Name: RNA Sıralaması Kullanılarak Dairesel RNAların Tanımlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-14T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Öğrenin, dairesel RNA kütüphane hazırlama protokolünü optimize ederek RNase R işlemi ve giriş miktarlarının etkisini değerlendirin. Bu yöntem, circRNA tespiti için optimal koşulları belirleyerek gen ifadesi dağılımını anlamanıza yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Banner Güneş Sağlık Araştırma Enstitüsü Beyin ve Vücut Bağışı Programı (BBDP) Sun City, Arizona insan beyin dokularının sağlanması için müteşekkiriz. BBDP Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü (U24 NS072026 Parkinson Hastalığı ve İlişkili Bozukluklar için Ulusal Beyin ve Doku Kaynağı), Ulusal Yaşlanma Enstitüsü (P30AG19610 Arizona Alzheimer Hastalığı Çekirdek Merkezi), Arizona Sağlık Hizmetleri Bölümü (sözleşme 211002, Arizona Alzheimer Araştırma Merkezi), Arizona Biyomedikal Araştırma Komisyonu (sözleşmeler 4001, 0011, 05-901 ve 1001 Arizona Parkinson Hastalığı Konsorsiyumu için) ve Michael J. Parkinson Araştırma Fox Vakfı27. Bu çalışma aynı zamanda DHS ve Arizona Eyaleti (ADHS hibe # ADHS14-052688) tarafından desteklenmiştir. Ayrıca Andrea Schmitt (Banner Araştırma) ve Cynthia Lechuga (TGen) idari destek için teşekkür ederiz.

Bu araştırma, insan refahı için tüm kurumsal, ulusal ve uluslararası kurallara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Beyin dokuları Sun City, AZ Banner Güneş Sağlık Araştırma Enstitüsü Beyin ve Vücut Bağışı Programı elde edildi. Beyin ve Vücut Bağışı Programı'nın faaliyetleri Western Kurumsal İnceleme Kurulu (WIRB protokolü #20120821) tarafından onaylanmıştır. Tüm konular veya yasal temsilcileri bilgilendirilmiş onayı imzaladı. Ticari (beyin dışı) biyonumuneler Proteogenex'ten satın alınmıştır.
1. RNase R Tedavisi
NOT: Aşağıdaki adımlarda reaksiyon hacmi toplam 50 μL hacmine ayarlanır. Bu, RNA temizleme ve konsantratörü kitinde kullanılacak minimum numune hacmidir (bkz. Malzeme Tablosu). Ayrıca, burada açıklanan en iyi duruma getirilmiş protokol toplam RNA 4 μg giriş miktarı içindir. RNase R tedavisi için daha uzun bir kuluçka süresi giriş miktarı >4 g için önerilir.
<ol><li>Mikrosantrifüj tüpünde 39 μL RNase içermeyen suda toplam RNA'yı 4°g'ya seyreltin ve pipetleme ile iyice karıştırın.</li>
	<li>Ayrı bir tüpte, RNase R'yi 1x RNase R Reaksiyon Tamponu ile 2 U/μL çalışma konsantrasyonuna seyreltin. Sadece hemen kullanmak için yeterli olun.</li>
	<li>Pipet 39 μL toplam RNA ve 5 μL 1.5 mL reaksiyon tüpü içine RNase R Reaksiyon Tampon ve pipetleme ile iyice karıştırın (50 μL toplam reaksiyon hacmi olacaktır). Daha sonra 6 μL R (2 U/μL) ekleyin.</li>
	<li>Pipeti tam reaksiyon hacmine (50°L) ayarlayın ve 10 kez yukarı ve aşağı borular oluşturarak iyice karıştırın.</li>
	<li>Tüpü 10 dakika boyunca 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin.</li>
	<li>Tüpü buza yerleştirin ve hemen RNA temizleme ve konsantrasyonu (bölüm 2) ile devam edin.</li>
</ol>2. RNA Temizleme ve Konsantratörü Kiti Kullanarak Arınma RNA
NOT: Yüksek kaliteli RNA (RIN>8, DV200>%80) kullanılırken RNa tedavisi RNA'nın yaklaşık %60'ında kayba neden olabilir. 4 μg'lik bir giriş kullanılarak, 2-2,5 μg tedavi edilen RNA'nın bölüm 1'den sonra bırakıldığı tahmin edilmektedir.
<ol><li>Başlamadan önce, tampon konsantresine %100 etanol 48 mL ekleyerek RNA Yıkama Tamponu'nu hazırlayın ve pipetleme ile iyice karıştırın. Temizleme kolonlarını toplama tüplerine yerleştirin (bkz. Malzemeler Tablosu)ve bir tüp rafına yerleştirin. NOT: Aşağıdaki tüm adımlar için aşağıdaki santrifüj ayarlarını kullanın: 10.000-16.000 x g. DNase I tedavisi zaten yapıldıysa, bu aşamada DNase I tedavisini atlayın.</li>
	<li>RNase R işlem görmüş numuneye 2 cilt RNA Bağlama Tamponu ekleyin ve pipetleme (toplam hacim: 150°L) ile iyice karıştırın.</li>
	<li>RNA Bağlayıcı Tampon ve RNase R işlenmiş numune karışımına %100 etanol ekleyin ve pipetleme (toplam hacim: 300°L) ile iyice karıştırın.</li>
	<li>Tüm hacmi sütuna aktarın ve sütunu 30 s. Akış tanzim edin.</li>
	<li>Doğrudan sütuna 400 μL RNA Hazırlık Arabelleği ekleyin, sütunu 30 s'lik santrifüj edin ve akışı atın.</li>
	<li>Doğrudan sütuna 700 μL RNA Yıkama Tamponu ekleyin, sütunu 30 s'lik santrifüj edin ve akışı atın.</li>
	<li>Doğrudan sütuna 400 μL RNA Yıkama Tamponu ekleyin, sütunu 2 dakika santrifüj edin ve sütunu taze bir RNase içermeyen 1,5 mL tüpe aktarın.</li>
	<li>Pipet ucunu kolon filtresinin hemen üzerinde tutarak ve suyun yalnızca kolon filtresine inmesini sağlayarak doğrudan kolona 11 μL RNase içermeyen su ekleyin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 1 dakika ve santrifüj 1 dk için sütun kuluçka.</li>
	<li>Before discarding the column, check for flow through in the RNase-free tube. Elüsasyon başarılı olduysa, örneğini -80 °C'de saklayın veya hemen kütüphane hazırlığına devam edin. Yaklaşık 10 μL'lik son toplam elüsyon hacmi kütüphane inşaatı için kullanılır. NOT: Durma noktası: Kütüphane hazırlığına devam etmeden önce RNA'yı -80 °C'de 7 güne kadar bırakın.</li>
</ol>3. circRNA Kütüphane Hazırlık
NOT: Bu bölümde kullanılan çoğu reaktifi içeren kit için Malzeme Tablosu'na bakın.
<ol><li>rRNA tükenmesi ve parçalanma<ol>
<li>Yeni 96 kuyulu 0,3 mL PCR plakalı temiz bir kuyuya 2.10 adımdan 10 μL saf RNA aktarın. Kuyuya 5 μL rRNA Bağlama Tamponu ve ardından 5 μL rRNA Kaldırma Karışımı ekleyin. Yavaşça pipet yukarı ve aşağı 10 kez karıştırmak için.</li>
		<li>Önceden programlanmış, önceden ısıtılmış termocycler bloğunda 68 °C'de 5 dk'lık sızdırmazlık plakası ve kuluçka makinesi. 5 dk kuluçka tamamlandıktan sonra, tezgah üzerine plaka yerleştirin ve 1 dakika oda sıcaklığında kuluçka.</li>
		<li>Plakadan mühür çıkarın. Örnek için 35 μL girdaplı oda sıcaklığında rRNA kaldırma boncukları ekleyin. Pipeti 45°L ve pipeti 10-20x yukarı ve aşağı doğru ayarlayarak iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 1 dk kuluçka plakası.</li>
		<li>Plakayı manyetik bir standa aktarın ve 1 dakika boyunca veya çözelti temize çıkana kadar standda kuluçkaya yatırın. Tüm supernatant 'ı (~45 μL) aynı plaka veya yeni plaka üzerindeki yeni kuyuya (kaç örnekle çalıştığınıza bağlı olarak) aktarın.</li>
		<li>Vortex RNA temizleme boncukları (Malzeme Tablosubakınız) kadar iyi dağılmış ve her örnek için boncuk 99 μL ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı 10x karıştırmak için. 10 dakika oda sıcaklığında plaka kuluçka.</li>
		<li>Plakayı manyetik standa aktarın ve çözelti temize çıkana kadar 5 dakika daha kuluçkaya yatırın. Tüm supernatant'ı kuyudan çıkarın ve atın.</li>
		<li>Plaka hala manyetik standda yken, boncukları bozmadan kuyuya 200 μL taze hazırlanmış %80 EtOH ekleyin. 30 s için kuluçka, sonra çıkarın ve etanol atın. Toplam 2 yıkıntı için tekrarlayın.</li>
		<li>Her kuyuya 11 μL Elütion Tampon ve karıştırmak için 10 kat yukarı ve aşağı pipet ekleyin. 2 dakika oda sıcaklığında kuluçka, ve sonra çözelti (1-5 dk) temizler kadar manyetik standa aktarın.</li>
		<li>Süpernatantın 8,5 μL'sini kuyudan aynı plakalı yeni bir kuyuya veya yeni bir plakaya aktarın. İçerdeki her numuneye 8,5 l Elute, Primer, Fragment High karışımı ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı 10 kez iyice karıştırmak için.</li>
		<li>Önceden programlanmış, önceden ısıtılmış termocycler bloğunda 94 °C'de 8 dk'lık sızdırmazlık plakası ve kuluçka makinesi. 4 °C'ye ulaştığında termocycler'dan ve kısa bir süre santrifüjden çıkarın. NOT: Hemen Synthesize First Strand cDNA protokolüne devam edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Sentez cDNA<ol>
<li>Hazırlanan her numune için 9 μL First Strand Synthesis Mix ile 1 μL ters transkriptaz karıştırın (bkz. Malzeme Tablosu). Karışımdan 8 μL'lik karışımı numuneye ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı 6 kez karıştırmak için.<ol>
<li>Mühür plakası ve önceden programlanmış, önceden ısıtılmış termocycler bloğu nda aşağıdaki parametreleri kullanarak inkübat: 10 dk için 25 °C, 15 dk için 42 °C, 15 dk için 70 °C, 4 °C tutun. Hemen ikinci iplikçik sentezine devam edin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Her numuneye 5 μL Resuspension arabelleği ve ardından 20 μL İkinci İplik İşaretleme ana karışımı ekleyin. Pipet tüm hacmi yukarı ve aşağı 6 kez.</li>
		<li>Mühür plakası ve önceden programlanmış, önceden ısıtılmış termocycler blok üzerinde 1 saat için 16 °C olarak ayarlanır. Kuluçkadan sonra, plakayı termocycler'dan çıkarın ve oda sıcaklığına kadar dengelenin.</li>
		<li>Vortex PCR arınma boncukları (Bkz. Malzeme Tablosu)ve numunenin her kuyuya 90°L boncuk ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı 10 kez iyice karıştırmak için. 10 dakika oda sıcaklığında kuluçka.</li>
		<li>Boncuk/numune karışımını manyetik standa aktarın ve 5 dakika veya sıvı temizlene kadar kuluçkaya yatırın. Supernatant'ı çıkarın ve atın.</li>
		<li>Her numuneye 200 μL %80 EtOH ekleyin. 30 s. Supernatant atın oda sıcaklığında manyetik standı üzerinde kuluçka örnekleri. 1x'i tekrarlayın.</li>
		<li>Boncukların oda sıcaklığında 6 dk kurumasını bekleyin ve manyetik standdan çıkarın.</li>
		<li>Resuspension tampon 19.5 μL boncuklar resuspend. Pipet yukarı ve aşağı 10 kez iyice karıştırmak için. 2 dakika oda sıcaklığında kuluçka, sonra manyetik standa aktarın ve ek bir 1 dakika veya sıvı temizler kadar kuluçka.</li>
		<li>17,5 μL supernatant'ı yeni iyi/yeni plakaya aktarın. NOT: Hemen devam edilmezse, numuneler -20 °C'de 7 güne kadar saklanabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Kütüphane hazırlama<ol>
<li>Supernatant içeren her kuyuya 12,5 l A-Tailing Mix ekleyin. Pipet tüm hacmi yukarı ve aşağı 10 kez karıştırmak için.</li>
		<li>Aşağıdaki parametreleri kullanarak 37 °C'ye ayarlanmış önceden programlanmış, önceden ısıtılmış bir termocycler bloğunda reaksiyonu kuluçkaya yatırın: 30 dk için 37 °C, 5 dk için 70 °C, 4 °C tutun. Numuneler 4 °C'ye ulaştığında hemen adaptör ligasyonuna geçin.</li>
		<li>Her numune için 2,5 l Resuspension arabellek, 2,5 μL benzersiz bir RNA adaptörü ve 2,5 μL Ligasyon Karışımı ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı 10x karıştırmak için.</li>
		<li>Önceden programlanmış, önceden ısıtılmış termocycler bloğunda 30 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Her numuneye 5 μL Stop Ligation tamponu ekleyin ve karıştırmak için pipet yukarı ve aşağı.</li>
		<li>Her numuneye 42 μL karışık PCR arınma boncukları ekleyin ve iyice karıştırın. 3.2.6 ile 3.2.10 adımlarını izleyin, ancak geri süspansiyon hacmini 52°L ve son elüsyon hacmini 50°L olarak değiştirin.</li>
		<li>PCR arınma boncuk protokolünü adım 3.3.6'dan 50 μL elüsiyon ile tekrarlayın, ancak geri süspansiyon hacmini 22 μL ve son elüsyon hacmini 20 μL olarak değiştirin. NOT: Hemen devam edilmezse, numuneler -20 °C'de 7 güne kadar saklanabilir.</li>
		<li>Her örneğe 5 000 ADET PCR Primer Kokteyl ve 25 000 ADET PCR Master Mix ekleyin. 10 kez yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak karıştırın. Reaksiyonu önceden programlanmış, önceden ısıtılmış bir termocycler bloğunda aşağıdaki parametreleri kullanarak kuluçkaya yatırın: 30 s için 98 °C; daha sonra 10 s için 98 °C'nin 8 döngüsü, 30 s için 60 °C ve 30 s için 72 °C; sonra 72 °C için 5 dk, sonra 4 °C tutun. NOT: Sıralama için yeterli miktarda kitaplık oluşturmak için toplam PCR döngüsü sayısının optimizasyonu gerekebilir.</li>
		<li>PCR boncuk arınma protokolünü (3.2.4'ten 3.2.9'a kadar) uygulayın, ancak 50 μL iyi karıştırılmış PCR saflaştırma boncukları ekleyin ve geri süspansiyon hacmini 30 μL'lik son bir elüsasyon hacmiyle 32,5 μL'ye değiştirin. NOT: Numuneler -20 °C'de saklanmalıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>Nükleik asit analizörü kullanılarak Niceleme ve Kalite Kontrolü<ol>
<li>Bantların ve reaktiflerin oda sıcaklığında 30 dakika boyunca dengede olmasını bekleyin.</li>
		<li>2 μL'lik kitaplığı 2 μL HS D1000 arabelleğiyle karıştırın ve uyumlu bir kuyu plakasına ekleyin.</li>
		<li>Uyumlu folyo conta ile sıkıca kapatın ve 2000 rpm'de 1 dk girdap.</li>
		<li>Yazılım istemlerini izleyerek analizöre plakayı indirin ve yükleyin. NOT: Kütüphaneler yaklaşık 260 bp boyutunda olmalıdır.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Veri Analizi İş Akışı
<ol><li>Sıra RNA-seq kitaplıkları (Bkz. Malzeme Tablosu) oluşturmak için 82 bp eşleştirilmiş uçlu okumalar. Bcl2fastq aracını (v0.2.19) kullanarak ham sıralama verilerini basecall dosyaları (.bcl) şeklindefastq'lara dönüştürün.</li>
	<li>CircRNA'ları algıla. NOT: Daha önce bildirilen kanıtlara dayanarak bir topluluk circRNA algılama yaklaşımı tek bir algılama aracı21,22kullanarak karşılaştırıldığında daha iyi performans , biz circRNA algılama için birden fazla araç kullanarak öneririz. Burada, circRNA'lar mevcut altı circRNA tahmin algoritması kullanılarak tanımlanmıştır: find_circ, CIRI, CIRCexplorer, Mapsplice, KNIFE ve DCC, her algoritma için önerilen parametre ayarlarını uygulayarak.<ol>
<li>Geliştiriciler tarafından sağlanan yönergeleri kullanarak her circRNA algılama algoritmasını linux yüksek performanslı bilgi işlem kümesine indirin ve kurun.</li>
		<li>RNA-seq FASTQ'ları referans genomuna (GRCh37) göre hizalayın ve her bir araç için önerilen hizalayıcıyı kullanın.</li>
		<li>Hizalamayı takiben, ilgili önerilen parametre ayarlarını uygulayarak circRNA algılama algoritmalarını çalıştırın.</li>
		<li>Her araç, algılanan circRNA'ların listesini içeren çok sütunlu bir sonuç dosyası çıkar, her örnek/test koşulunda tespit edilen aday sayısını ölçmek için circRNA koordinatlarını ve destekleyici okuma sayısını ayıklayacaktır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>CIRCRNA koordinatçıktısını CIRI, Mapsplice ve DCC'nin diğer üç algoritmayla tutarlı olması için 0 tabanlı koordinatlara dönüştürün.</li>
	<li>İki veya daha fazla destekleyici okuma veya aşağı akış analizleri ve karşılaştırmaları ile circRNA'ları seçin. Tablo 1, çalışmamızda değerlendirilen tüm parametreleri ve her örnek için oluşturulan sıralama okumalarının toplam sayısını özetlemektedir.</li>
	<li>Her örnek/test koşulu için, bu kitaplık için oluşturulan haritalı okuma sayısına normalleştirilen algılanan circRNA sayısını milyonda sayın. Sonuçları, Temsilci Sonuçlarında ayrıntılı olarak belirtildiği gibi, kutu çizimlerinde bulunan çeşitli araçlar/örnekler arasında özetleyin.</li>
</ol>

<ol><li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PloS One. 7 (2), e30733(2012).</li>
<li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+are+abundant%2C+conserved%2C+and+associated+with+ALU+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li>
<li>Memczak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+are+a+large+class+of+animal+RNAs+with+regulatory+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency.</a> Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).</li>
<li>Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viroids+are+single-stranded+covalently+closed+circular+RNA+molecules+existing+as+highly+base-paired+rod-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (11), 3852-3856 (1976).</li>
<li>Nigro, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrambled+exons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Scrambled exons.</a> Cell. 64 (3), 607-613 (1991).</li>
<li>Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type+specific+features+of+circular+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cell-type specific features of circular RNA expression.</a> PLoS Genetics. 9 (9), e1003777(2013).</li>
<li>Du, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxo3+circular+RNA+promotes+cardiac+senescence+by+modulating+multiple+factors+associated+with+stress+and+senescence+responses%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses.</a> European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).</li>
<li>Capel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+transcripts+of+the+testis-determining+gene+Sry+in+adult+mouse+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis.</a> Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).</li>
<li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA-dependent+gene+silencing+involving+Ago2-mediated+cleavage+of+a+circular+antisense+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA.</a> The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).</li>
<li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+RNA+circles+function+as+efficient+microRNA+sponges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges.</a> Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon-intron+circular+RNAs+regulate+transcription+in+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).</li>
<li>Tan, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+landscape+of+circular+RNA+expression+in+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">A landscape of circular RNA expression in the human heart.</a> Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).</li>
<li>Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+differential+circular+RNA+expression+profiles+reveals+the+regulatory+role+of+circTCF25-miR-103a-3p%2FmiR-107-CDK6+pathway+in+bladder+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma.</a> Scientific Reports. 6, 30919(2016).</li>
<li>Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CIRI%3A+an+efficient+and+unbiased+algorithm+for+de+novo+circular+RNA+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification.</a> Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573(2015).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MapSplice%3A+accurate+mapping+of+RNA-seq+reads+for+splice+junction+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery.</a> Nucleic Acids Research. 38 (18), e178(2010).</li>
<li>Szabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistically+based+splicing+detection+reveals+neural+enrichment+and+tissue-specific+induction+of+circular+RNA+during+human+fetal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development.</a> Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695(2015).</li>
<li>Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+identification+and+quantification+of+circular+RNAs+from+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).</li>
<li>Zhang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+sequence-mediated+exon+circularization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Complementary sequence-mediated exon circularization.</a> Cell. 159 (1), 134-147 (2014).</li>
<li>Rybak-Wolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+in+the+mammalian+brain+are+highly+abundant%2C+conserved%2C+and+dynamically+expressed%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed.</a> Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).</li>
<li>Ji, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+Expression+Landscape+and+Prioritization+of+Circular+RNAs+in+Mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals.</a> Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).</li>
<li>Hansen, T. B., Venø, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+circular+RNA+prediction+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of circular RNA prediction tools.</a> Nucleic Acids Research. 44 (6), e58(2016).</li>
<li>Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+overview+and+evaluation+of+circular+RNA+detection+tools%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools.</a> PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420(2017).</li>
<li>Sekar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACValidator%3A+a+novel+assembly-based+approach+for+in+silico+validation+of+circular+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs.</a> bioRxiv. , (2019).</li>
<li>Westholm, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+drosophila+circular+RNAs+reveals+their+structural+and+sequence+properties+and+age-dependent+neural+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation.</a> Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).</li>
<li>Szabo, L., Salzman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+circular+RNAs%3A+bioinformatic+and+experimental+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).</li>
<li>Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+full-length+circular+RNAs+enables+isoform-level+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification.</a> Genome Medicine. 11 (1), 2(2019).</li>
<li>Beach, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arizona+study+of+aging+and+neurodegenerative+disorders+and+brain+and+body+donation+program%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology%22%5BJournal%5D)">Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program.</a> Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu çalışmada, circRNA sıralama kitaplıklarının inşası için circRNA zenginleştirme protokolünü optimize etmek amacıyla ticari olarak kullanılabilen iki kütüphane hazırlama kitleri, ön işlem seçenekleri ve giriş RNA miktarları test edilmiştir. Bu çalışmanın değerlendirmelerine dayanarak, circRNA sıralama kitaplıklarının oluşturulmasında önemli ve kritik adımlar ortaya çıkmıştır. Değerlendirmemiz, tespit edilen circRNA sayısının artmasıyla yansıtTığı üzere RNase R ön arıtmanın yararını doğrulamaktadır. Genel olarak, RNase R...

Dairesel RNA'lar (CircRNA'lar) ökaryotik transkripsiyon1,2,3'teyaygın olarak ifade edilen endojen, kodlamayan RNA'lardır. Onlar exons birbirlerine geri-splice oluşur ve bu nedenle başlangıçta eserler4,5birleştirme olarak kabul edildi . Ancak, son çalışmalar, circRNA'ların hücre tipini, dokuyu ve gelişim evresine özgü ekspresyonu3,6 ve evrimsel olarak korunmuş2,3olduğunu göstermiştir. Ayrıca, protein-protein etkileşimleri arabuluculuk yer almaktadır7, mikro-RNA (miRNA) bağlayıcı3,8,9,10, ve ebeveyn gen transkripsiyon11düzenlenmesi .
Klasik RNA diziliminde (RNA-seq), circRNA'lar mRNA'lar için poli-A seçimi sonucunda kütüphane inşaatı sırasında tamamen kaybolabilir veya düşük bollukları göz önüne alındığında izole edilmesi zor olabilir. Ancak, son circRNA karakterizasyon çalışmaları amacıyla circRNA2,12,13için zenginleştirmek için RNase R kullanarak bir ön tedavi adımı dahil var. RNase R, dairesel RNA yapılarını geride bırakarak lineer RNA'ları sindiren bir exoribonuclease'dir. CircRNA zenginleştirme protokolleri, rnase R ön işlem adımı olan ve olmayan iki ticari olarak kullanılabilen tüm transkripsiyon kitaplığı yapı kitlerinden elde edilen verilerin üretilmesi ve karşılaştırılması ve değişen miktarlarda toplam RNA girişi kullanılarak optimize edilmiştir (1 ila 4 g). Optimize edilmiş protokol daha sonra beş farklı beyin bölgesinde (beyincik [BC], inferior parietal lob [IP], orta temporal girus [MG], oksipital korteks [OC] ve üstün frontal girus [SF]) ve diğer dört doku tipi (karaciğer [LV], akciğer [LU], lenf nodu [LN] ve pankreas [PA]) arasında circRNA bolluğunu değerlendirmek için kullanıldı. RNA-seq kütüphaneleri sıralı olarak eşleştirilmiş ve veriler altı farklı circRNA tahmin algoritmaları kullanılarak analiz edildi: find_circ3, CIRI14, Mapsplice15, KNIFE16, DCC17, ve CIRCexplorer18. Analizlerimize göre, RNase R ön işlem ve 4 μg toplam giriş RNA ile mahsur toplam RNA kütüphane hazırlama kiti kullanılarak en yüksek sayıda benzersiz circNA tespit edilmiştir. Optimize edilmiş protokol burada açıklanmıştır. Daha önce bildirildiği gibi19,20, circRNA en yüksek zenginleştirme diğer doku tipleri ile karşılaştırıldığında beyinde gözlendi.

<table><tbody><tr><td>1.000 ve mikro; L pipet uçları</td><td>Rainin</td><td>GP-L1000F</td><td></td></tr><tr><td>20 & L pipet uçları</td><td>Rainin</td><td>SR L 10F</td><td></td></tr><tr><td>200 & L pipet uçları</td><td>Rainin</td><td>SR L 200F</td><td></td></tr><tr><td>2200 TapeStation Aksesuarları (folyo kapaklar)</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5154</td><td></td></tr><tr><td>2200 TapeStation Aksesuarları (uçlar)</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5153</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplakalar için Yapışkan Film</td><td>VWR</td><td>60941-064</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP Boncukları 450 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td>PCR saflaştırma</td></tr><tr><td>Eppendorf twin.tec 96 Kuyulu PCR Plakaları</td><td>VWR</td><td>951020401</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Hassasiyetli D1000 reaktifleri</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Hassasiyetli D1000 Ekran Bandı</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500 Sıralama Sistemi</td><td>Illumina</td><td>SY-401-2501</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 3000/4000 PE Küme Kiti</td><td>Illumina</td><td>PE-410-1001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 3000/4000 SBS Kiti (150 döngü)</td><td>Illumina</td><td>FC-410-1002</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 4000 Sıralama Sistemi</td><td>Illumina</td><td>SY-401-4001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq PE Hızlı Küme Kiti v2</td><td>Illumina</td><td>PE-402-4002</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq Hızlı SBS Kiti v2 (50 döngü)</td><td>Illumina</td><td>FC-402-4022</td><td></td></tr><tr><td>Kapa Toplam RNA Kiti</td><td>Roche</td><td>KK8400</td><td></td></tr><tr><td>Moleküler biyoloji sınıfı etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP28184</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Test Tüpleri</td><td>Thermo Fischer tarafından Tedarik Merkezi</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA High Sense Test Kiti</td><td>Thermo Fischer tarafından Tedarik Merkezi</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>RNA temizleme ve yoğunlaştırıcı - 5</td><td>Zymo</td><td>RCC-100</td><td>Saflaştırma kolonları, toplama tüpleri içerir</td></tr><tr><td>RNAClean XP boncukları</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td></td><td>RNA Temizleme boncukları</td></tr><tr><td>Rnase R</td><td>Lucigen</td><td>RNR07250</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Ters Transkriptaz 10.000 birim</td><td>ThermoFisher (LifeTech)</td><td>18064014</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation 2200</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>Nükleik Asit analizörü</td></tr><tr><td>TElowE</td><td>VWR</td><td>10128-588</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Örgülü Toplam RNA Kitaplığı Hazırlık Kiti</td><td>Bölüm 3'te kullanılan</td><td>Illumina</td><td>20020596</td> Kiti</tr><tr><td>İki Bölmeli Bölünmüş Tepsi</td><td>VWR</td><td>3054-1004</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Fischer</td><td>10977-015</td><td></td><td>tarafından UltraPure Su</td> Temini Merkezi</tr><tr><td>Evrensel kontrol RNA</td><td>Agilent</td><td>740000</td><td></td></tr></tbody></table>

rna sıralaması kullanılarak dairesel rna'ların tanımlanması

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Dairesel RNA'lar (circRNA'lar), mikro-RNA (miRNA) düzenlemesi, protein-protein etkileşimlerinin arabuluculuğu ve ebeveyn gen transkripsiyonunun düzenlenmesi gibi işlevlerde yer alan kodlamayan RNA'lar sınıfıdır. Klasik yeni nesil RNA sıralamasında (RNA-seq), circRNA'lar genellikle mRNA kitaplıklarının inşası sırasında poli-A seçiminin bir sonucu olarak gözden kaçırılır veya çok düşük bollukta bulunur ve bu nedenle izole etmek ve tespit etmek zordur. Burada, bir circRNA kütüphane inşaat protokolü kütüphane hazırlama kitleri, ön işlem seçenekleri ve çeşitli toplam RNA giriş miktarları karşılaştırılarak optimize edildi. RNase R ön işlem li ve olmayan ve değişken miktarda toplam RNA girişi (1 ila 4 g) kullanılarak, ticari olarak kullanılabilen iki tam transkripsiyon kitaplığı hazırlama kitleri test edildi. Son olarak, birden fazla doku tipleri; karaciğer, akciğer, lenf düğümü ve pankreas dahil; yanı sıra birden fazla beyin bölgeleri; beyincik dahil, inferior parietal lob, orta temporal girus, oksipital korteks, ve üstün frontal girus; doku tipleri arasında circRNA bolluğunu değerlendirmek için karşılaştırıldı. Altı farklı circRNA algılama aracı (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC ve CIRCexplorer) kullanılarak oluşturulan RNA-seq verilerinin analizi, RNase R ön işlem ve 4 μg RNA girişi ile mahsur toplam RNA kitaplık hazırlama kitinin en uygun olduğunu ortaya koymuştur. circRNA'ların en yüksek göreli sayısını belirleme yöntemi. Önceki bulgularla tutarlı olarak, beyin dokularında diğer doku tiplerine göre en yüksek circRNA zenginleştirme gözlendi.

Ticari olarak kullanılabilen evrensel kontrol RNA (UC) kullanılarak ve her ikisi de protokollerinde ribo-tükenme adımı içeren iki kitaplık hazırlama kitleri kullanılarak oluşturulan veriler ilk olarak değerlendirildi. Truseq veri kümelerinde Kapa veri kümelerine göre daha yüksek sayıda circRNA saptandı (Veri analizi iş akışı, bölüm 4), genel olarak (Şekil 1). Ribozomal RNA (rRNA) yüzdeleri daha düşük giriş miktarları için her iki kitten (1, 2 ug) veri kümelerinde %5'in altında olmasına rağme...

Dairesel RNA'lar (circRNA'lar), transkripsiyonel düzenlemede ve proteinler arasındaki iletişimlerde rol alabilecek kodlamayan RNA'lardır. CircRNA sıralama kütüphanelerinin inşası için farklı parametrelerin değerlendirilmesinin ardından, RNase R ön arıtma ile mahsur kalan toplam RNA kitaplığı hazırlığı kullanılarak bir protokol derlenmiş ve burada sunulmuştur.

RNA Sıralaması Kullanılarak Dairesel RNA'ların Tanımlanması

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Bu protokol, kit tipi, RNase R tedavisi, giriş miktarları ve bunların circRNA tespiti üzerindeki etkileri gibi circRNA kitaplık hazırlamanın temel yönlerini değerlendirmenin bir sonucudur. En iyi circRNA algılamasını sağlar ve kullanıcının ihtiyaçlarına bağlı olarak ayarlanabilir parametreler hakkında veri sağlar. Farklı örnek türlerinde circRNA'ların belirlenmesi, ifadelerinin dağılımını daha iyi anlamamıza yardımcı olacak ve bu moleküllerin işlevsel rolünün belirlenmesine zemin hazırlar.Bu yöntem herhangi bir toplam RNA örneğine uygulanabilir. Protokolbaşlamadan önce RNA örneklerini buzda tutmak önemlidir. Hazırlıktan önce Agilent Bioanalyzer veya TapeStation'daki RIN ve DV200 değerlerini değerlendirin ve RNA ile çalışırken uygun prosedürleri uygulayın.Toplam RNA'yı 39 mikrolitre RNase içermeyen suda dört mikrograma seyrelterek ve karıştırmak için yukarı ve aşağı borulandırarak başlayın. Ayrı bir tüpte, RNase R'yi mikrolitre başına iki birimlik bir çalışma konsantrasyonuna seyreltmek için 1x RNase R Tampon kullanın. Pipet 39 mikrolitre toplam RNA ve 10x RNase R Reaksiyon Tampon beş mikrolitre 1.5-mikrolitre reaksiyon tüpü içine, ve karıştırın.Seyreltilmiş RNase R.Then tam reaksiyon hacmine pipet ayarlamak ve 10 kez yukarı ve aşağı boru lama tarafından çözelti karıştırın altı mikrolitre ekleyin. Tüpü 37 derecelik bir su banyosuna 10 dakika yerleştirin ve tam reaksiyon hacminin su banyosuna daldırDığından emin olun. Sonra, buz üzerinde tüp yerleştirin ve hemen RNA temizleme ve konsantrasyon ile devam edin.Başlamadan önce, konsantreyi %100 etanolün 48 mililitresi ile karıştırarak RNA Yıkama Tamponu'nu hazırlayın ve arınma kolonlarını toplama tüplerine yerleştirin. Hazır olduğunuzda, RNaR işlem görmüş örneğe iki cilt RNA Bağlama Arabelleği ekleyin ve iyice karıştırın. Toplam 300 mikrolitre karışıma 150 mikrolitre %100 etanol ekleyin, tüm hacmi kolona aktarın ve 30 saniye santrifüj yapın.Akışı kaldırın ve doğrudan sütuna 400 mikrolitre RNA Hazırlık Arabelleği ekleyin. 30 saniye santrifüj ve akışı atın. Ardından, sütuna 700 mikrolitre RNA Yıkama Tamponu ekleyin, 30 saniye santrifüj yapın ve akışı atın.Yıkama Tamponbaşka 400 mikrolitre ekleyin, iki dakika için santrifüj, ve taze bir RNase-free 1.5 mililitre tüp sütun aktarın. Pipet ucunu kolon filtresinin hemen üzerinde tutarak doğrudan kolona 11 mikrolitre RNase içermeyen su ekleyin. Örnek oda sıcaklığında bir dakika oturup, ve sonra bir dakika için santrifüj edelim.1,5 mililitrelik tüpte akış olduğundan emin olun ve sütunu atın. Saflaştırılmış RNA örneği eksi 80 derecede saklanabilir veya kütüphane hazırlığı için hemen kullanılabilir. Saflaştırılmış toplam RNA'nın 10 mikrolitresini 96 kuyulu bir PCR plakalı temiz bir kuyuya aktarın.RRNA Bağlama Tampon beş mikrolitre ekleyin ve rRNA Kaldırma Mix beş mikrolitre ardından, sonra yavaşça pipet yukarı ve aşağı reaktifleri karıştırmak için. Plakayı kapatın ve önceden programlanmış ve önceden ısıtılmış bir termocycler bloğunda 68 santigrat derecede beş dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, plaka bir dakika oda sıcaklığında oturalım.Mührü plakadan çıkarın ve numuneye 35 mikrolitre girdaplı oda sıcaklığında rRNA kaldırma boncukları ekleyin. Pipeti 45 mikrolitreye, pipetleri de iyice karıştırmak için 10 ila 20 kez yukarı ve aşağı ayarlayın. Plaka bir dakika oda sıcaklığında oturalım.Plakayı manyetik bir standa aktarın ve bir dakika veya çözelti temize çıkana kadar orada kuluçkaya yatırın. Supernatant'ı plakadaki yeni kuyuya aktarın. Daha sonra plakayı manyetik standdan plaka standına aktarın.Vortex RNA iyi dağılmış kadar boncuk temizleme ve örnek için boncuk 99 mikrolitre ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı karıştırmak için, ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca tabak kuluçka. Plakayı manyetik standa aktarın ve beş dakika veya çözelti temize çıkana kadar orada bırakın, sonra tüm supernatant'ı kuyudan çıkarın ve atın.Plaka hala manyetik stand üzerinde yken, boncukları bozmadan kuyuya 200 mikrolitre taze hazırlanmış %80 etanol ekleyin. 30 saniye boyunca kuyuda etanol bırakın, sonra çıkarın ve atın. Kuyuya 11 mikrolitre Elütion Tampon ekleyin ve karıştırmak için yukarı ve aşağı pipet.Plakayı oda sıcaklığında iki dakika kuluçkaya yatırın, sonra manyetik standa geri aktarın ve çözelti temize çıkana kadar orada tutun. Süpernatantın 8,5 mikrolitresini aynı plakaüzerindeki yeni bir kuyuya aktarın ve numune içeren her kuyuya 8,5 mikrolitre Elute, Primer, Fragment High Mix ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı 10 kez iyice karıştırmak için, plaka mühür ve 94 santigrat derece önceden ısıtılmış bir termocycler sekiz dakika kuluçka.Numuneyi dört dereceye kadar soğutun, plakayı termocycler'dan çıkarın ve kısa bir süre santrifüj edin. Bu protokol için TruSeq ve KAPA olmak üzere iki kütüphane hazırlama kitleri değerlendirildi. Genel olarak, TruSeq kiti ni kullanırken daha yüksek sayıda dairesel RNA ve daha düşük ribozomal RNA yüzdesi saptandı, bu yüzden daha fazla deney için TruSeq seçildi.RNase R ön tedavisinin önemi, önceden tedavi edilmiş ve tedavi edilmeyen kütüphanelerden elde edilen veriler karşılaştırılarak değerlendirildi. Beklendiği gibi, önceden tedavi edilmeyen kütüphanelere kıyasla, daha yüksek sayıda dairesel RNA tutarlı bir şekilde önceden tedavi edilmemiş kütüphanelerde tanımlanmıştır. Giriş RNA miktarı dairesel RNA'ların daha yüksek bir çeşitliliğini tespit etmek için optimize edildi.Kütüphaneler bir, iki ve dört mikrogram giriş RNA kullanılarak hazırlandı ve dört mikrogram toplam RNA kullanırken dairesel RNA türlerinin en yüksek çeşitliliği gözlendi. Optimize edilmiş protokol, dört sağlıklı donörden beş beyin bölgesinde ve altı sağlıklı donörün diğer doku tipleri için dairesel RNA bolluklarını karşılaştırmak için kullanılmıştır. Genel olarak, dairesel RNase daha yüksek bir bolluk diğer doku tiplerine göre beyinde gözlendi.RNA ile çalışırken eldiven takmak, protokole başlamadan önce tezgah ve pipetleri RNase mendilleriyle veya spreyle iyice temizlemek ve RNA'yı önceden buzda tutmak da dahil olmak üzere uygun prosedürleri izlemeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, tanımlanan circRNA kavşaklarının Sanger sıralanması gibi ortogonal doğrulama yapılabilir. Yeni circRNA'ların keşfi ve onların varlığına dair daha fazla kanıt, biyolojik işlevlerini keşfetmek için yeni bir araştırma alanı ortaya çıkarıyor.

identification-of-circular-rnas-using-rna-sequencing

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Dairesel RNA'lar üreten muhabir genleri klonlayıp analiz ediyoruz. Bu muhabir genler doğrusal birleştirme analiz etmek ve Alu elemanları içeren yapılar daha büyüktür. Dairesel RNA'ları araştırmak için yapılar hücrelere dönüştürülr ve doğrusal RNA çıkarıldıktan sonra RT-PCR kullanılarak ortaya çıkan RNA analiz edilir.

Dairesel RNA'ları Analiz Etmek Için Minigen İçeren Alu Elementin Kullanımı

Burada, endojen RNA bağlayıcı siteleri veya RNA: protein (RNP) kompleksler "ayak izleri" mammalin hücrelerden zenginleştirmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım RNP alt paketleri iki immünoprecipitations içerir ve bu nedenle tandem RNA immünopresipitasyon dubbed (ripit).

RNA 'nın ayak Izleri tanımlaması: proteinli kompleksleri RNA Immunoprecipitation ile tandem sonra sıralamayı (RIPiT-seq)

Dairesel RT-PCR, nicel RT-PCR, RNA 5 ' polyphosphatase-Treatment ve Kuzey Blot 'u birleştirerek döngüsel bir RT-PCR tabanlı strateji sunuyoruz. Bu protokol dengesiz 5 ' trifosfat etkisini en aza indirmek için bir normalleştirme adım içerir, ve ayrımcılık ve, Mısır mitochondrion dengeli birikmiş birincil ve işlenmiş transkriptler haritalama için uygundur.

Dairesel bir RT-PCR tabanlı strateji kullanarak Maize mitochondrion 'da primer ve Işlenmiş transkriptlerin ayrımcılık ve haritalama

Bu protokol, farklı primerler kullanılarak hücrelerdeki dairesel RNA (circRNA) seviyelerinin hassas bir şekilde ölçülmesi için ayrıntılı dijital damlacık PCR (dd-PCR) yöntemini açıklamaktadır.

Dairesel RNA'ların Dijital Damlacık PCR Kullanılarak Nicelleştirilmesi

Burada sunulan protokol, konakçı-patojen etkileşimlerini inceleyen RNA dizileme transkriptom verilerinden sirkRNA'ları tahmin etmek ve işlevsel olarak karakterize etmek için gereken in silico boru hattının tamamını açıklamaktadır.

Burada: Silico Konakçı-Patojen Etkileşimleri Sırasında SirkRNA'ların Tanımlanması ve Karakterizasyonu

Mutlak miktar tayini RNA dizilimi (AQRNA-seq), biyolojik karışımlardaki tüm küçük RNA'ların manzarasını ölçmek için geliştirilmiş bir teknolojidir. Burada, açlığın neden olduğu uyku hali sırasında Mycobacterium bovis BCG'deki transfer RNA (tRNA) havuzundaki değişiklikleri ölçen AQRNA-seq'nin hem kütüphane hazırlama hem de veri işleme adımları gösterilmektedir.

Küçük RNA'ları Ölçmek için AQRNA-seq

Tek hücre sıralama yüksek çözünürlükte genomik değişikliklerin ele almak için giderek daha popüler ve erişilebilir bir araçtır. Biz tek hücrelerde kopya sayısı değişiklikleri tanımlamak için tek bir hücre sıralama kullanan bir protokol sağlar.

Tek Hücre sıralama kullanarak Kopya sayısı Değişmeler Algılama

Burada, intramoleküler ve molekül içi RNA-RNA etkileşimlerinin in vivo genom geneli haritalamasını mümkün kılan P soralen çapraz bağlanmış, L ve s seçilmiş H zincirlerinin (SPLASH) eşitliğinin yöntemini ayrıntılı olarak açıklıyoruz. SPLASH maya, bakteri ve insanlar dahil olmak üzere organizmaların RNA etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir.

RNA-RNA Etkileşmelerini Biyotinlenmiş Psooren Kullanarak Küresel Olarak Haritalama

Galaxy ve DAVID biyoinformatik eğitim olmadan araştırmacılar analiz etmek ve RNA-Seq verileri yorumlamak için izin popüler araçlar olarak ortaya çıkmıştır. C. elegans araştırmacılar RNA-Seq deneyler, erişimi gerçekleştirmek ve Galaxy kullanarak veri kümesi işlemek ve DAVID kullanarak gen listelerinden anlamlı biyolojik bilgi elde etmek için biz bir protokol açıklar.

arasında Transkriptomik Analizi<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</emGalaxy Projesi Smokin Suite sayesinde&gt; RNA Sıralama Veri

Biz orijinal bir transfer RNA analizi platformu nokta (akıcı tRNA gözlemlemek için Platform) adlı tanımlamak. Nokta aynı anda hücresel düzeyde tüm tRNA biyolojik örnekleri, sadece üç adım ve 24 saatten az bir süre ölçer.

Metabolik etiketleme ve Transfer RNA Macroarrays kullanarak profil oluşturma

Öğrenin, dairesel RNA kütüphane hazırlama protokolünü optimize ederek RNase R işlemi ve giriş miktarlarının etkisini değerlendirin. Bu yöntem, circRNA tespiti için optimal koşulları belirleyerek gen ifadesi dağılımını anlamanıza yardımcı olur.

RNA Sıralaması Kullanılarak Dairesel RNA'ların Tanımlanması

Daha fazla video keşfet