Name: Disanated primer hipokampal kültürlerde glutamat reseptör kaçakçılığı çalışması için antikor beslenme yaklaşımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Öğrenin, antikor besleme yöntemiyle primer hipokampal nöron kültürlerinde glutamat reseptör kaçakçılığını nasıl analiz edeceğinizi. Bu protokol, yüzey ifadesi ve içselleştirme mekanizmalarını incelemek için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nikon a1 Confocal mikroskop ve deneyler planlama ve analiz yardım onların kullanımı için Northwestern gelişmiş Microkopi merkezi teşekkür ederiz. Bu araştırma (T32GM008061) (A. M. C), ve NIA (R00AG041225) ve Brain & davranış Araştırma Vakfı (#24133) (A. S.-C.) bir NARSAD genç araştırmacı Grant tarafından desteklenmektedir.

Hipokampal İlköğretim kültürü hazırlığı ile ilgili çalışmalar Northwestern Üniversitesi hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (protokol #IS00001151) tarafından incelendi ve onaylanmıştır.
1. etiketleme öncesi hazırlık
<ol><li>
Primer hipokampal kültürlerin hazırlanması ve Bakımı
	<ol>
<li>Primer hipokampal kültürlerini Poly-D-lizin kaplı (0,1 mg/mL) 18 mm kapak gözlüklerinde kaplama 150.000 hücrelerin yoğunluğunda hazırlayın. Dissosyated nöronal kültür hazırlığı için mükemmel kılavuzlar7,8mevcuttur. Not: Gerekirse, kültürler, hazırlıkta glial proliferasyonu önlemek için sitosin arabinozid (ara-C, Div1 kullanılmaktadır den 10 mm) ile tedavi edilebilir. Not: Poli-D-lizin yerine fibronektin (1 mg/mL) veya laminin (5 mg/mL) gibi alternatif kaplama reaktifler kullanılabilir.</li>
		<li>37 °C ve 5% CO2 ' de 2 ml/iyi neurobazal medyanın, B27 ve 2 mm L-glutamin ile takviye edilen bir hücre inkükokosu kültürlerini koruyun. Not: L-glutamin yerine (örneğin, Glutamax) istenirse kullanılabilir.</li>
		<li>Haftalık bazda, ortamın yarı hacmini kaldırın ve aynı hacimli nörobazal medya ile değiştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
OPSIYONEL: mutasyona uğramış ve/veya epitope etiketli reseptörlerin transfeksiyon Not: nöronlar reseptör ifadesi için izin vermek için analiz zaman noktasından en az 3 – 4 gün önce transfitleştirilebilir. Genç nöronların kullanımı [Days In vitro 6 – 9 (DIV6)] daha eski daha iyi transfeksiyon verimliliği sonuçlanır (DIV15 – 20) nöronlar, ama transfekte hücrelerin yeterli sayıda (> 20) ne olursa olsun DIV istihdam elde edilebilir.<ol>
<li>Her iyi için bir 12-kuyu plaka, seyreltme 1,5 μg Plasmid ile ilgili yapı içeren 100 μL yeni nörobasal medya içinde B27 veya glutamin takviyesi olmadan bir mikrosantrifüjden tüp ve karışımı ile hızlı bir şekilde vortekslenir. Not: Başarılı transfeksiyon için, kullanılan nörobazal medyanın mümkün olduğunca taze, şişe açıldıktan sonra 1 haftadan daha az olması önemlidir.</li>
		<li>İkinci bir mikrosantrifüj tüpte, 100 μL 'de uygun bir lipofeksiyon reakajının 1 μL değerini taze nörobazal medya ile karıştırın ve nazikçe karıştırın. Not: Lipofeksiyon reakajının karışımına girdap yapmayın. Taze lipofeksiyon reaktiflerin kullanımı transfeksiyon verimliliğini artırabilir.</li>
		<li>Tüplerin oda sıcaklığında (RT) 5 dakika süreyle inküytir.</li>
		<li>DNA karışımı için lipofection reaktif karışımı dropwise ekleyin, hafifçe karıştırın ve RT 20 dakika boyunca inküye.</li>
		<li>Ortamın hacmini her iyi 1 mL 'ye kadar ayarlanabilir medya olarak ayarlayın.</li>
		<li>Lipofection reakajı ekleyin-DNA karışımı kuymaya dropwise.</li>
		<li>Hücreleri inkükule dönün ve protein ifadesi için en az 3 – 4 gün izin verin. Not: Aşağıda özetlenen ınterevalizasyon ve geri dönüşüm protokollerinin amaçları için, hipokampal nöronlar DIV11 – 12 ' de transfidat edildi ve DIV15 – 16 ' da görüntülenmiş, GluN2B ' de GFP ile etiketlenen (GFP-GluN2B)</li>
	</ol>
</li>
	<li>
OPSIYONEL: sabitlenme kadar, şartlý medyada ilaçlar (kronik veya acutely) ile hücrelerin Inkübasyon. Not: akut tedavi için, etiketleme öncesinde hücreleri tedavi etmeye başlayın. Kullanılan ilaç tedavi protokolüne bağlı olarak, hücreler Bölüm 2 ' de ilaç içeren medyada muhafaza edilebilir. Bizim örneğimizde, DIV21 hücreler yüzey ifade AMPAR9artırmak Için bir cltp protokolüne tabi.<ol>
<li>Ekstrellüler çözüm (ECS) için Döviz şartında medya.</li>
		<li>RT 'de 3 dakika boyunca ECS 'de 300 μM gcine ile hücreleri tedavi edin. Bir kontrol olarak, ECS ile bir kardeş lamel magazini tedavi (glisiye olmadan).</li>
		<li>37 °C ECS ile hücreleri 3x yıkayın ve Bölüm 2 ile devam etmeden önce 20 dakika boyunca hücre kuluçkan (Glycine olmadan) ECS hücreleri döndürür. Not: ECS (mm cinsinden): 150 NaCl, 2 CAcl2, 5 KCl, 10 HEPES, 30 GLIKOZ, 0,001 TTX, 0,01 Strychnine, ve 0,03 picrotoksin pH 7,4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. yüzey etiketleme canlı-ifade reseptörleri
<ol><li>
Etiketleme için coverfiş hazırlamak
	<ol>
<li>Reaktifler kaydetmek ve manipülasyon kolaylaştırmak için, Transfer Cover, hücre tarafı kadar bir parafin film kaplı tepsi. Not: Numunelerin kurumasına asla izin vermek önemlidir.</li>
		<li>37 °C ' de inkübasyon ve yıkama basamakları için şartlama ortamını kaydedin ve koruyun. Not: 18 mm 'lik coverslip için, antikor etiketleme için 75 – 100 μL medyaya sahip inkübasyon ve ıntermerasyon/geri dönüşüm için 120 – 150 μL önerilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Primer antikor ile yüzey reseptörlerinin etiketlenmesi
	<ol>
<li>RT 'de 15 dakika boyunca, şartların bulunduğu ortamlarda seyreltilmiş primer antikor hücrelerine sahip hücreler. Not: GFP-Tagged reseptörleri için, 1:1000 bir seyreltme tavşan Anti-GFP antikor kullanıldı. Endojen GluA1 için, fare Anti-GluA1 bir 1:200 seyreltme kullanılmıştır.</li>
		<li>Bir vakum pipet kullanarak antikor içeren medyayı dikkatle Aspire ve hücrelerle üç kez yıkayın. Not: Şartlanmış medya kullanılamıyorsa, tüm yıkama adımları 1 mM MgCl2 ve 0,1 mm CAcl2] içeren PBS + [fosfat TAMPONLU tuz (PBS) kullanılarak gerçekleştirilebilir. Yumuşak vakum aspirasyonu mevcut değilse bir mikropipet kullanarak manuel aspirasyon yapılabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. yüzey Ifadesi (Şekil 2)
<ol><li>
Yüzey-ifade reseptörleri ikincil antikor etiketleme
	<ol>
<li>PBS + ile bir kez yıkayın.</li>
		<li>% 4 paraformaldehit (PFA) ve 7 ila 8 dakika PBS 'de% 4 sukroz ile inküperasyon hücreleri düzeltin. Not: Metanol inkübasyon gibi diğer sabitleme yöntemlerinin aksine, PFA plazma membranı geçirmez ve bu nedenle yüzey ifade analizi için uygundur. Optimum sonuçlar için taze hazırlanmış PFA kullanın. PFA 'nın 4 °C ' de veya uzun süreli (30 gün kadar) depolama alanı-20 °C ' de kısa süreli depolanması, yeterli sabitleme için uygundur. Dikkat: PFA bilinen bir kanserojen olduğunu. Kullanım sırasında uygun kişisel koruyucu ekipman ve güvenlik kapağı kullanın.</li>
		<li>Hücreleri normal PBS ile üç kez yıkayın. Not: Alternatif olarak, 0,1 M gcine, PBS yerine PFA yıkamak için kullanılabilir, çünkü glisin hazırlanmasında arka plan artırabilir herhangi bir geri kalan fikfatif giderecek.</li>
		<li>RT 'de 30 dakika boyunca PBS 'de% 10 normal keçi serumu (NGS) ile inkükleme yaparak nonspesifik bağlayıcı siteleri engelleyin. Not: Engelleme süresi etiketleme üzerinde olumsuz etkileri olmadan uzatılabilir.</li>
		<li>Primer antikor etiketli reseptörlere (örn. yüzey ifade) etiket eklemek için PBS 'de% 3 NGS 'de% 1 h olarak floresan etiketli ikincil antikor ile inküye yapın. Not: Bu örneklerde, Alexa 555-konjuze ikincil antikorların bir 1:500 seyreltme: GFP etiketli reseptörleri için keçi Anti-tavşan ve GluA1 için keçi Anti-Mouse kullanıldı.</li>
		<li>Hücreleri PBS 3x ile yıkayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hücre içi reseptörlerin etiketlenmesi
	<ol>
<li>PBS 'de% 0,25 Triton X-100 ile hücreleri RT 'de 5 – 10 dakika boyunca geçirgen. Not: Antikor etiketleme ilk turda tüm yüzey epitopes kaplar kontrol etmek için, bu geçirgen adım bir kardeş kültüründe atılabilir. Bu durumda, hücre içi reseptörleri için hiçbir sinyal elde edilmelidir. Ayrıca, önceki bölüm 2 ' de hiçbir iç reseptörlerin etiketlenmemiş olduğunu kontrol etmek için (yani, kültürde plazma membranlarının bütünlüğünü gösteren), bir kardeş kültüründe geçirgen adım atılabilir ve bir ana antikor hücre içi protein (örn., PSD-95 veya MAP2) adım 2.2.1 ' de kullanılabilir. Bu koşullar altında bu birincil gelen sinyal alınamıyor. Bu durumda, bir tavşan Anti-PSD-95 antikor (1:500) kullanıldı.</li>
		<li>RT 'de 30 dakika boyunca PBS 'de% 10 NGS ile engelle.</li>
		<li>Etiket hücre içi reseptörleri, 1 h RT 'de PBS 'de% 3 NGS 'de seyreltilmiş, Bölüm 2,2 kullanılan aynı primer antikor ile geçirgenleştirilmiş hücreleri inküt ederek. Not: Hücre içi reseptörleri etiketleme için antikor seyreltme yüzey ifade reseptörleri etiketleme için gerekli olandan farklı olabilir. GluA1 örneğinde aynı antikor seyreltme (1:200) kullanılmıştır.</li>
		<li>Hücreleri 3x PBS ile yıkayın.</li>
		<li>İkinci floresan etiketli ikincil antikor ile etiket, RT 'de 1 h için PBS 'de% 3 NGS 'de seyreltilmiş. Not: Bu örneklerde, keçi Anti-fare Alexa 647-konjudi ikincil antikor (GluA1 için) bir 1:500 seyreltme kullanıldı.</li>
		<li>Hücreleri 3x PBS ile yıkayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ınterilasyon (Şekil 3)
<ol><li>
Antikor etiketli yüzey reseptörlerinin içselleştirilmesi
	<ol>
<li>Yüzey-ifade reseptörleri ve antikor yıkama (Bölüm 2,2) etiketlemeden sonra, antikor olmadan şartsız medyada hücreleri korumak ve inkübe (37 °C) geri atıkları için izin vermek. Not: NMDA reseptörleri için, 30 dk. Bir kontrol olarak, bir kız kardeş kültürü, staj sürecinde 4 °C ' de şartla medya ile korunabilir. Bu koşullarda minimal reseptör ıntertralization gerçekleşmelidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Yüzey reseptörlerinin etiketlenmesi
	<ol>
<li>PBS + ile bir kez hücreleri yıkayın.</li>
		<li>PBS 'de% 4 PFA ve% 4 sukroz olan hücreleri 7 – 8 dakika boyunca düzeltin. Dikkat: PFA 'yı ele aldığınızda uygun kişisel koruyucu ekipman ve güvenlik kapağı kullanın.</li>
		<li>Normal PBS ile 3x hücreleri yıkayın.</li>
		<li>PBS 'de% 10 NGS ile Block, nonspesifik bağlayıcılığı önlemek için 30 dk.</li>
		<li>Primer antikor etiketli reseptörlerin etiketlenmesi için PBS 'de% 3 NGS 'de 1 h olarak seyreltilmiş floresan etiketli ikincil antikor ile numuneleri inkük (örn. Not: Bu örnekte, Alexa 555-Conjugated keçi Anti-tavşan ikincil antikor (1:500) etiketleme için kullanıldı.</li>
		<li>Hücreleri 3x PBS ile yıkayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Interselleştirilmiş reseptörlerin etiketleme
	<ol>
<li>PBS 'de% 0,25 Triton X-100 ile hücreleri 5 – 10 dakika boyunca geçirgen.</li>
		<li>RT 'de 30 dakika boyunca PBS 'de% 10 NGS ile inkübasyon ile nonspesifik bağlayıcılığı engelleyin.</li>
		<li>Örneklenmiş antikor etiketli reseptörlerin etiketlenmesi için RT 'de 1 h için PBS 'de% 3 NGS 'de seyreltilmiş floresan etiketli ikincil antikor ile numuneleri kulbin. Not: Bu örnekte, Alexa 647-Conjugated keçi Anti-tavşan ikincil antikor (1:500) etiketleme için kullanılır.</li>
		<li>Hücreleri 3x PBS ile yıkayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. geri dönüşüm (Şekil 4)
<ol><li>
Antikor etiketli yüzey reseptörlerinin içselleştirilmesi
	<ol>
<li>Yüzey-ifade reseptörleri ve antikor yıkama (Bölüm 2,2) etiketlemeden sonra, antikor olmadan şartsız medyada hücreleri korumak ve inkübe (37 °C) geri atıkları için izin vermek. Not: NMDA reseptörleri için, 30 dk.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
İstikrarlı yüzey bloke reseptörleri ifade
	<ol>
<li>Birincil antikor üzerinde epitopları engellemek için yüzey bağlı-inküslenmemiş reseptörleri ifade, bilirubinin fab Anti-IgG (H + L) antikor parçaları ile hücreleri kuluzlar (Bölüm 2,2 kullanılan birincil karşı) şartsız medyada seyreltilmiş ( 20 μg/mL) RT 'de 20 dk. Bu tedavi ikincil antikorlarla gelecekteki etkileşimi önler. Not: Bu örnekte, keçi Anti-tavşan fab parçaları kullanıldı. Not: Kontrol deneyi: yüzeyi ifade eden reseptörlerin tam olarak engellendiğinden emin olmak için, kardeş coverfları fab olmadan ve birlikte inkübe edilebilir. Kültürler fab tedavisinden hemen sonra düzeltilmelidir ve her iki kültür Alexa 555-konjued ikincil antikor ile inkübe edilir. Hiçbir Alexa 555 fab-inkübe hücrelerinde sinyal uygun antikor engelleme gösterir.</li>
		<li>3x hücreleri, Klima ortamıyla yıkayın.</li>
		<li>80 μM dynasore içeren ve daha fazla inküvatör (37 ° c) ' ye geri dönüşlerini önlemek için, ıntereralize reseptörlerin geri dönüşümüne izin vermek üzere hücreler, Dynasore, Dynamin 'i inhibe eden ve bu nedenle ınferalizasyonu engelleyen bir GTPase inhibitörü. Not: 45 MIN NMDAR geri dönüşümü için tavsiye edilir. Dynasore 'un Dynamin 'e bağımlı olan (örneğin, NMDARs) Ancak, diğer sinaptik protein (Dynamin-bağımsız), Disseleştirme hala Dynasore varlığında ortaya çıkabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Geri dönüşümlü reseptörlerin etiketleme
	<ol>
<li>PBS + ile bir kez hücreleri yıkayın.</li>
		<li>PBS 'de% 4 PFA ve% 4 sukroz olan hücreleri 7 – 8 dakika boyunca düzeltin. Dikkat: PFA 'yı ele aldığınızda uygun kişisel koruyucu ekipman ve güvenlik kapağı kullanın.</li>
		<li>Hücreleri 3x PBS ile yıkayın.</li>
		<li>PBS 'de% 10 NGS ile Block, nonspesifik bağlayıcılığı önlemek için 30 dk.</li>
		<li>İlk floresan etiketli ikincil antikor ile etiket hücreleri, RT 'de 1 h için PBS 'de% 3 NGS 'de seyreltilir. Not: Bu örnekte, Alexa 555-Conjugated keçi Anti-tavşan antikor (1:500) etiketleme için kullanıldı.</li>
		<li>Hücreleri 3x PBS ile yıkayın. Not: PBS (5 – 10 dk) ile daha uzun yıkanabilir preparat arka plan azaltmak için yardımcı olabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Interselleştirilmiş reseptörlerin etiketleme
	<ol>
<li>PBS 'de% 0,25 Triton X-100 ile hücreleri 5 – 10 dakika boyunca geçirgen.</li>
		<li>RT 'de 30 dakika boyunca PBS 'de% 10 NGS ile engelle.</li>
		<li>İkinci floresan etiketli ikincil antikor ile etiket, RT 'de 1 h için PBS 'de% 3 NGS 'de seyreltilmiş. Not: Bu örnekte, Alexa 647-Conjugated keçi Anti-tavşan antikor (1:500) etiketleme için kullanıldı.</li>
		<li>Hücreleri 3x PBS ile yıkayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. numunelerin montajı ve görüntülenmesi
<ol><li>Cover kuponları hücre tarafını yavaşça 12 – 15 mL 'ye uygun montaj ortamına yerleştirerek hücreleri bağlayın. Not: Aşırı montaj ortamının aspirasyonu görüntülerin kalitesini artıracaktır.</li>
	<li>Uygun bir Konfokal mikroskop üzerinde görüntü hücreleri. Not: 0,35 μm basamaklarla 60x büyümede z-yığını görüntü için tavsiye edilir, nöronun tüm kalınlığını kapsayan.</li>
</ol>7. zaman hususlar
<ol><li>Bu, çeşitli noktalarda durdurulabilir uzun bir protokoldür. İstenirse, nemli bir odada bir gecede 4 °C ' de engelleme ve primer antikor inkübasyon adımlarını gerçekleştirin.</li>
	<li>
Alternatif olarak, istenirse, büyük ölçüde sonrası sabitleme kuluçlan süreleri hızlandırmak için bir mikrodalga doku işlemci kullanın. Tüm adımlar için, "on" ayarları için 30 °C ' de W 150 kullanın.
	<ol>
<li>Engellemek için 2 dk "açık", 1 dk "kapalı" ve 2 dk "açık" işlemciyi çalıştırın.</li>
		<li>Primer ve ikincil antikor inkübasyon adımları için, 3 dk "açık", 2 dk "kapalı" ve 3 dk "on" işlemci çalıştırın. Not: Biz protokole yukarıdaki değişiklikleri yaparak kalite hiçbir fark gözlemlemek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. görüntü analizi
<ol><li>Birden çok dosya formatı ile uyumlu olduğu için, resim analizi yapmak için FIJI < https:/fıji.SC/> kullanmanız önerilir. Verilerimiz için, Nikon ND2 dosya formatında görüntüler elde edildi.</li>
	<li>FIJI tarafından önceden seçilmiş farklı parametrelerin kolay toplu ölçülmesini sağlamak için bir makro komut dosyası sağlanır. Aşağıdaki adımlar makroda yer alır: Not: Bu örnekler için "entegre yoğunluk" ölçülmüştür.</li>
	<li>FIJI ve ayrı kanallar görüntü dosyalarını açın.</li>
	<li>Z-her kanal yığınını maksimum yoğunluk projeksiyon olarak proje.</li>
	<li>Her kanal için daha düşük bir eşik ayarlayın. Not: Eşikleri her deneysel veri kümesi için ampirik olarak belirlenmelidir. Her kanal ayrı bir alt eşik değerine sahip olsa da, kanal eşik değerlerinin aynı veri kümesinin tüm görüntüleri için tutarlı bir şekilde korunduğu önemlidir.</li>
	<li>Üç ila beş ikincil veya üçüncül dendritler seçin ve ilgi bölgeleri (roıs) olarak kaydedin.</li>
	<li>Yüzey ve hücre içi kanallarda her YG 'nin entegre yoğunluğunu ölçün.</li>
	<li>Yüzey kanalının Tümleşik yoğunluk değerini hücre içi kanalla bölerek her YG için sinyali normalleştirin.</li>
	<li>Tüm kontrol ve deneysel görüntüler için ölçümleri tekrarlayın ve değerleri kontrol etmek için deneysel değerleri normalleştirmek (örn. GluN2B WT veya No-Glycine koşulları).</li>
</ol>

<ol><li>Enns, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+protein+trafficking+in+the+secretory+and+endocytic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways.</a> Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 15, Unit 15 11 (2001).</li>
<li>Bedford, F. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBedford%2C+FK+%22Encyclopedia+of+Neuroscience%22">Encyclopedia of Neuroscience</a>. Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. , Springer Berlin Heidelberg. 3385-3389 (2009).</li>
<li>Diering, G. H., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AMPA+Receptor+Code+of+Synaptic+Plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The AMPA Receptor Code of Synaptic Plasticity.</a> Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).</li>
<li>Lussier, M. P., Sanz-Clemente, A., Roche, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Regulation+of+N-Methyl-d-aspartate+%28NMDA%29+and+alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic+Acid+%28AMPA%29+Receptors+by+Posttranslational+Modifications%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dynamic Regulation of N-Methyl-d-aspartate (NMDA) and alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Acid (AMPA) Receptors by Posttranslational Modifications.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28596-28603 (2015).</li>
<li>Traynelis, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+receptor+ion+channels%3A+structure%2C+regulation%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function.</a> Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).</li>
<li>Molnar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+potentiation+in+cultured+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).</li>
<li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li>
<li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Culture+of+Hippocampal+Neurons+from+P0+Newborn+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (19), (2008).</li>
<li>Lu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+synaptic+NMDA+receptors+induces+membrane+insertion+of+new+AMPA+receptors+and+LTP+in+cultured+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activation of synaptic NMDA receptors induces membrane insertion of new AMPA receptors and LTP in cultured hippocampal neurons.</a> Neuron. 29 (1), 243-254 (2001).</li>
<li>Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+in+NMDA+Receptor+Composition%3A+Many+Regulators%2C+Many+Consequences%5BTitle%5D)+AND+%22The+Neuroscientist%3A+A+Review+Journal+Bringing+Neurobiology%2C+Neurology+and+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Diversity in NMDA Receptor Composition: Many Regulators, Many Consequences.</a> The Neuroscientist: A Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry. 19 (1), 62-75 (2013).</li>
<li>Tham, D. K. L., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+Cell-surface+Expression+and+Endocytic+Rate+of+Proteins+in+Primary+Astrocyte+Cultures+Using+Biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).</li>
<li>Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Synaptic+Plasma+Membrane+and+Postsynaptic+Density+Proteins+Using+a+Discontinuous+Sucrose+Gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51896(2014).</li>
<li>Makino, H., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptor+incorporation+into+synapses+during+LTP%3A+the+role+of+lateral+movement+and+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis.</a> Neuron. 64 (3), 381-390 (2009).</li>
<li>Bailey, D. M., Kovtun, O., Rosenthal, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-Conjugated+Single+Quantum+Dot+Tracking+of+Membrane+Neurotransmitter+Transporters+in+Primary+Neuronal+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Antibody-Conjugated Single Quantum Dot Tracking of Membrane Neurotransmitter Transporters in Primary Neuronal Cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1570, 165-177 (2017).</li>
<li>Trussell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+and+analyzing+synaptic+currents+and+synaptic+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience.+Chapter+6%2C+Unit%22%5BJournal%5D)">Recording and analyzing synaptic currents and synaptic potentials.</a> Current Protocols in Neuroscience. Chapter 6, Unit. , Chapter 6, Unit 6 10 (2001).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Imaging+of+Cortical+Neurons+using+Fura-2+AM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM.</a> Journal of Visualized Experiments. (23), e1067(2009).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Bir hücre ile çevre arasındaki etkileşim (örn. diğer hücrelerle iletişim, farklı uyaranlara yanıt vb.), hücre yüzeyinde reseptörlerin doğru ifadesine ağır dayanır. Yüzeydeki hızlı ve ince ayarlı düzenleme reseptör içeriği sürekli değişen bir ortama uygun hücresel yanıt sağlar. Nöronlar belirli durumda, sayı, yerelleştirme ve synaptically ifade reseptörlerinin alt bileşiminde değişiklikler ağır sinaptik iletişim etkiler, sinaptik plastisite, synaptogenit, ve sinaptik budama3, <sup class...

Hücreler, proteinleri belirli alt hücresel lokalize olarak seferber etmek ve fonksiyonları1üzerinde sıkı bir mekan düzenlemesi yapmak için aktif ticaretini kullanır. Bu süreç özellikle transmembran reseptörleri için önemlidir, farklı çevresel uyaranlara hücresel tepkiler reseptör aktivasyonu ile tetiklenen hücre içi Cascades güveniyor gibi. Hücreler reseptör hücre altı ticareti düzenleme2ile hücre yüzeyinde ifade edilen reseptörlerin yoğunluğu, lokalizasyonu ve alt birim bileşimi değiştirerek bu yanıtları değiştirebilir. Yeni sentezlenmiş reseptörlerin plazma membranı içine yerleştirilmesi, endositoz ve mevcut reseptörlerin geri dönüşümünün yanı sıra yüzey-ifade reseptörlerinin net havuzunu belirleyen kaçakçılık süreçlerine örnektir2. Protein kaçakçılığı düzenleyen birçok Moleküler mekanizma işbirliği, proteinli protein etkileşimleri ve fosforilasyon, ubiquitination gibi posttranslasyonel modifikasyonlar, veya palmitoyasyon2.
Reseptör kaçakçılığının düzenlenmesi özellikle çok özel yapılarla güçlü polarize hücrelerde gereklidir. Paradigmatik örnek glutamat reseptörleri (glurs)3,4düzenlenmiş ticareti ile nöronal fonksiyon kontrolü. Glutamat, ana uyarıcı nörotransmitter, bağlar ve yüzey-ifade GluRs sinaptik nörotransmisyon ve sinaptik plastisite gibi temel fizyolojik nöronal fonksiyonları kontrol etmek için etkinleştirir. Nöro-gelişimsel bozukluklardan nörodejeneratif hastalıklara kadar uzanan geniş bir nöropati yelpazesinde GluR kaçakçılığı değiştirildiği gerçeğini bu sürecin5' in önemini vurgulamaktadır. Böylece, GluR kaçakçılığı kontrol eden moleküler olayların anlaşılması araştırma birçok alanda ilgi olduğunu.
Bu protokolde, primer hipokampal nöronların yüzey seviyesinin ölçülmesi için antikor beslemeli bir yöntem kullanılır, aynı zamanda ınterpralization ve geri dönüşümdeki değişikliklerin gözlenen net yüzey ifadesinde nasıl sonuçlanduğunu değerlendirebilirsiniz. Spesifik mutasyonları kullanan eksojen reseptörlerin farmakolojisinin ve/veya aşırı ifadesinin kullanımı, bu protokol, farklı çevresel uyaranlara nöronal adaptasyon temelindeki moleküler mekanizmaları incelemek için özellikle güçlü bir yaklaşım sağlar. Bu protokolün son örneği, ortamda (örneğin, bir hastalık modelinde), bu tür modellerde yüzey ifadesinin incelenmesi yoluyla GluR kaçakçılığı etkilemesi konusunda ne kadar multifokal değişiklikler yapılacağını okuyor.
Belirli örnekler kullanarak, başlangıçta fizyolojik sinaptik stimülasyon taklit bir farmakolojik manipülasyon nasıl gösterilmiştir [kimyasal LTP (cltp)] AMPA-glurs tipi (ampars) endojen GluA1 altbirim yüzey ifadesi artar 6. NMDA-türü glurs (nmdars) GluN2B altbirim bir aşırı ifade fosho-mimetic formu ticareti de bu protokol belirli posttranslasyonel tarafından Glur kaçakçılığı düzenlenmesi çalışmak için nasıl kullanılabilirler örnek olarak analiz edilir Değişiklik. Bu özel örnekler kullanılsa da, bu protokol diğer GluRs ve diğer reseptörlere ve antijenik hücre dışı alanlara sahip olan proteinler için kolayca uygulanabilir. Hücre dışı alanlar için mevcut antikorlar olmadığı durumda, ekstrelüler epitope etiketli (örn., bayrak-, MYC-, GFP-Tagged, vb.) proteinleri protein etiketlemeye yardımcı olabilir.
Geçerli protokol, spesifik antikorlar kullanarak belirli GluR alt tipi yoğunluğunu ve kaçakçılığı ölçmek için yönergeler sağlar. Bu protokol 1) Toplam GluR yüzey ifadesi, 2) GluR etilleştirme ve 3) GluR geri dönüşümü için kullanılabilir. Her bir işlemi bireysel olarak incelemek için 1 ve 2 bölümlerle başlamak ve 3, 4 veya 5 bölümüne devam etmeniz önerilir. Her durumda, 6 ve 8 bölümlerle bitir (Şekil 1).

<table><tbody><tr><td>18 mm çap # 1.5 kalın gözlük</td><td>Neuvitro</td><td>GG181.5</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555 konjuge keçi anti-fare ikincil</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A21424</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555 konjuge keçi anti-tavşan ikincil</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A21429</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 647-konjuge keçi anti-fare ikincil</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A21236</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 647-konjuge keçi anti-tavşan ikincil</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A21245</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Düz Tabanlı Hücre Kültürü Plakaları</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Dynasore</td><td>Tocris</td><td>2897</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Tocris</td><td>0219</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan Fab parçaları</td><td>Sigma</td><td>SAB3700970</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti-GluA1 antikoru</td><td>Millipore</td><td>MAB2263</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S6546</td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal Medya</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NGS</td><td>Abcam</td><td>Ab7481</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM999</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pelco BioWave</td><td>Ted Pella</td><td>36500</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Alfa Aesar</td><td>43368</td><td></td></tr><tr><td>Pikrotoksin</td><td>Tocris</td><td>1128</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizin hidrobromür</td><td>Sigma</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Altın Antifade Mountant</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-GFP antikoru</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-PSD-95 antikoru</td><td>Hücre Sinyali</td><td>2507</td><td></td></tr><tr><td>Striknin</td><td>Tocris</td><td>2785</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus mikroskop slaytları</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Tocris</td><td>1078</td><td></td></tr></tbody></table>

disanated primer hipokampal kültürlerde glutamat reseptör kaçakçılığı çalışması için antikor beslenme yaklaşımı

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

Harici uyaranlara hücresel tepkiler ağır belirli bir anda hücre yüzeyinde ifade reseptörleri kümesine güveniyor. Buna göre, yüzey tarafından ifade edilen reseptörlerin nüfusu sürekli uyarlama ve sıkı düzenleme mekanizmalarına tabidir. Paradigma örneği ve biyolojideki en çok araştırılan kaçakçılık olaylarından biri de glutamat reseptörlerinin (GluRs) sinaptik ifadesinin denetlendiği kontrolidir. GluRs, sinaptik ve nöronal düzeylerde (örneğin, sinaptik plastisite), merkezi sinir sisteminde uyarıcı nörotransmisyon büyük çoğunluğu arabulucu ve fizyolojik aktivite bağımlı fonksiyonel ve yapısal değişiklikler kontrol. Yüzeydeki sayı, konum ve alt birim bileşiminde yapılan değişiklikler, GluRs 'un nöronal fonksiyonları derinden etkilediğini ve aslında bu faktörlerde yapılan değişiklikler farklı nöropati ile ilişkilidir. Burada sunulan, disanated hipokampal primer nöronlar GluR ticareti incelemek için bir yöntemdir. "Antikor-besleme" yaklaşımı, yüzey ve iç membranlarda ifade edilen GluR nüfusunun farklılaşarak görselleştirilmesi için kullanılır. Yüzey reseptörlerini canlı hücrelerde etiketleme ve reseptörlere endositoz ve/veya geri dönüşüm için izin vermek için farklı zamanlarda sabitleme, bu kaçakçılık süreçleri değerlendirilebilir ve seçici olarak incelenebilir. Bu, GluR kaçakçılığı etkileyen uyarıcı ve moleküler mekanizmalar hakkında değerli bilgiler elde etmek için değiştirilmiş reseptörlerin farmakolojik yaklaşımlar veya aşırı ifade edilmesi ile birlikte kullanılabilecek çok yönlü bir protokoldür. Benzer şekilde, diğer reseptörleri veya yüzey ifade proteinleri çalışmak için kolayca adapte edilebilir.

Glutamat reseptör kaçakçılığı incelemek için bu protokol hücre yüzeyinde ifade reseptörleri diferansiyel etiketleme dayanmaktadır ve bu iç membranlarda ifade. Ayrım önce ve membran geçirmezlik sonra reseptörleri etiketleme tarafından elde edilir, aynı primer antikor ancak farklı bir fluorophore konjuate ikincil bir antikor kullanarak. Protokol dahil isteğe bağlı adımlarla özetlendiği gibi, bu, farklı reseptör kaçakçılığı süreçleri sorgulamak için çok yönlü bir yöntemdir, gibi idarlaştırma...

Bu makalede, ayrılmış primer hipokampal kültürlerde glutamat reseptörü (GluR) kaçakçılığı çalışması için bir yöntem sunulur. Endojen veya aşırı ifade reseptörlerinin farmakolojik yaklaşımlar ile birlikte etiketlenmesi için antikor beslemeli bir yaklaşım kullanarak, bu yöntem, GluR yüzey ifadesini düzenleyen moleküler mekanizmaların belirlenmesi için izin verir veya geri dönüşüm süreçleri.

Disanated primer hipokampal kültürlerde glutamat reseptör kaçakçılığı çalışması için antikor beslenme yaklaşımı

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Dış uyaranlara hücresel tepkiler ağır belirli bir anda hücre yüzeyinde ifade edilen proteinlerin kümesine bağlıdır. Buna göre, bu proteinlerin sayısı, alt hücresel lokalizasyonu ve alt birim bileşimi dinamik olarak kontrol edilir. Burada, hücre kültürlerinde ifade edilen reseptörlerin seviyesini ölçmek için bir antikor besleme yaklaşımı kullanacağız, sürece içselleştirme ve geri dönüşüm devam eder.Bu çok yönlü bir protokoldür, yüzey ifade proteinlerin düzenlenmesi mekanik bilgi sağlar. Örneğimizde, primer hipokampal nöronlarda glutamin reseptörlerini inceeceğiz. Bu protokol, anajenik ekstrasellüler epitopa sahip herhangi bir proteine uyarlanabilir, eğer antikorlar yoksa, etiketli yapıların transveksiyonu hem etiketleme hem de spesifik mutasyonların incelenmesi için yararlı olabilir.Örneklerimizde, endojen GluA1'e karşı antikorlar kullanıyoruz ve bu prosedürü B.To glu12 etiketli, kapak pilini parafin film kaplı tepsiye aktarıyoruz, reaktifleri kurtarıyoruz ve manipülasyonu kolaylaştırıyoruz. Kuluçka ve yıkama adımları için 37 santigrat derecede koşullandırılmış ortam kaydedin ve bakımını koruyun. Hücreleri, şartlı ortamda, oda sıcaklığında seyreltilmiş birincil antikorlarla 15 dakika kuluçkaya yatırın.Bundan sonra, ortam içeren antikorları dikkatlice aspire etmek için bir vakum pipet kullanın ve hücreleri şartlı ortamla üç kez yıkayın. Eğer yüzey ve hücre içi reseptör ekspresyonu inceleniyorsa, metin protokolünde belirtildiği gibi, bu adımdan sonra hücreleri paraformaldehit ile düzeltin. Hücreleri antikorsuz koşullu ortamda koruyun ve içselleştirmeye olanak sağlamak için 37 derecede kuvöze geri verin.İçselleştirme işlemini inceliyorsanız, metin protokolünde belirtildiği gibi, bu adımdan sonra hücreleri paraformaldehit ile düzeltin. Yüzeye bağlı birincil antikor üzerinde epitops bloke etmek için içselleştirilmemiş reseptörleri ifade reseptörleri ifade, konjuge edilmemiş Fab anti-IgG antikor parçaları ile inkübat hücreleri şartlı ortamda seyreltilmiş, oda sıcaklığında 20 dakika. Bundan sonra hücreleri şartlı ortamla üç kez yıkayın.İçselleştirilmiş reseptörlerin geri dönüştürülmesine olanak sağlamak için yıkanmış kuyuları 37 derecede 80 mikromolar Dinamo içeren klimalı ortamla inkübe edin. Canlı hücrelerdeki modifikasyonları tamamladıktan sonra hücreleri pbs artı ile bir kez yıkayın. Hücrelere PBS'de %4 paraformaldehit ve %4 sakaroz çözeltisi ekleyin ve hücreleri düzeltmek için oda sıcaklığında yedi ila sekiz dakika boyunca bir duman kaputunda kuluçkaya yatırın.Sonra hücreleri normal PBS ile üç kez yıkayın. PBS'deki %10 Normal Keçi Serumu çözeltisini hücrelere ekleyin ve spesifik olmayan bağlama bölgelerini engellemek için oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, primer antikor etiket reseptörlerini etiketlemek için, oda sıcaklığında PBS'de %3 NGS'de seyreltilmiş floresan etiketli ikincil antikorlu hücreleri bir saat boyunca kuluçkaya yatırın.Bundan sonra hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Hücre içi reseptörleri etiketlemeye başlamak için, PBS'de %0.25 TritonX çözeltisi ekleyin ve hücreleri permeabilize etmek için 5 ila 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Sonra 30 dakika oda sıcaklığında% 10 NGS ile blok.Yüzey ve total üzerinde çalışıyorsanız, hücre içi reseptörleri etiketlemek için, pbs%3 NGS ile seyreltilmiş, bir saat oda sıcaklığında, daha önce kullanılan aynı birincil antikor ile hücreleri kuluçka. Daha sonra hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. PBS'de %3 NGS'de seyreltilmiş ikinci floresan etiketli ikincil antikorlu etiket, oda sıcaklığında bir saat süreyle.Bundan sonra pbs ile hücreleri üç kez yıkayın. Önce kapak fişleri yavaşça yerleştirin, hücre tarafı aşağı, hücreleri monte etmek için uygun montaj ortamının 12 ila 15 mikrolitre. Daha sonra hücreleri uygun konfokal mikroskopta görüntüleyin ve metin protokolünde belirtildiği gibi hücreleri analiz edin.Glutamat reseptör ticaretini inceleyen bu protokol, hücre yüzeyinde ifade edilen reseptörlerin ve iç zarlarda ifade edilen lerin diferansiyel etiketlemesine dayanmaktadır. Konfokal görüntüleri elde ettikten sonra, floresan sinyal kolayca yüzey ekspresyonunda bir artış göstermek için ölçülebilir, hücre içi nüfusa göre, kimyasal LTP aşağıdaki. Plazma zarının bütünlüğünü gösteren, permeabilize olmayan hücrelerde PSD-95 için sinyal alınamaz.Bu, glua1 yüzeyi için elde edilen sinyalin gerçekten yüzey ifade reseptörlerine karşılık geldiğini gösterir. Daha da önemlisi, içselleştirilmiş GluA1 için minimum sinyal, tüm yüzey epitoplarının antikor etiketlemenin ilk turu tarafından işgal edilmiş olduğunu gösteren, permeabilizasyon olmayan koşullar altında gözlemlenebilir. Daha sonra içselleştirilmiş reseptörler tanımlanır.Bu örnek, S1480'deki GluN2B fosforilasyonun reseptör içselleşmesini desteklediğini vurgulamaktadır. Fosfomimetik mutant S1480E yabani tip reseptörlere göre çok daha yüksek bir içselleştirme oranı gösterdi. Beklendiği gibi, kontrolde içselleştirilmiş reseptörler için sinyal elde edilir.Daha sonra, geri dönüşümlü reseptörler ve içselleştirilmiş reseptörler tanımlanır. Oluşturulan geri dönüşüm oranı, GluN2B S1480E'nin NMDAR geri dönüşümü üzerinde hiçbir etkisi olmadığını göstermektedir. Kontrolde, Fab engelleme yokluğunda glun2B ifade yüzey için güçlü bir sinyal görülebilir.Bu sinyal Fab-tedavi kültürlerde kaybolur, engelleme protokolü tamamen yüzey imal epitopsblok için yeterli olduğunu gösteren, ve geri dönüşüm den sonra gözlenen yüzey sinyalleri gerçekten plazma membran geri ticareti reseptörlerine karşılık gelir. Mevcut protokol, yüzeyifade edilen proteinlerin düzenlenmesini incelemek için kullanılan yöntemlerden sadece biridir. Burada elde edilen verileri genişletmek veya doğrulamak için başka yaklaşımlar da alınabilir.Biyosonyum, yaşam görüntüleme teknikleri veya elektrofizyoloji veya kalsiyum görüntüleme gibi fonksiyonel yaklaşımlar gibi biyokimyasal yöntemler bunlardır. Biz reseptörlerin lokalizasyondondurmak için PFA kullanın, Ancak PFA bilinen bir karsinojen, bu yüzden uygun PPE giyerken, bir duman başlık altında PFA kullanarak adımları gerçekleştirmek için çok önemlidir.

an-antibody-feeding-approach-to-study-glutamate-receptor-trafficking

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, primer hipokampal nöronal kültürlerde glutamat reseptörlerinin kaçakçılığını incelemek için bir antikor besleme yaklaşımını göstermektedir. Bu yaklaşım, hem plazma hem de iç zarlardaki reseptör popülasyonlarının gözlemlenmesine izin verir. Bu alt kümeler arasındaki ayrım, membran geçirgenliğinden önce ve sonra reseptörlerin etiketlenmesiyle, aynı birincil antikorun kullanılması, ancak farklı floroforlara konjuge edilmiş ikincil antikorların kullanılmasıyla elde edilir.

Hipokampal Nöronlarda Glutamat Reseptör Kaçakçılığını İncelemek İçin İn Vitro Bir Teknik

Bir özel poliklonal antikor, hücre dışı epitopuna kullanarak canlı nöronlar yüzeyinde proteini etiket için bir yöntem tarif eder. Hücre yüzeyi üzerinde antikor tarafından bağlanan ve daha sonra endositoz üzerinden içsel protein Protein kalan ayırt veya inkübasyon sırasında yüzeye, kaçırılan edilebilir.

Canlı Kültür Nöronlar Antikor Besleme sonra Hücre-yüzey ve İçselleştirilmiş Proteinlerin Diferansiyel Etiketleme

Burada GABA hipokampal nöronlar bir reseptör yüzey lokalizasyonu ve, endositoz ölçmek için α-bungarotoksin bağlanmış flüoresan Alexa boya kullanımını göstermektedir. Α-bungarotoksin, plazma zar proteini endositik ticaretinin analiz elde edilebilir bağlanan kısa bir hücre dışı bir etiket taşıyan konstruktların kullanımı yoluyla.

GABA A reseptör Membran Yerelleşme ve Ticareti Eğitim için bir α-bungarotoksin Bağlama Sitesi Tag Kullanımı

Ontojenliği sırasında inhibitör GABA'erjik sinaps oluşumunu koordine moleküler mekanizmalar tam olarak bilinmemektedir. Bu işlemleri incelemek için, fonksiyonel GABA A reseptörleri eksprese eden stabil olarak transfekte edilmiş insan embriyonik böbrek 293 (HEK293) hücreleri ile birlikte kültürlendi embriyonik orta spinal GABAerjik nöronlar içeren bir ko-kültürü modeli sistemini geliştirdik.

Co-kültür Model Birleşmeyle GABA'erjik Orta Spiny Nöronlar ve HEK293 Hücreler inhibitör Synapse Oluşumu istikrarlı bir şekilde GABA ifade A Reseptörler

Primer hipokampal nöronların düşük yoğunluklu kültürleri, nörotrofik faktörleri sağlamak ve uzun ömürlülüğü sürdürmek için genellikle glia besleyici tabakaya ihtiyaç duyar. Burada, spesifik nöronal-otonom mekanizmaların araştırılmasını kolaylaştıran yüksek yoğunluklu bir nöronal besleyici tabakanın varlığında cam lameller üzerinde ultra düşük yoğunluklu nöronları kültürlemek için basitleştirilmiş bir yöntemi açıklıyoruz.

Ultra Düşük Yoğunluk için Basitleştirilmiş Bir Yöntem, Uzun Vadeli İlköğretim Hipokampal Nöron Kültürü

Bu makale, nörotransmitter reseptörlerinin ekspresyonunun nasıl ölçülebileceğini ve optogenetik araçların viral transdüksiyonu ve donma-kırık replika immünoetiketleme tekniğinin bir kombinasyonu kullanılarak tanımlanmış presinaptik ve postsinaptik elementlerle sinapslarda analiz edilen modeli göstermektedir.

Optogenetic ve donma-fraktür çoğaltma ile immün Fare amigdalada glutamat reseptörlerinin giriş-özel bir düzenleme incelemek için bir araya

Burada, tonik ve enzim-bağlı mikroelektrot dizileri (MEA) kullanılarak in vivo olarak fazik hücre dışı glutamat değişiklikleri ölçmek için bir uzamsal ve zamansal hassas bir yöntem için kurulum, yazılım navigasyon ve veri analizi tarif eder.

Enzim bazlı biyosensörlerin kullanılması Alzheimer Fare Modellerinde Tonik ve Fazik glutamat Ölçmek için

NMDA reseptörleri (NMDAR) çalışma daha büyük ölçekli, kolaylaştırmak ve küçük moleküller düzenleyici etkileri muayene ve tedavi uygulamaları izin vermek için bu iletişim kuralını hedefidir.

NMDA reseptörleri glisin/D-serin ve glutamat duyarlılık ile çalışmak için bir yüksek-den geçerek kalsiyum-flux tahlil

Nöronal uyarılabilirlik endo-dinamik bir süreçtir ve ekzositozu eksitatör ionotropic glutamat reseptörlerinin modülasyonlu. Burada açıklanan yüzey ve iç reseptör nüfus havuzları miktarının için erişilebilir, yüksek içerikli bir tahlil olduğunu.

AMPA izlemek için bir yüksek-içerik tahlil reseptör ticareti

Otoimmün ensefalit, merkezi sinir sisteminin antikor aracılı hastalıklarının yeni bir kategorisidir. Hipokampal nöronlar bu antikorları keşfetmek ve karakterize etmek için kullanılabilir. Bu makalede, hastaların serum ve beyin omurilik sıvısındaki otoantikorları belirlemek için primer hücre kültürü ve immün boyama için bir protokol sunulmaktadır.

Otoimmün Ensefalitte Yer Alan Yeni Patojenik Antikorları Tespit Etmek ve İncelemek için Hipokampal Nöronal Kültürler

Öğrenin, antikor besleme yöntemiyle primer hipokampal nöron kültürlerinde glutamat reseptör kaçakçılığını nasıl analiz edeceğinizi. Bu protokol, yüzey ifadesi ve içselleştirme mekanizmalarını incelemek için değerlidir.

Disanated primer hipokampal kültürlerde glutamat reseptör kaçakçılığı çalışması için antikor beslenme yaklaşımı

Daha fazla video keşfet