrisi tarafından analiz edilene kadar numuneleri dört derecede tutun. Soyu negatif hücre transdüksiyonunun başarısı RFP'nin akış sitometrik tespiti ile değerlendirilebilir.Yedi günlük in vitro kültürden sonra ortalama hücrelerin %75.7'sinin transekçi olduğu gösterilmiştir. Akış sitometrisi de transduced ve non-transduced hematopoetik kök hücreleri ile reconstitution sonra fare periferik kan analiz etmek için kullanılmıştır. Nötrofillerin ortalama %94.8'i, monositlerin %93.5'i ve B hücrelerinin %82.7'si RFP'yi ifade eder.RFP pozitif kan hücrelerinden elde edilen genomik DNA, dizi analizi için PCR güçlendirildi ve alt klonlandı. Çeşitli mutasyonlar saptanır ve klonların %69'u çerçeve veya erken dur mutasyonları gösterir. Bu işlemde başarılı olmak için yüksek antivirüs stoklarının hazırlanması ve hematopoetik hücrelerin transdüksiyon ve transplantasyonu için optimize edilmiş koşullar gereklidir.Bu tekniği kardiyovasküler hastalıklarda hukuk çalışması için uyguladık. Ama aynı zamanda hematolojik malignite çalışma yararlıdır. Bu yöntem, hematopoetik sistemdeki yeni gen türlerinin fonksiyonlarını yüksek verimli ve yüksek bir şekilde incelememizi sağlar.Bunu transgenik farelerin bulunabilirliği üzerinden topluyoruz.

lentiviral-crisprcas9-mediated-genome-editing-for-study-hematopoietic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

CRISPR/Cas9 kullanarak hedeflenen gen düzenleme büyük ölçüde anlayış genlerin biyolojik fonksiyonların kolaylaştırdı. Burada, biz oncogenic faaliyetlerini incelemek için model calreticulin mutasyonların sitokin bağımlı hematopoetik hücreler için CRISPR/Cas9 metodoloji kullanmaktadır.

CRISPR/Cas9 kullanarak Gene sitokin bağımlı hematopoetik hücreler Mutant Calreticulin Oncogenic etkinliğini araştırmak için düzenleme

Bir iletişim kuralı için hızlı fare CRISPR/Cas9-aracılı gene bozulma ve insan birincil hematopoetik hücreler bu makalede açıklanan. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins elektroporasyon ile vitro transkripsiyon ve ticari Cas9 ile oluşturulan sgRNAs ile tanıtılmaktadır. Yüksek Düzenleme verimliliği sınırlı zaman ve maliyet ile elde edilir.

Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma

Preassembled Cas9 kullanan karmaşık Ribonükleoprotein (RNP) kesin, verimli genom düzenleme için güçlü bir yöntemdir. Burada, biz yararını hücreleri ve organizmalar, geniş aralığında birincil insan hücreleri ve her iki klasik de dahil olmak üzere ve model organizmalar gelişmekte olan vurgulayın.

Gelişmiş genom Cas9 Ribonükleoprotein yılında çeşitli ile hücreleri ve organizmaların düzenleme

DNA epigenome temsil düzenleme güçlü bir tedavi yaklaşımı hedef. Bu iletişim kuralı üretim, arıtma ve toplama tüm-içinde-bir lentiviral vektörlerin İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre (hiPSC)'epigenome düzenleme uygulamaları için CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene yataklık açıklar-nöronlar türetilmiş.

Pluripotent kök hücre kaynaklı hastalık modelleri lentiviral vektör platformu için Epigenome düzenleme araçları verimli bir şekilde teslim insan içine indüklenen

Burada sunulan verimli CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein aracılı gen düzenleme meme hücrelerinde tüp Elektroporasyon kullanarak bir protokoldür.

CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-boru Elektroporasyon tarafından aracılı hassas gen düzenleme

Mevcut protokol, gen düzenlenmiş hücrelerin in vivo olarak sağlam bir şekilde aşılanması için optimize edilmiş bir hematopoetik kök ve progenitör hücre (HSPC) kültür prosedürünü tanımlamaktadır.

CRISPR/Cas9 Gen Tedavisi Uygulamaları için Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerin Gen Düzenlemesi

Hematopoetik kök hücre biyolojisini ve hematolojik maligniteleri daha iyi incelemek için hematopoetik kök ve progenitör hücrelerdeki (HSPC'ler) somatik mutasyonları sadık bir şekilde modellemek için yeni stratejiler gereklidir. Burada, CRISPR / Cas9 kullanımını ve çift rAAV donör transdüksiyonunu birleştirerek HSPC'lerde heterozigot fonksiyon kazancı mutasyonlarını modellemek için bir protokol açıklanmaktadır.

İnsan Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerinde Onkojenik Heterozigot Fonksiyon Kazancı Mutasyonlarının Mühendisliği

Sunulan yöntem, yüksek verimli bir lentiviral aracılı gen dağıtım sistemi kullanarak L2HGDH genini hedefleyen sgRNA'ları kararlı bir şekilde ifade eden insan embriyonik kök hücre (hESC) hattı H9'da CRISPR aracılı bir gen nakavtının oluşturulmasını açıklar.

Besleyicisiz Koşullar Altında Kültürlenen İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-Cas9 Aracılı Gen Delesyonuna

THP-1 hücre hattı, biyoloji ile ilgili çeşitli araştırma alanlarında insan monositlerinin / makrofajlarının işlevlerini araştırmak için bir model olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu makale, sağlam ve tekrarlanabilir fenotipik verilerin üretilmesini sağlayan verimli CRISPR-Cas9 tabanlı mühendislik ve tek hücreli klon izolasyonu için bir protokolü açıklamaktadır.

THP-1 Hücrelerinde Elektroporasyon Tabanlı CRISPR-Cas9 Aracılı Gen Nakavt ve Tek Hücreli Klon İzolasyonu

Burada, hematopoietik kök ve progenitör hücrelerin anormal proliferatif kapasitesi için çok önemli olan aday genleri tanımlamak için CRISPR / Cas9 teknolojisini Hücre Sayma Kiti-8 (CCK-8) testi ile entegre eden bir protokol sunuyoruz.

Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerin Anormal Büyüme ile İlgili Genlerinin CRISPR/Cas9 Teknolojisi ile Hücre Sayımı ile Birleştirilerek Değerlendirilmesi

Öğrenin, fare hematopoietik kök ve progenitör hücrelerinde CRISPR/Cas9 ile genom düzenleme yaparak hızlı ve ekonomik hastalık modelleri oluşturmayı. Bu yöntem, hematopoietik sistemde gen fonksiyonlarını incelemek için güçlü bir araçtır.

Hastalık Modellerinde Hematopoetik Hücrelerin İncelemi için Lentiviral CRISPR/Cas9-Aracılı Genom Düzenleme

Daha fazla video keşfet