Caenorhabditis elegans hücresel yapıları ve organelle morfoloji eğitim için nicel yaklaşımlar
5 Temmuz 2019
Bu çalışmada, sinaptik boyut ve lokalizasyon, kas Morfoloji ve marochondrial şekil nicel ölçümler serbestçe kullanılabilir görüntü işleme araçları kullanarak C. elegans özetliyor. Bu yaklaşım, C. elegans 'da gelecekteki çalışmaların, genetik mutasyonların bir sonucu olarak doku ve organel yapısal değişikliklerin kapsamını nicel olarak karşılaştırmasına olanak sağlar.
Doku ve organellerin morfolojisindeki değişiklikleri ölçebilme yeteneği gen işlevinin anlaşılması nda ve genetik mutasyonların etkisinde önemlidir. Protokollerimiz, nematod, C.elegans'ta sinapsların, kasların ve mitokondrinin morfolojisinin subjektif olmayan bir şekilde değerlendirilmesi için serbestçe kullanılabilen yazılımların nasıl kullanılabileceğini açıklanmaktadır. Daha önceki birçok çalışma morfolojik değişiklikleri karşılaştırmak için nitel yöntemlere dayanıyordu.
Ancak, bunlar ince phenotik farklılıkları yakalayamadıkları, değişiklikleri tekrar ve hafife alabilecekleri ve öznel olarak değerlendirildikleri için sorunlu olabilir. Kantitatif yöntemlerimiz morfolojik değişiklikleri değerlendirmek için daha sağlam ve daha az önyargılı araçlar sağlar. Bu yöntemler, gen fonksiyonunu ve hastalıkla ilişkili mutasyonların sonuçlarını tanımlamak için diğer hücresel yapılardaki veya model organizmalardaki morfolojik değişimleri incelemek için kolayca kullanılabilir.
Görüntüleme için slaytlar hazırlayarak başlayın. Bir mikroskop slayt üzerine erimiş agarose bir damla yerleştirin ve hemen yavaşça agarose düzleştirmek, başka bir mikroskop slayt ile damlacık aşağı basın. Agarose'u bir dakika kurumaya bırakın sonra iki kaydırağı dikkatlice ayırın ve katılaşmış pedi slaytlardan birine bırakın.
Slaytı mikroskop aşamasına yerleştirin ve agarose pedin ortasına beş ila 10 mililitrelik bir anestezi damlası ekleyin. Çözelti kurumadan önce stok plakasından anestezik damlacıklara 10 ila 15 hayvanı hızlı bir şekilde aktarmak için ısı yalıtımlı bir kazma kullanın. Sonra agarose ped hemen üzerinde konumlandırma ve yavaşça aşağı bırakarak bir coverslip uygulayın.
488 ve 552 nanometre optik pompalı yarı iletken diyot lazer ile birleştiğinde ve görüntü yakalama yazılımı ile donatılmış bir çizgi tarama konfokal mikroskop ile sinaptik bölgeleri görüntüleyin. Solucanları buladıktan sonra 40X büyütmeye geçin ve daldırma ortamı uygulayın. 552 nanometre lazer, tagRFP florofor için % 1 güç ve 488 nanometre, GFP florofor için % 2 güç ile florofororları heyecanlandırarak sinaptik bölgeyi görselleştirin.
Hibrit fotodedektör kullanarak görüntüleri yakalayın ve floroforların aşırı maruz kalmasını önlemek için kazanımları ayarlayın. Hedefe bağlı olarak en uygun Z adımı boyutunu kullanarak tüm sinapskapsayacak şekilde Z-yığın görüntüleri toplayın. Sinaptik bölgeyi analiz etmek için görüntüleri CellProfiler 3.1.5 yazılımına yükleyerek başlayın.
NameAndType modüllerini ayarlayın ve UIS-115 transgeninden ifade edilen diffüz tagRFP'yi kullanarak sinaptik bölgeyi el tanımıyla belirleyin. El tanımlı sinapsın boyutunu ve floresanını, pipeline'a MeasureObjectSizeShape ve MeasureObjectIntensity modüllerini ekleyerek ölçün. Daha sonra CalculateMath modüllerini ekleyerek ve JSIS37'den elde edilen entegre yoğunluk birimlerini UIS-115'ten elde edilenlerle bölerek göreli entegre floresan yoğunluğunu hesaplayın.
Bittiğinde tüm ölçümler ve hesaplamalar ihracat. Kas hücre alanını ölçmek için Fiji yazılımında görüntüyü açın ve tek bir eğik kas hücresi etrafında dikkatle izlemek için çokgen seçimini kullanın. İzlemeyi geliştirmek için çapa noktasını sürükleyerek sonundaki çokgenin çizgisini ayarlayın.
Yazılımın üst kısmındaki Analiz sekmesine gidin ve seçili alanı hesaplamak için Ölçü'ye tıklayın. Dejenere veya eksik bölge olan kas hücreleri için çokgen seçim aracıyla eksik alanı takip edin ve tekrar Ölçüle'yi tıklatın. Birden çok boşluk varsa, her birini ayrı ayrı izle.
Boşluk alanının tüm hücrenin alanına oranını hesaplayın. Yüksek bir oran kas dejenerasyonu daha yüksek ölçüde gösterir. Eksik bölge yoksa, oran sıfır olarak hesaplanır.
Elastik'i açın ve Yeni Proje Oluştur altında Piksel Sınıflandırması'nı seçin. Sonra yeniden adlandırın ve projeyi kaydedin. Giriş veri sekmesine gidin ve Yeni Ekle'yi tıklatın ve sonra ayrı görüntüler ekleyin.'e gidin.
Açılır pencereyi TIF dosyalarıyla klasöre yönlendirin ve istediğiniz görüntüyü seçin. Özellik Seçimi sekmesinde, yeşil işaretli kutulartarafından belirtilen tüm piksel özelliklerini seçmek için Özellikleri Seç'e tıklayın. Bu adımdaki piksel seçimi, bir sonraki adımda farklı piksel sınıflarını ayırt etmek için kullanılır.
Bireysel GFP ifade miyozin filamentler ve istenmeyen arka plan ayırt etmek için bir Eğitim paneli kullanın. Sınıflayıcı eğitimine başlamak için Etiket Ekle'ye tıklayın ve filamentler arasındaki istenmeyen arka planlar ve boşluklar karalayın. İkinci bir etiket ekleyin, Filament'e yeniden adlandırın ve bir dizi filamentin üzerine karalayın.
Sınıflandırmanın doğru yapıldığından emin olmak için Canlı Güncelleştirme'yi tıklatın. Gerekirse, eğitimi ince ayaryapmak için daha fazla karalama ekleyin. Eğitim sınıflandırıcısı yapıldıktan sonra, Tahmin Dışa Aktar paneline gidin ve kaynak olarak olasılıkları olan Dışa Aktar Görüntü Ayarlarını Seçin'i tıklatın.
X ve y alt bölgelerinin işaretli olduğundan ve c'nin işaretsiz olduğundan emin olun. C için başlangıç ve durdurma değerleri olarak sıfır ve bir'i seçin ve Veri Türünü imzasız 8 bit'e dönüştürün. Yeniden normalleştir'i işaretleyin ve çıktı dosyası videosunu png olarak değiştirin ve dosyayı ve dizini istediğiniz gibi yeniden adlandırın.
Dışa Aktarma ayarları penceresini kapatın ve yeni bölümlenmiş görüntüyü dışa aktarın. Sonra Fiji yazılımıpng dosyasını açın. Varsayılan ayarları kullanarak görüntünün eşiğini ayarlayın ve ayrı bir sonuç tablosu oluşturacak olan iskeletleştirme eklentisini uygulayın.
Bu protokol sinaps gelişiminde alfa-tubulin asetiltransferaz MEC-17 işlevini keşfetmek için kullanılmıştır. Posterior/lateral mikrotübül veya PLM sinapslarının görüntülerinin nicel analizi, MEC-17'nin aşırı ekspresyonunun normal nöron fonksiyonunu bozduğunu göstermektedir. MEC-17'yi aşırı ifade eden yabani tip kontrol hayvanları ile karşılaştırıldığında presinaptik bölgeler ve sinaptik bütünlüğü önemli ölçüde azaltmıştır.
Bu teknikler ayrıca CMT2 ilişkili genlerde mutasyon taşıyan Charcot-Marie-Tooth tip 2 veya CMT2'nin C.elegans modellerini analiz etmek için de kullanılmıştır. Vücut duvarı kas morfolojisinin görsel değerlendirmesi, test hayvanlarındaki defektlerde yabani tip kontrolüne göre 2,5 ila 3,5 kat artış saptandı. Fzo-1 ve UNC-116 mutasyonları olan hayvanlar kas striations kaybı deneyimli, hücresel enkaz birikimi, ve kas lif dejenerasyonu.
Dyn-1 mutasyonu olan hayvanlar kas morfolojisinde önemli ölçüde daha az kusur yaşarken. Fzo-1 ve unc-116 mutantları, toplam tek hücreli alana boşluk oranında beş ila altı kat artış ve vahşi tip hayvanlara göre önemli ölçüde daha kısa bir ortalama lif uzunluğu gösterdi. Örnekler arasında karşılaştırmalar yapılabilmesi için en uygun şartları belirlemek ve bu şartların sürekli olarak kullanılımından emin olmak üçe
Bu teknikler, araştırmacıların farklı genetik geçmişler arasındaki morfolojik değişiklikleri nicel yaklaşımlarla karşılaştırmalarına olanak sağlayacaktır. Bu öznellik azaltır ve bu nedenle oluşturulan verilerin temsil edilebilirliğini artırmak için yardımcı olur.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, analiz için ücretsiz olarak kullanılabilen görüntü işleme araçlarını kullanarak model organizma C. elegans'ta sinaptik boyut, kas morfolojisi ve mitokondriyal şeklin nicellenmesine odaklanmaktadır. Sunulan yöntemler, genetik mutasyonlardan kaynaklanan doku ve organel yapısal değişikliklerinin güvenilir bir şekilde karşılaştırılmasını sağlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Morfolojik değişikliklerin nicel analizi
- Genetik mutasyonların hücresel yapılar üzerindeki etkisi
- Görüntüleme tekniklerinin ilerlemesi
Arka Plan
- Gen işlevini anlamak için morfolojik değişikliklerin nicellenmesinin önemi
- Önceki niteliksel metodolojilerin sınırlamaları
- Güvenilir ve daha az önyargılı değerlendirme tekniklerine duyulan ihtiyaç
Kullanılan Yöntemler
- CellProfiler ve Fiji yazılımını kullanan görüntü işleme protokolleri
- Model organizma olarak C. elegans
- Konfokal mikroskopi ve piksel sınıflandırma gibi teknikler
Ana Sonuçlar
- Sinaptik bütünlük ve kas hücre alanı üzerinde nicel verilerin sağlanması
- Genetik modellerde kas morfolojisinde önemli kusurların tanımlanması
- Gen mutasyonları ile morfolojik fenotipler arasında bağlantıların kurulması
Sonuçlar
- Çalışma, C. elegans'ta morfolojik değişiklikleri değerlendirmek için nicel yöntemlerin değerini göstermektedir
- Bulgular, gelecekteki genetik ve hastalıkla ilgili araştırmalar için önemli sonuçlar taşımaktadır
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantitative morphological analysis in model organisms enables objective assessment of genetic mutation effects on cellular structures, reducing subjectivity in phenotypic evaluation. This approach supports target validation by providing reproducible, quantifiable readouts for synaptic integrity, muscle development, and organelle morphology. Such data enhances predictive confidence in early discovery by linking genetic perturbations to measurable phenotypic outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through quantifiable changes in synapse size and fluorescence intensity.
- Operational Value: Provides standardized metrics for muscle cell area and myosin filament length to assess functional target engagement.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying mitochondrial morphology shifts as indicators of cellular stress or dysfunction.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized image analysis pipelines using CellProfiler and Fiji for reproducible morphological quantification.
- Scalability: Enables high-content screening readiness through automated measurement of organelle size, circularity, and integrated fluorescence.
- Cross-Platform Utility: Facilitates assay transferability across model systems by establishing quantitative benchmarks for tissue and organelle morphology.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports mechanistic de-risking in neurodegenerative and neuromuscular disease models by quantifying synaptic and muscle defects.
- Translational Continuity: Enables biomarker alignment through quantifiable mitochondrial morphology shifts linked to genetic mutations.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by providing quantitative thresholds for morphological defect severity in disease models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by converting qualitative phenotypic observations into quantifiable datasets for target validation and lead identification stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling statistical comparison of synaptic size and fluorescence across genetic backgrounds.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized Z-stack imaging and automated object measurement in CellProfiler.
- Analytics: Generates quantitative outputs including integrated fluorescence intensity ratios, muscle area-to-gap ratios, and mitochondrial circularity scores.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing disease-relevant morphological metrics in C. elegans models of neurodegeneration and muscle disorders.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis framework applicable to multiple organelles and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing objective, quantitative readouts of cellular structural changes.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across labs through freely available software and defined imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of phenotypic effects, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantifiable defect ratios in muscle and synaptic models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and image analysis software such as CellProfiler and Fiji.
- Dependent on consistent imaging conditions including laser power, Z-step size, and antibody labeling for reliable quantification.
- Necessitates cross-team standardization of image acquisition and analysis protocols to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when applying quantitative morphology assays to different tissue types or model organisms.
- Limited by the need for transgenic reporters or fluorescent tags to define structures of interest, as noted in synaptic region definition via tagRFP.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:59
Slide Preparation
1:48
Assessing Synaptic Morphology
2:47
Quantification of the Synaptic Region
3:45
Measurement of Muscle Cell Area
4:36
Segmentation and Quantification of Myosin Fiber Length
6:39
Results: Function of MEC-17 in the Nervous System
8:14
Conclusion
